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Discovery of the role of protein-RNA interactions in protein multifunctionality and cellular complexity / Découverte du rôle des interactions protéine-ARN dans la multifonctionnalité des protéines et la complexité cellulaireRibeiro, Diogo 05 December 2018 (has links)
Au fil du temps, la vie a évolué pour produire des organismes remarquablement complexes. Pour faire face à cette complexité, les organismes ont développé une pléthore de mécanismes régulateurs. Par exemple, les mammifères transcrivent des milliers d'ARN longs non codants (ARNlnc), accroissant ainsi la capacité régulatrice de leurs cellules. Un concept émergent est que les ARNlnc peuvent servir d'échafaudages aux complexes protéiques, mais la prévalence de ce mécanisme n'a pas encore été démontrée. De plus, pour chaque ARN messager, plusieurs régions 3’ non traduites (3’UTRs) sont souvent présentes. Ces 3’UTRs pourraient réguler la fonction de la protéine en cours de traduction, en participant à la formation des complexes protéiques dans lesquels elle est impliquée. Néanmoins, la fréquence et l’importance ce mécanisme reste à aborder.Cette thèse a pour objectif de découvrir et comprendre systématiquement ces deux mécanismes de régulation méconnus. Concrètement, l'assemblage de complexes protéiques promus par les ARNlnc et les 3'UTRs est étudié avec des données d’interactions protéines-protéines et protéines-ARN à grande échelle. Ceci a permis (i) de prédire le rôle de plusieurs centaines d'ARNlnc comme molécules d'échafaudage pour plus de la moitié des complexes protéiques connus, ainsi que (ii) d’inférer plus d’un millier de complexes 3'UTR-protéines, dont certains cas pourraient réguler post-traductionnellement des protéines moonlighting aux fonctions multiples et distinctes. Ces résultats indiquent qu'une proportion élevée d'ARNlnc et de 3'UTRs pourrait réguler la fonction des protéines en augmentant ainsi la complexité du vivant. / Over time, life has evolved to produce remarkably complex organisms. To cope with this complexity, organisms have evolved a plethora of regulatory mechanisms. For instance, thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs) are transcribed by mammalian genomes, presumably expanding their regulatory capacity. An emerging concept is that lncRNAs can serve as protein scaffolds, bringing proteins in proximity, but the prevalence of this mechanism is yet to be demonstrated. In addition, for every messenger RNA encoding a protein, regulatory 3’ untranslated regions (3’UTRs) are also present. Recently, 3’UTRs were shown to form protein complexes during translation, affecting the function of the protein under synthesis. However, the extent and importance of these 3’UTR-protein complexes in cells remains to be assessed.This thesis aims to systematically discover and provide insights into two ill-known regulatory mechanisms involving the non-coding portion of the human transcriptome. Concretely, the assembly of protein complexes promoted by lncRNAs and 3’UTRs is investigated using large-scale datasets of protein-protein and protein-RNA interactions. This enabled to (i) predict hundreds of lncRNAs as possible scaffolding molecules for more than half of the known protein complexes, as well as (ii) infer more than a thousand distinct 3’UTR-protein complexes, including cases likely to post-translationally regulate moonlighting proteins, proteins that perform multiple unrelated functions. These results indicate that a high proportion of lncRNAs and 3’UTRs may be employed in regulating protein function, potentially playing a role both as regulators and as components of complexity.
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Analýza regulace komplexů cytoplazmatických poly(A) polymeráz / Analýza regulace komplexů cytoplazmatických poly(A) polymerázNovák, Jakub January 2011 (has links)
The regulation of gene expression is achieved at many levels. Chromatin-based gene regulation has been the central focus of many decades of research; however, posttranscriptional control mechanisms are emerging as a fundamental complement to direct protein synthesis. This thesis is focused on a specific mechanism of posttranscriptional control - the translational regulation of mRNAs in the cell cytoplasm. This control is a consequence of the balance between translational repression and activation and hinges on the selective recognition of regulated mRNAs by RNA-binding proteins and their ability to recruit RNA modifying proteins. In this thesis, Caenorhabditis elegans germline was used to study translational control of the germ cell-enriched gene, gld-2. Mutants of known RNA-binding proteins of the PUF and CPB protein families were analyzed by performing Western blots, using anti-GLD-2 antibodies. Yeast 3-Hybrid system was used to identify the cis-regulatory sites in the gld-2 mRNA conferring translational regulation by members of PUF and CPB protein families. Potential autoregulatory loop of gld-2 gene expression was also investigated. This thesis shows that FBF proteins positively regulate expression of gld-2 and bind to a conserved sequence in the 3'UTR of its mRNA. Mutations of gld-2 negatively affect...
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Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen StechmückenartenKarliuk, Yauhen 04 November 2022 (has links)
Zusammenfassung
Yauhen Karliuk
Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten
Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig
Eingereicht im Februar 2022
52 Seiten, 7 Abbildungen, 116 Literaturangaben, 1 Publikation
Schlüsselwörter: Chikungunya-Virus; 3′ UTR; direct repeats (DRs); CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante; Vektorkompetenz; Aedes vexans; Culex pipiens
Einleitung: Arthropoden-übertragene Viren (Arboviren) spielen weltweit eine große Rolle für die Gesundheit von Menschen und Tieren. Das Chikungunya-Virus (CHIKV) wird v.a. durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Die Hauptvektoren sind Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Aedes albopictus (Ae. albopictus), wobei letzterer sich zunehmend auch in gemäßigten Breiten etabliert.
Ziele der Untersuchungen: Zum einen sollte untersucht werden, ob auch die Stechmückenarten Aedes vexans (Ae. vexans) und Culex pipiens molestus (Cx. pipiens), die in gemäßigten Klimazonen vorkommen, als CHIKV-Vektoren fungieren können. Zum anderen sollte der Einfluss von Deletionen der Sequenzwiederholungen (DR) in der 3‘ nichttranslatierten Region (3‘ UTR) auf die virale Replikation in Zellkultur und in Stechmücken untersucht werden.
Tiere, Material und Methoden: Zunächst wurde eine CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante mit einer Deletion von DR1a und DR2a in der 3́ UTR (CHIKV-ΔDR) hergestellt und diese bezüglich der Wachstumskinetik mit Chikungunya-Wildtyp-Virus (CHIKV-WT) in C6/36- und Aag2-Stechmückenzellen sowie in BHK-21/J- Wirbeltier-Zellen verglichen. Um die Vektorkompetenz von beiden Viren in Stechmücken zu untersuchen, wurden Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. vexans und Cx. pipiens in einem Insektarium gezüchtet.
Bei den Infektionsexperimenten im S3-Labor wurden insgesamt 27 Ae. aegypti, 20 Ae. albopictus, 78 Ae. vexans und 62 Cx. pipiens Stechmücken verwendet. In diesen Experimenten wurden diese mit CHIKV-ΔDR und CHIKV-WT sowohl oral mit je 1x 10^6 PFU/ml über eine Fütterungsmembran als auch intrathorakal mit je 200 PFU (zur Umgehung der Mitteldarmbarriere) infiziert und an verschiedenen Tagen nach der Infektion und in verschiedenen Körperteilen sowie im Speichel auf virale RNA mittels Real-Time Reverser Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Unterschiede in der Virusreplikation wurden entweder mit Mann-Whitney- oder Fisher’s Exakt-Test überprüft. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05.
Ergebnisse:
Beide Viren, das CHIKV-WT und das CHIKV-ΔDR, zeigten ein vergleichbares Wachstum in Wirbeltier-Zellen (BHK-21/J) und erreichten einen Titer von 5x 10^8 PFU/ml. Das Wachstum beider Viren war auch in von Ae. albopictus abgeleiteten C6/36- Stechmückenzellen effizient, wobei CHIKV-WT ein um knapp eine Log-Stufe höheres Wachstum zeigte als CHIKV-ΔDR. In unseren Experimenten zeigte CHIKV-WT ein weniger effizientes Wachstum in von Ae. aegypti abgeleiteten Aag2-Stechmückenzellen, als in Ae. albopictus abgeleiteten C6/36-Stechmückenzellen, obwohl Ae. aegypti als Hauptvektor für CHIKV-WT gilt. In einer intrathorakalen und oralen Infektion konnten sowohl die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus als auch die einheimische Stechmückenarten Ae. vexans und Cx. pipiens erfolgreich infiziert werden. Bei einer intrathorakalen Infektion mit Umgehung der Mitteldarmbarriere wurde bei Ae. vexans oder Cx. pipiens eine effizientere Virusreplikation beobachtet als bei einer oralen Infektion. CHIKV-WT zeigte eine signifikant höhere Replikation in Ae. vexans im Vergleich zu CHIKV-ΔDR am Tag 7 und am Tag 14 nach der Infektion. Bei Cx. pipiens wurden signifikante Unterschiede für CHIKV-WT im Vergleich zu CHIKV-ΔDR nur am Tag 7 beobachtet.
Schlussfolgerungen:
Das beeinträchtigte Wachstum in C6/36- und Aag2-Zellen von CHIKV-ΔDR deutet darauf hin, dass die deletierten Sequenzwiederholungen spezifisch mit noch unbekannten Faktoren in Stechmückenzellen interagieren. Dennoch konnte CHIKV-ΔDR die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus problemlos nach intrathorakaler und oraler Infektion infizieren. Die Mitteldarm-Entweichungsbarriere scheint also nicht der einzige Faktor zu sein, der die Vektorkompetenz von Stechmücken beeinflusst. Auch die Replikationskinetik des Virus in den Sekundärgeweben scheint bei den verschiedenen Stechmückenarten unterschiedlich zu sein. Zwar umfassten unsere Studien zur oralen Infektion mit CHIKV nur einige einheimische Ae. vexans und Cx. pipiens Stechmücken, jedoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Stechmücken potenziell als Vektoren für CHIKV dienen können.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Alphaviren 2
2.1.1 Klassifikation 2
2.1.2 Virusmorphologie und Genomaufbau 2
2.1.3 Virusreplikation 4
2.2 Chikungunya-Virus 5
2.2.1 Übertragungszyklus 5
2.2.2 Epidemiologie 7
2.2.3 Genotypen und die 3′ UTR Region 9
2.2.4 Chikungunya-Fieber 12
2.3 Stechmücken 13
2.3.1 Taxonomie und Stechmückenarten in Deutschland 13
2.3.2 Allgemeine Morphologie, Biologie und Ökologie 14
2.3.2.1 Eiablage und Schlüpfen der Larven 15
2.3.2.2 Aquatische Entwicklungsstadien 16
2.3.2.3 Adulte 17
2.3.2.4 Flugverhalten und Überwinterungsstrategien 19
2.3.3 Arboviren in Deutschland 20
3 Publikation 26
3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 26
3.2 Publikation 27
4 Diskussion 42
5 Zusammenfassung 49
6 Summary 51
7 Literaturverzeichnis 53
8 Danksagung 66
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Stabil och antibiotikafri läkemedelsproduktion i rekombinant Escherichia coliBenevides, Kristina, Broström, Oscar, Elison Kalman, Grim, Swenson, Hugo, Vlassov, Andrei, Ågren, Josefin January 2017 (has links)
Den här rapporten presenterar ett antibiotikafritt, stabilt och kromosombaserat expressionssystem för läkemedelsproduktion i Escherichia coli på beställning av företaget Affibody AB. E. coli-stammen BL21(DE3) valdes som värdorganism för expressionssystemet. Systemet består av en genkassett som innehåller en T7-promotor, en 5′-UTR från genen ompA och en terminatorsekvens från RNA-operonet rrnB. Fyra kopior av genkassetten ska integreras i pseudogenerna caiB, yjjM, hsdS och yjiV. En datormodell som modellerar det egentliga kopietalet i cellerna har skapats i mjukvaran MATLAB, vilket visar att det uppskattas vara maximalt 32 kopior av genkassetten per cell på grund av replikation av kromosomen. Ett högt pH i fermentorn; att använda fed-batch och blandade kolhydratkällor; och att använda stammen BL21(DE3) minskar acetatproduktionen i cellen. En lägre acetatproduktion kan leda till en högre produkthalt. En proteinutbytesmodell för mjukvaran MATLAB har konstruerats för att uppskatta koncentrationen av Affibody®-molekylen i en E. coli cell.
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Micro RNA-Mediated regulation of the full-length and truncated isoforms of human neurotrophic tyrosine kinase receptor type 3 (NTRK 3)Guidi, Mònica 13 January 2009 (has links)
Neurotrophins and their receptors are key molecules in the development of thenervous system. Neurotrophin-3 binds preferentially to its high-affinity receptorNTRK3, which exists in two major isoforms in humans, the full-length kinaseactiveform (150 kDa) and a truncated non-catalytic form (50 kDa). The twovariants show different 3'UTR regions, indicating that they might be differentiallyregulated at the post-transcriptional level. In this work we explore howmicroRNAs take part in the regulation of full-length and truncated NTRK3,demonstrating that the two isoforms are targeted by different sets of microRNAs.We analyze the physiological consequences of the overexpression of some of theregulating microRNAs in human neuroblastoma cells. Finally, we providepreliminary evidence for a possible involvement of miR-124 - a microRNA with noputative target site in either NTRK3 isoform - in the control of the alternativespicing of NTRK3 through the downregulation of the splicing repressor PTBP1. / Las neurotrofinas y sus receptores constituyen una familia de factores crucialespara el desarrollo del sistema nervioso. La neurotrofina 3 ejerce su funciónprincipalmente a través de una unión de gran afinidad al receptor NTRK3, del cualse conocen dos isoformas principales, una larga de 150KDa con actividad de tipotirosina kinasa y una truncada de 50KDa sin dicha actividad. Estas dos isoformasno comparten la misma región 3'UTR, lo que sugiere la existencia de unaregulación postranscripcional diferente. En el presente trabajo se ha exploradocomo los microRNAs intervienen en la regulación de NTRK3, demostrando que lasdos isoformas son reguladas por diferentes miRNAs. Se han analizado lasconsecuencias fisiológicas de la sobrexpresión de dichos microRNAs utilizandocélulas de neuroblastoma. Finalmente, se ha estudiado la posible implicación delmicroRNA miR-124 en el control del splicing alternativo de NTRK3 a través de laregulación de represor de splicing PTBP1.
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