Submitted by ANA CERREJÓN PALANCO null (anacerrejon@live.com) on 2016-09-29T21:40:59Z No. of bitstreams: 1 Mestrado-Ana-Cerrejón-Palanco.pdf: 2202083 bytes, checksum: 3d49fc49aae6a457cad301dea9e43240 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-10-04T19:11:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carrejonpalanco_a_me_arafcf.pdf: 2202083 bytes, checksum: 3d49fc49aae6a457cad301dea9e43240 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T19:11:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carrejonpalanco_a_me_arafcf.pdf: 2202083 bytes, checksum: 3d49fc49aae6a457cad301dea9e43240 (MD5) Previous issue date: 2016-09-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica e oportunista, causada pelas leveduras capsuladas das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, afetando tanto pacientes imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Uma propriedade importante do gênero Cryptococcus é a capacidade de formação de biofilmes. A resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos traz a necessidade da busca de novas terapias. Desta forma, o nosso grupo vem trabalhando com moléculas antifúngicas derivadas de fontes naturais, como as chalconas, onde foi verificado que C. neoformans é sensível a algumas destas moléculas. Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a 3’- chalcona como antifúngico contra C. gattii em situação planctônica e biofilme, como também a eficiência e toxicidade em modelos animais alternativos como Danio rerio (Zebrafish) e Galleria mellonella, propondo uma nova alternativa para o tratamento. In vitro, os resultados para a forma planctônica do fungo mostraram que a 3’- chalcona foi mais eficaz para a cepa 118, com concentração inibitória mínima (CIM) de 0,96 µg/mL e para a cepa 56990 de C. gattii, a molécula mostrou ação potente com CIM entre 1,95 e 3,90 µg/mL. No ensaio de formação do biofilme com as duas cepas, observou-se uma atividade metabólica crescente até 72 horas e uma biomassa e matriz extracelular que alcançou seu máximo nas 48 horas. Em seguida, foi feita a avaliação da atividade da 3’- chalcona contra a formação do biofilme maduro após 48 horas, apresentando uma inibição a uma concentração de 62,5 µg/mL para cepa ATCC e de 31,2 µg/mL frente ao isolado 118. Também foi avaliado o crescimento do biofilme frente à anfotericina B (AmB), obtendo como resultado, inibição em todas as concentrações por parte das duas cepas e, frente ao fluconazol, apresentaram-se resistentes. In vivo, os resultados de toxicidade em embriões de Zebrafish revelaram uma concentração letal 50% (CL50) de 3,42±0,6 µg/mL em 48 horas pós-fertilização (hpf). No modelo G. mellonella as doses testadas de 3’- chalcona (2 a 160 mg/Kg) não foram tóxicas. Entretanto, nas larvas infectadas com as duas cepas de C. gattii, a molécula não apresentou eficácia antifúngica. Assim, considerando o potencial antifúngico in vitro, inclusive contra o biofilme de C. gattii, a 3’- chalcona pode passar por modificações moleculares que aumentem sua distribuição e eficácia in vivo. / Criptococose is a fungal, systemic and opportunistic infection mainly caused by capsulated yeast of the species Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, affecting immunocompetent and immunocompromised patients. An important property of the genus Cryptococcus is the biofilm formation, which can be considered a virulence factor and resistance. The resistance of biofilms to antifungal agents brings the need to search new therapies. Thus, our group has been working with antifungal molecules derived from natural sources such as chalcones, where it was found that C. neoformans is sensitive to some of these molecules. For this fact, the objective of this study was to test the 3'- chalcone as antifungal against C. gattii in planktonic and biofilm forms, as well as efficiency and toxicity in alternative animal models like Danio rerio (Zebrafish) and Galleria mellonella, proposing a new alternative for treatment. In vitro, the results for the planktonic form of the fungus showed that the 3'- chalcone was more effective for the 118 strain, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.96 µg/mL. For the strain 56990 of C. gattii the molecule showed potent activity with MIC values between 1.95 and 3.90 µg/mL. Biofilm formation assay for both strains had an increased metabolic activity within 72 hours and a biomass and extracellular matrix which reached its maximum in 48 hours. Then, the evaluation of the activity of the 3'-chalcone against the formation of mature biofilm was made after 48 hours, showing inhibition at a concentration of 62.5 µg/mL for ATCC strain and 31.2 µg/mL against the isolated 118. Also, the growth of biofilm against to amphotericin B (AmB) was evaluated, obtained as a result of inhibition at all concentrations for the two strains and against fluconazole were resistant. In vivo, the results of toxicity in zebrafish embryos revealed a lethal concentration 50% (LC50) of 3.42 ± 0.6 µg/mL at 48 hours post-fertilization (hpf). In the model G. mellonella tested doses of 3’- chalcona (2 to 160 mg/kg) were not toxic. However, in larvae infected with the two strains of C. gattii, the molecule did not show efficacy of antifungal agents. Thus, considering the potential antifungal in vitro, including against biofilms of C. gattii, 3'- chalcone can experiment molecular changes that increase their distribution and efficacy in vivo.

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 503890 bytes, checksum: 99e21ac9bda74afe0bcd03f4094569ee (MD5) Previous issue date: 2010-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The literature has several studies showing the anti-inflammatory and protective against cardiovascular disease, the polyunsaturated fatty acids are omega-3 intake of fatty acids has been recommended as a way to prevent heart disease and improve heart function. There are few studies involving the anti-inflammatory effect of fatty acids omega-3, with the inflammatory process triggered by physical stress of great magnitude. The effect of supplementation of polyunsaturated fatty acids (PUFA) omega-3 (n-3) in the immune response and occurrence of muscle damage in soldiers were investigated. Twenty males were divided in two groups and they received capsules contends PUFA n-3 (SUP) (n=10) or placebo (PLA) (n=10) during four weeks. in elapsing of the fourth week of supplementation, the military were submitted to a military camp with caloric ingestion and restricted rest, and elevated physical and psychological stress. The concentration of C-reactive protein (CRP-hs) was used as inflammatory marker and the occurrence of muscle damage by creatine kinase s (CK) activity. Sanguine samples were taken in four moments: 1) before supplementation; 2) before camp; 3) during camp; 4) after camp. During the three weeks of supplementation that preceded the camp s routine, was observed a significant reduction in serum CRP-hs s concentration only in group SUP. A significant increase of CK activity in the after camp, confirmed the character strenuous of this procedure. In spite of not impeding the PCR-us s increase, SUP presented a concentration of PCR-hs significantly smaller than PLA at the end of camp. These results suggest that PUFA n-3 supplementation exercises a protecting effect against the inflammatory process induced by intense physical training and alimentary restriction / A literatura dispõe de vários estudos que comprovam o efeito antiinflamatório e protetor contra doenças cardiovasculares, que os ácidos graxos poliinsaturados Ômega-3 possuem A ingestão destes ácidos graxos tem sido recomendada, como forma de prevenir doenças cardíacas e melhorar a função cardíaca. Existem poucas pesquisas associando o efeito antiinflamatório dos ácidos graxos Ômega-3, com o processo inflamatório desencadeado pelo estresse físico de grande magnitude. O efeito da suplementação de ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) omega-3 (n-3) na resposta imunológica e ocorrência de dano muscular em militares foi investigado. Vinte sujeitos foram divididos em dois grupos e receberam cápsulas contendo AGPI n-3 (SUP) (n=10) ou placebo (PLA) (n=10) durante quatro semanas. No decorrer da quarta semana de suplementação, os militares foram submetidos a um acampamento militar com ingestão calórica e repouso restrito e elevado estresse físico e psicológico. A concentração de proteína C-reativa ultra-sensível (PCR-us) foi utilizada como marcador inflamatório e a ocorrência de dano muscular pela atividade da enzima creatinoquinase (CK). Amostras sanguineas foram coletadas em quatro momentos: 1) présuplementação; 2) pré-acampamento; 3) durante o acampamento; 4) pós-acampamento. Durante as três semanas de suplementação e que antecederam o regime de acampamento foi observada uma redução significativa na concentração sérica de PCR-us apenas no grupo SUP. Um aumento significativo da atividade da CK no pós-acampamento confirmou o caráter extenuante deste procedimento. Apesar de não impedir a elevação da PCR-us, o grupo SUP apresentou uma concentração de PCR-us significativamente menor em comparação com o grupo PLA ao final do acampamento. Estes resultados sugerem que a suplementação de AGPI n-3 exercem um efeito protetor contra o processo inflamatório induzido por um regime de treinamento físico intenso e restrição alimentar.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467311-Texto+Completo-0.pdf: 4096903 bytes, checksum: 8643a895a0704f20c9d1b6b34ae53cfd (MD5) Previous issue date: 2014 / Introduction: Quantitative changes in the consumption of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) of the omega-3 family have drawn considerable attention, both for the benefits related to its ingestion, as for the damages attributed to its poor consumption. Consumption of these fatty acids is beneficial in the prevention and treatment of many inflammatory and respiratory illnesses. In addition to the dietary pattern, smoking may also directly interfere in the serum levels of these substances, given that smoking can affect the synthesis and metabolism of fatty acids.Objective: To study the relationship between polyunsaturated fatty acids of the omega-3 family and smoking.Methods: In a controlled cross-sectional study, we included smokers (group I) and non-smokers (group II). The participants of group I were recruited at the Smoking Cessation Outpatient Clinic - Toronto Western Hospital and at Smoking Cessation Outpatient Clinic - Centre for Addiction and Mental Health, both in Toronto, Canada. Group II volunteers were recruited from non-smoking hospital staff. The group I participants were included after their first medical appointment, before possible changes in their smoking habits and completed a specific questionnaire with demographic data and lifestyle habits. All smoking patients were submitted to the Fagerstrom Questionnaire for Nicotine Dependence. A blood sample was taken in order to assess the serum level of polyunsaturated fatty acids of all participants.Results: One hundred participants were included, 50 non-smokers and 50 smokers. Monthly fish intake was significantly different between smokers 430 grams (0 - 2150) and non-smokers (800 grams; 0-7740) (P<0. 001). The blood level of PUFAs also showed a significant difference in DHA, being 4. 13% (2. 33-7. 73) and 4. 81% (2. 79-10. 21), P=0. 002 among smokers and non-smokers, respectively.Conclusion: In this study, smokers consumed a significantly less fish (omega-3), when compared to non-smokers. Smokers also had lower levels of DHA serum than non-smokers. / Introdução: Os compostos lipídicos, especialmente os ácidos graxos, são componentes que estão presentes em diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura das membranas celulares e nos processos metabólicos. Em humanos, existem alguns ácidos graxos necessários para a manutenção da função cerebral e transmissão de impulsos nervosos. São os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), pertencentes às famílias ômega-3. Alterações quantitativas na dieta, em relação ao consumo de PUFAs da família ômega-3 têm chamado bastante atenção tanto para os benefícios causados por sua ingestão quanto aos danos atribuídos ao seu baixo consumo. O consumo destes ácidos graxos pode ser útil também na prevenção e tratamento da inflamação e doenças respiratórias, nas quais a inflamação crônica desempenha papel significativo. Além disso, o baixo consumo de ômega-3 também tem sido relacionado ao tabagismo.Assim como o padrão alimentar, o fumo também pode interferir diretamente nos níveis sanguíneos dessas substâncias, já que o tabagismo pode afetar a síntese e o metabolismo dos ácidos graxos. Desse modo, faz-se importante explorar e compreender os mecanismos desta relação.Objetivo: Estudar a relação dos ácidos graxos poli-insaturados da família ômega-3 com o tabagismo.Métodos: Em delineamento de estudo transversal controlado, foram incluídos pacientes tabagistas (n=50) e não tabagistas (n=50). Os participantes do grupo I foram recrutados através do Serviço de abandono ao Tabagismo do Toronto Western Hospital e do Centre for Addiction and Mental Health – Toronto/Canadá. Esses participantes foram incluídos logo após a primeira consulta médica, quando ainda não tinham realizado modificações no hábito de fumar. O grupo II foi composto por voluntários não fumantes. Todos os participantes completaram o questionário específico para obtenção de dados demográficos e informações sobre seus hábitos de vida. Os pacientes tabagistas responderam também ao Questionário de Fagerstrom para Dependência Nicotínica. Foi coletada amostra de sangue para avaliação do nível sérico de ácidos graxos poli-insaturados.Resultados: Foram incluídos 100 participantes, sendo 50 não tabagistas e 50 tabagistas. Com relação ao consumo alimentar, a ingestão de peixe apresentou diferença significativa entre fumantes e não fumantes. Os não fumantes apresentaram mediana de consumo mensal de 800 (0 – 7740) gramas de peixe, enquanto fumantes consumiam 430 (0 – 2150) gramas por mês (P= ˂0,001). Em relação aos níveis séricos dos PUFAS, houve diferença significativa para o DHA (22:6, n-3), tendo sido nos fumantes de 4,13% (2,33 – 7,73), significativamente menor que a do grupo de não fumantes 4,81% (2,79 – 10,21) , P=0,002.Conclusão: Fumantes consomem significativamente menos peixe (ômega-3), quando comparados a não fumantes. Fumantes apresentam níveis séricos de DHA mais baixos do que não fumantes.

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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-16T19:31:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 36 kDa e pI 6.8 e mostraram homologia com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) de diversos organismos. O cDNA completo e o gene que codificam para PbGAPDH foram obtidos e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 338 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbGAPDH nativa. O gene Pbgapdh contém 5 exons interrompidos por 4 introns. Análises realizadas com a PbGAPDH deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciaram a correlação entre a filogenia e as posições dos introns nos genes cognatos. A expressão de Pbgapdh foi analisada e uma única espécie de mRNA de 2.0 Kb, preferencialmente expressa na fase leveduriforme de P. brasiliensis foi detectada em concordância com os altos níveis de expressão da proteína. A proteína recombinante GAPDH foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia imunoeletrônica e análises por Western blot, foi detectada a presença da GAPDH, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A GAPDH recombinante foi capaz de se ligar a fibronectina, laminina e colágeno do tipo I. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensis com anticorpo anti-GAPDH, quanto de pneumócitos tratados com a GAPDH recombinante, promoveram a inibição da aderência e internalização de P. brasiliensis à células cultivadas in vitro (pneumócitos). Essas observações indicam que a GAPDH possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causing paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensis was isolated from gel after two dimensional electrophoresis and characterized. Endoproteinase Lys-C-digest peptides of the purified protein, which presented a molecular mass of 36 kDa and pI 6.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbGAPDH were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 338 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbGAPDH. The Pbgapdh gene contained 5 exons interrupted by 4 introns. Analysis performed with the deduced PbGAPDH suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The expression of Pbgapdh was analyzed and a single species of mRNA, of 2.0 Kb, preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis, was detected in agreement to the high levels of the GAPDH expression in the yeast cells of P. brasiliensis. The purified recombinant GAPDH was used to produce policlonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, GAPDH was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The recombinant GAPDH was found to bind to fibronectin, laminin, and type I collagen in ligand far-Western blot assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensis yeast cells with anti-GAPDH polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensis to those in vitro cultured cells. These observations indicate that GAPDH could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection.

Plectranthus grandis (Cramer) Willense, à uma planta medicinal conhecida popularmente no Cearà como boldo-grande, utilizada pela populaÃÃo em substituiÃÃo a P. barbatus (boldo), que apresenta atividade gastroprotetora jà comprovada para a planta e para alguns diterpenos isolados, validando cientificamente desta forma seu uso popular. Este trabalho descreve os procedimentos analÃticos utilizados e resultados obtidos, visando contribuir para a padronizaÃÃo quÃmica de quatro espÃcies de Plectranthus. Os diterpenos barbatusina e 3&#946;-hidroxi-3-desoxibarbatusina foram isolados atravÃs de tÃcnicas cromatogrÃficas, sendo possÃvel desenvolver um mÃtodo de extraÃÃo seletiva para a barbatusina, o que possibilitou obter quantidade significativa desta substÃncia. Foram realizadas reaÃÃes de derivatizaÃÃo, obtendo-se a 3-hidroxi-3-desoxibarbatusina, que possui atividade gastroprotetora, in vivo, jà reportada na literatura, e a oxima da barbatusina, inÃdita na literatura, com atividade citotÃxica mais potente do que sua precursora. As elucidaÃÃes estruturais foram realizadas atravÃs de espectroscopia na regiÃo do infravermelho, RMN 1H e RMN 13C, em comparaÃÃo com dados da literatura. Utilizando CLAE-DAD desenvolveu-se mÃtodos para a quantificaÃÃo de barbatusina e 3&#946;-hidroxi-3-desoxibarbatusina, em que foram encontrados parÃmetros adequados de linearidade (r2 > 0,99), para as duas substÃncias analisadas. O mÃtodo foi validado e apresentou linearidade (r2 = 0,9931 para a barbatusina e r2 = 0,9966 para a 3&#946;-hidroxi-3-desoxibarbatusina), seletividade, precisÃo intra-dia (DPR < 2,8% para a barbatusina e DPR < 3,5% para a 3&#946;-hidroxi-3-desoxibarbatusina), exatidÃo (recuperaÃÃo entre 81,7% e 115,1%). Os mÃtodos entÃo desenvolvidos foram aplicados aos extratos das folhas de P grandis, P. barbatus, P. amboinicus, P. ornatus. O potencial larvicida e citotÃxico das quatro espÃcies de Plectranthus foram avaliados, bem como dos compostos puros, apresentando promissora atividade citotÃxica para trÃs linhagens de cÃlulas tumorais. / Plectranthus grandis (Cramer) Willense is a medicinal plant popularly known in Cearà as boldo-grande, used by population in substitution of P. barbatus (boldo), it shows gastroprotective activity already proven for herb and for some isolated diterpenes, scientifically validating this way its popular use. This work describes the analytical procedures used and obtained results, aiming to contribute to chemical standardization of four Plectranthus species. Barbatusin and 3&#946;-hydroxy-3-deoxobarbatusin diterpenes were isolated by chromatographic techniques, being possible to develop selective extration method of barbatusin, which enabled to obtain significant amount of this substance. Derivatization reactions were performed, getting 3-hydroxy-3-deoxobarbatusin, having gastroprotective activity, in vivo, already reported in the literature, and oxyimine product of barbatusin, unpublished in the literature, with cytotoxic activity more potent than its precursor. Estrutural elucidation were performed by infra-red spectroscopy, NMR 1H and NMR 13C, compared with literature data. Using HPLC-DAD, methods were developed for quantification of barbatusin and 3&#946;-hydroxy-3-deoxobarbatusin, in wich suitable parameters have been found of linearty (r2 > 0,99), for both analytes. The method was validated and presented linearty (r2 = 0,9931 for barbatusin and r2 = 0,9966 for 3&#946;-hydroxy-3-deoxobarbatusin), selectivity, within-day precision (RSD < 2,8% for barbatusin and RSD < 3,5% for 3&#946;-hydroxy-3-deoxobarbatusin), accuracy (recovery between 81,7% a 115,1%). The methods so developed have been applied to the leaves extracts of P. grandis, P. barbatus, P. amboinicus and P. ornatus. The larvicidal and cytotoxic potential of the four Plectranthus species were evaluated, as well as the purà compounds, showing promising cytotoxic activty for three strains of tumor cells.

A proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é uma enzima essencial na via da glicólise e da gliconeogênese, catalisando a fosforilação oxidativa do substrato gliceraldeído-3-fosfato em 1,3- bifosfoglicerato na presença de NAD+ e fosfato inorgânico, sendo também capaz de catalisar a reação inversa. A enzima é um homotetrâmero, tendo monômeros com massa de 36 kDa. Além desta atividade, a proteína pode ainda desempenhar outras funções importantes em vários processos celulares. A partir da descrição da expressão diferencial do gene gpdh1 (GAPDH) do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em condições que mimetizam a infecção, desenvolvemos este estudo para caracterizar a sua possível participação em outros processos celulares. Diversas análises foram realizadas para caracterizar o gene gpdh1 e sua proteína cognata. Os padrões de expressão, tanto em nível transcricional como em nível protéico foram avaliados sob condições de regulação fisiológica, evidenciando um padrão de regulação hierárquico em resposta às diferentes fontes de carbono adicionadas a culturas do fungo. Utilizando 2D-SDS-PAGE, anti-soro anti GAPDH e espectrometria de massas, identificamos isoformas de GAPDH sendo expressas pelo fungo, sendo uma majoritária. Com base nos relatos encontrados na literatura de localização da proteína GAPDH na superfície celular de diferentes patógenos, direcionamos o trabalho no sentido de verificar a localização sub-celular da GAPDH em Metarhizium. Utilizando técnicas de imuno-microscopia, mostramos a localização na superfície celular dos diferentes estágios de desenvolvimento do fungo. Mostramos também que a GAPDH localizada na superfície celular mantém a sua atividade enzimática. Utilizando ensaios de adesão de conídios de M. anisopliae em asas de insetos (Dysdercus peruvianus), mostramos que a GAPDH pode desempenhar uma função importante no processo de adesão do fungo na superfície do hospedeiro. Este trabalho descreve pela primeira vez a presença de isoformas de GAPDH, a sua localização na superfície celular e sua possível participação na adesão ao hospedeiro. / GAPDH is essential in glycolysis and gluconeogenesis pathways and catalyzes the oxidative phosphorylation of glyceraldehyde-3-phosphate into 1,3- biphosphoglycerate in the presence of nicotinamide adenine nucleotide (NAD+) and inorganic phosphate, as well as the reverse reaction. The enzyme is an homotetramer of 36 kDa subunits. GAPDH has other important roles in various cellular processes. The gene gpdh1 (GAPDH) was found to display differential expression during growth of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae cultured in conditions mimicking host infection. This led us to search for other possible functions of the GAPDH in the fungus. Therefore, we characterized the expression patterns of GAPDH, both at the transcription and protein level; we characterized isoforms of the protein; we immunolocalized GAPDH in different cell types and assayed its participation in adhesion to host surface. The expression of transcripts and GAPDH is hierarchily regulated by the carbon source available in the cultures (glucose, glycerol, ethanol and complex substrates, such as chitin and cuticle). By using 2D-SDS-PAGE, anti- GAPDH serum and mass spectrometry, isoforms of the protein were detected. As GAPDH has been reported at cell surface of pathogenic microorganisms, we directed efforts to localize GAPDH in Metarhizium. By using immunomicroscopy we showed the presence of GAPDH at the surface of the different developmental cell types of the fungus. We have also shown that the GAPDH at cell surface has enzyme activity. In adhesion assays, using Metarhizium conidia and insect wings (Dysdercus peruvianus), we showed that the GAPDH may be important during the adhesion step of the fungus to the host during infection. In this work, for the first time, we show that GAPDH from Metarhizium anisopliae has isoforms; that the active GAPDH is present at the fungal cell surface and is probably important for fungal to host adhesion.

A enzima indol-3-glicerol fosfato sintase (IGPS) catalisa a formação irreversível do anel do composto 1-o-carboxifenilamino desoxiribulose-5-fosfato (CdRP), através de uma decarboxilação e de uma desidratação, liberando o composto indol-3-glicerol fosfato (IGP), o quinto passo na via de biossíntese do triptofano. Neste trabalho, é descrita a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética da IGPS, além da identificação de um intermediário reacional. Para a realização destes estudos, o substrato da enzima (CdRP) foi sintetizado quimicamente, purificado e caracterizado espectroscopicamente e espectrometricamente. A fluorescência do CdRP mostrou-se dependente de pH, possivelmente devido ao efeito de transferência intramolecular de prótons no estado excitado (ESIPT). Efeitos de temperatura foram analisados, indicando uma energia de ativação de 8.4 kcal mol-1 para a reação catalisada pela IGPS. Efeitos isotópicos de solvente mostraram que a transferência de próton é apenas modestamente limitante para a reação, e estudos de inventário de prótons demonstraram que apenas um próton é responsável pelo efeito isotópico de solvente observado. Perfis de pH foram realizados para avaliar a presença de catálise ácido-base, mostrando que um resíduo desprotonado de pKa aparente igual a 6.0 é necessário para a catálise e que um resíduo com pKa aparente igual a 6.8 é necessário para a ligação do CdRP. Sugerimos que ambos os pKa estejam reportando para um mesmo resíduo, que poderia ser um glutamato conservado em todas as IGPS caracterizadas até o presente. Um modelo é proposto para explicar o ESIPT, assim como uma seqüência cinética baseada nos perfis de pH. Para identificar possíveis intermediários reacionais, a técnica de ESI-MS foi empregada para estudar a reação catalisada pela IGPS, e um intermediário químico foi interceptado e caracterizado. / The enzyme indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) catalyzes the irreversible ring closure of 1-o-carboxyphenylamino deoxyribulose-5-phosphate (CdRP), through a decarboxylation and a dehydration, releasing indole-3-glycerol phosphate (IGP), the fifth step in the biosynthesis of tryptophan. In the present work, we describe cloning, expression, purification, and kinetic characterization of IGPS. In order to perform kinetic studies, CdRP was chemically synthesized, purified, and espectroscopically and spectrometrically characterized. CdRP fluorescence was pH-dependent, probably owing to excited-state intramolecular proton transfer (ESIPT) effect. Temperature effects were analyzed, indicating an activation energy of 8.4 kcal mol-1 for the IGPS catalyzed reaction. Solvent isotope effects showed that a proton transfer is only modestly limiting for the reaction, and proton inventory studies pointed to a single proton responsible for the observed solvent isotope effect. pH-rate profiles were carried out to probe for acid/base catalysis, showing that a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.0 is required for catalysis and a deprotonated residue with an apparent pKa of 6.8 is necessary for CdRP binding. It was suggested that both apparent pKa report on the same residue, which might be a glutamate conserved amongst all IGPS characterized so far. A model is proposed to explain the ESIPT, and a kinetic sequence is suggested based on the pH-rate profiles. ESIMS was employed to identify possible chemical intermediates of the IGPS catalyzed reaction, and one chemical intermediate was intercepted and characterized.

Submitted by Etelvina Domingos (etelvina.domingos@ufpe.br) on 2015-03-06T17:52:49Z No. of bitstreams: 2 tese_digital_iveslima.pdf: 1006004 bytes, checksum: ac61098b56ddbddb7ebe29a13f4edc2d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T17:52:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_digital_iveslima.pdf: 1006004 bytes, checksum: ac61098b56ddbddb7ebe29a13f4edc2d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES / Seja M uma matroide 3-conexa menor-minimal possuindo a matroide N como menor. Em 2003, Lemos e Oxley obtiveram uma estimativa para diferença |E(M) − E(N)| e mostraram que o resultado obtido é o melhor possível, quando o menor N é conexo. Nesta tese, mostramos que esta estimativa pode ser melhorada quando o menor N é uma matroide circular, desde que M não possua um menor isomorfo ao prisma.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:34:06Z No. of bitstreams: 2 TESEDOUTORADO.pdf: 2157111 bytes, checksum: a4a1e2426ee84e507bd22352fbd2cdfd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESEDOUTORADO.pdf: 2157111 bytes, checksum: a4a1e2426ee84e507bd22352fbd2cdfd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / Embora o estudo imunoistoquímico seja um método bastante utilizado na rotina do diagnóstico anatomopatológico, este teste ainda apresenta importantes limitações principalmente quanto a incapacidade de distinção entre alguns tipos de lesões tumorais. Dessa maneira, outras ferramentas vêm sendo desenvolvidas a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade da identificação antígeno-anticorpo. Dentre estas, os ensaios quimiluminescentes vem sendo cada vez mais utilizados em estudos para o mapeamento de amostras biológicas para fins diagnósticos. Dentre os inúmeros benefícios da utilização dos métodos quimiluminescentes, podemos citar o limite de detecção ultrasensível, testes rápidos e um amplo campo de aplicações. O presente estudo buscou elaborar um protocolo para detecção da proteína galectina-3 em tecidos tumorais da mama a partir de anticorpo conjugado ao éster de acridina realizando ensaios imunoquimiluminescentes e compará-los aos resultados da imunohistoquímica convencional. O anticorpo monoclonal anti-galectina-3 foi conjugado ao éster de acridina e esse conjugado foi submetido à ensaios imunoquimiluminescentes em tecidos de mama além da imunohistoquímica convencional. Nossos resultados demonstram a eficiência na conjugação da anti-galectina-3 ao éster de acridina, um shelf-life do conjugado anticorpo/éster de acridina (AC-EA) com aproveitamento de 96,51% após 12 meses e a aplicação desse conjugado em ensaios imunoquimiluminescentes nos tecidos mamários com carcinoma ductal infiltrante (39.8 x 104 ± 29344) e com fibroadenoma (88.88 x 104 ± 17880) demonstraram padrões diferenciais entre a sua contraparte normal (58.87 x 104 ± 17880). Concluiu-se então, que o ensaio imunoquimiluminescente proposto pode ser utilizado como método diagnóstico alternativo na identificação de antígenos principalmente em amostras teciduais pequenas.