ARCA2 est une ataxie récessive qui se caractérise par une atrophie du cervelet et un léger déficit en coenzyme Q10. Des mutations dans le gène ADCK3 ont été récemment identifiées comme étant la cause d’ARCA2. ADCK3 code pour une kinase mitochondriale atypique, qui pourrait être impliquée dans la biosynthèse du coenzyme Q10. L’objectif de mon projet de thèse était d’élucider la physiopathologie d’ARCA2 en utilisant le modèle murin knockout pour Adck3. J’ai ainsi pu montrer que les souris Adck3-/- reproduisent de nombreux symptômes associés à ARCA2 et constituent un bon modèle pour étudier ARCA2. Au niveau du cervelet, les cellules de Purkinje sont spécifiquement touchées et présentent des anomalies morphologiques et fonctionnelles. Un léger défaut mitochondrial a été observé dans les muscles squelettiques des souris Adck3-/-. Enfin, une analyse transcriptomique de ces deux tissus a révélé des altérations de nombreuses voies, impliquant ADCK3 dans de nouveaux processus cellulaires. / ARCA2 is a form of recessive ataxia characterized by a slow progression of the ataxic phenotype, cerebellar atrophy and mild deficit in Coenzyme Q10. ARCA2 was recently found associated with mutations in the ADCK3 gene that encodes a putativemitochondrial kinase homologous to the yeast Coq8 and the bacterial UbiB proteins, which are required for Coenzyme Q biosynthesis. In order to elucidate the pathophysiology of ARCA2, a constitutive knockout mouse for Adck3 was generated.Adck3-/- mice reproduce many ARCA2 symptoms such as slow progression of the ataxic phenotype and mild Coenzyme Q deficit, suggesting that Adck3-/- mice are a good model to study ARCA2. Strikingly, a morphological and functional impairmentwas found in cerebellar Adck3-/- Purkinje cells, whereas a mild mitochondrial defect was observed in the skeletal muscle of Adck3-/- mice. Interestingly, transcriptomic analyses revealed alteration in a number of molecular pathways implicating ADCK3in novel cellular processes.

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie mitochondriale caractérisée par une ataxie spinocérébelleuse et sensitive, une cardiomyopathie et un diabète. L’AF est due à un déficit en frataxine (FXN), une protéine mitochondriale impliquée dans la synthèse des centres Fe-S et l’homéostasie mitochondriale. L’atteinte cardiaque, pour laquelle il n’existe aucun traitement, est la cause principale de décès. Nous avons montré que l’injection intraveineuse d’un vecteur adéno-associé (AAV) rh10 exprimant la FXN humaine prévient le développement de la cardiomyopathie d’un modèle souris de l’AF mais aussi que l’injection du vecteur à des animaux en insuffisance cardiaque permet la correction complète et rapide du phénotype cardiaque. Ces résultats démontrent la capacité des cardiomyocytes défectueux présentant un défaut bioénergétique à être rapidement corrigés. Nous avons ainsi établi la preuve de concept qu’un traitement par thérapie génique est une approche thérapeutique pertinente pour l’AF. / Friedreich ataxia (FRDA) is a mitochondrial disease with neurodegeneration, hypertrophic cardiomyopathy and diabetes. FRDA is caused by reduced level of frataxine (FXN), an essential mitochondrial protein involved in iron-sulfur cluster biogenesis and mitochondrial homeostasis. Cardiac failure is the most common cause of mortality in FRDA. To date, no treatment exists for FRDA cardiomyopathy. During my PhD, we showed that an adeno-associated vector (AAV) rh10 expressing human FXN injected intravenously not only prevented the onset of the cardiac disease in a faithful FRDA cardiac mouse model, but also, when administered in animals with cardiac failure, reversed rapidly and completely cardiac remodeling and insufficiency. Our results demonstrate the capacity of defective cardiomyocytes with severe energy failure and ultrastructure disorganization to be rapidly corrected and remodeled by gene therapy. Thus, we showed that gene therapy may be a relevant therapeutical approach for FRDA.

BIN1 est une protéine qui tubule les membranes. Elle est composée de plusieurs domaines : un domaine BAR, qui lie les membranes et possède une propriété de tubulation; un motif PI qui lie les phophoinositides et est uniquement exprimé dans le muscle squelettique; un domaine CLAP qui lie la clathrin et AP2 et qui n'est présent que dans les isoformes de BIN1 exprimées dans le cerveau; un domaine MBD impliqué dans la liaison à c-Myc; et un domaine SH3 impliqué dans les interactions avec les protéines riches en prolines. BIN1 est une protéine ubiquitaire, et l'organe où elle est le plus fortement exprimée est le muscle squelettique. Il a été montré que des mutations dans l'amphiphysine 2/BIN1 causent une myopathie centronucléaire récessive (ARCNM, OMIM 255200). Les mutations trouvées chez les patients sont réparties dans tous les domaines de la protéine, et deux d'entre elles aboutissent à un codon stop prémature dans l'exon 20, dernier exon de la protéine. Le motif PI, codé par l'exon 11, est régulé positivement pendant la myogenèse. Le but de cette recherche était de mieux comprendre le rôle de BIN1 dans le muscle sain et dans le cas de myopathie centronucléaire. Nous avons donc utilisé la technique de recombinaison homologue ciblée dans les cellules ES pour générer deux lignées de souris knockout: BIN1 exon 11 (délétion de l'exon 11) et BIN1 exon 20 (délétion de l'exon 20). La délétion de l'exon 20 détruit le domaine SH3, qui permet l'interaction de BIN1 avec différentes protéines, dont la dynamine 2, et induit une baisse considérable de l'expression de BIN1 au niveau protéique. Les délétions totales et spécifiques du muscle de l'exon 20 provoquent une létalité périnatale. Nous avons observé une perturbation de l'organisation des tubules T chez les souris KO, ce qui montre l'importance de BIN1 pendant la biogenèse des tubules T. Cependant, l'induction de la délétion chez la souris adulte n'a affecté ni la fonction ni l'organisation du muscle. Pour comprendre le rôle du motif PI, qui est spécifique du muscle, nous avons caractérisé les souris BIN1 KO exon 11. Même à 12 mois, la fonction du muscle n'était pas compromise chez ces souris. En revanche, nous avons observé des problèmes de régénération du muscle squelettique. Ce travail révèle, qu'in vivo, BIN1 est nécessaire pour la biogenèse des tubules T, mais pas indispensable pour le maintien du muscle. D'autre part, le domaine PI, spécifique du muscle, est impliqué dans la régénération musculaire. Sa function dans les muscles est régulée finement par l’expression de différentes isoformes et par des interactions intra-moléculaires. Comprendre ces caractéristiques nous aiderait à développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de ARCNM et de MD. / BIN1 is a membrane tubulating protein and it consists of the BAR domain which binds membranes and has tubulating property; the PI motif which binds phosphoinositides and is expressed only in skeletal muscle; the CLAP domain binds clathrin and AP2 and is present exclusively in brain isoforms of BIN1; the MBD is involved in c-Myc binding and the SH3 domain is involved in interactions with prolin-rich proteins. BIN1 is an ubiquitously expressed protein with the highest expression in skeletal muscle. Mutations in amphiphysin 2 / BIN1 were found to cause autosomal recessive centronuclear myopathy (ARCNM, OMIM 255200). Mutations in patients were found in all the protein domains and include two mutations leading to a premature stop codon in the last exon 20. The PI motive, encoded by exon 11, is upregulated during myogenesis. The aim of this research was to better understand the role of BIN1 in healthy muscle and in the pathology of CNM. For this purpose, by using targeted homologous recombination in ES cells, we generated two knockout mouse models: BIN1 exon 11 and BIN1 exon 20, with exon 11 and 20 deleted, respectively. The deletion of exon 20 disrupts the SH3 domain, involved in interactions with different proteins, amongst which is dynamin 2 and induced a considerable loss of the total BIN1 protein expression. The total and muscle specific deletions of exon 20 were perinatally lethal. A disrupted T-tubules organization was observed in knockout mice, showing an importance of BIN1 during the T-tubule biogenesis. Interestingly, deletion induced in adult mice did not affect muscle function and organization. In order to understand the role of the muscle specific PI motif, we characterized the BIN1 exon 11 KO mice. Even at 12 months of age the muscle function in mice was not compromised by this deletion. However, further examination showed impairment of skeletal muscle regeneration. This work revealed that in vivo, BIN1 is necessary during the T-tubules biogenesis and dispensable for muscle maintenance, whereas the skeletal muscle specific PI motif of BIN1 is involved in muscle regeneration. Its function in muscle is tightly regulated by isoform switch and intramolecular binding. Understanding these features will help us step forward towards successful therapy in ARCNM and MD patients.

: Chez la bactérie Clostridium acetobutylicum, la production de dihydrogène est catalysée par des hydrogénases, enzymes impliquées dans l’oxydation de la ferrédoxine réduite, qui permet la réduction des protons et la formation du gaz. Toutes les hydrogénases à fer partagent un domaine protéique très conservé (le Domaine H), hébergeant le site catalytique inorganique (le Cluster H). L’enzyme CaHydA de C. acetobutylicum, possède également le Domaine F contenant en tous quatre centres fer-soufre dits accessoires. Au cours de ces travaux, l’implication des centres fer-soufre du Domaine F sur les capacités catalytiques de l’enzyme a été étudiée, ainsi que les mécanismes de transfert d’électrons entre l’enzyme et son partenaire physiologique d’oxydoréduction principal : la ferrédoxine 2[4Fe-4S]. Différents variants ciblés de l’hydrogénase ont été créés, produits puis purifiés afin de les caractériser par une combinaison de méthodes biochimiques, électrochimiques, spectroscopiques et de modélisation moléculaire. Ceci a permis de mettre en évidence pour la première fois l’implication des centres fer-soufre accessoires du Domaine F dans les capacités catalytiques de l’enzyme. Enfin, il a été démontré que le centre [2Fe-2S] de surface FS2 de l’enzyme était le point d’entrée des électrons provenant de la ferrédoxine réduite. / The hydrogenase of Clostridium acetobutylicum catalyses the oxydation of reduced ferredoxin, leading to reduction of protons and dihydrogen formation. Among the three different classes of hydrogenases, the [Fe-Fe] Hydrogenases harbor a very conserved domain (H-Domain) containing the inorganic catalytic site (Cluster H). CaHydA from C. acetobutylicum possesses, in addition, the F-Domain containing four accessory iron-sulfur clusters. The involvement of accessory iron-sulfur cluster of F-Domain on the catalytic capacities of the enzyme has never been assessed. Moreover, which of the two surface iron-sulfur cluster of the F-Domain who interacts with the physiological redox partner ferredoxin is unknown. Different CaHydA mutants enzymes, modified in the Fe-S cluster composition of the F-Domain have been purified, and spectroscopically, biochemically and electrochemically characterized. These mutants enzymes, impaired in their catalytic activity both in solution and wired to an electrode, suggested, for the first time that the Fe-S clusters of the F-Domain have a long-range thermodynamic effect on the H-cluster and modulate enzyme’s functions. Moreover, it has been shown, and confirmed by molecular modelling, that the [2Fe-2S] surface cluster FS2 of the enzyme is the entry point for the electrons coming from the reduced ferredoxin.

Le paludisme ou malaria est une maladie parasitaire due à un protozoaire. Il est transmis principalement à l'homme par la piqûre de la femelle d'un moustique du groupe des anophèles. La transfusion sanguine représente la 3e voie potentielle de transmission de Plasmodium. L'incidence du paludisme a entraîné une augmentation de la proportion des donneurs de sang ayant été en contact avec le parasite. Le premier objectif de ce travail de thèse est d'analyser l'immune-réactivité de marqueurs biologiques de dépistage de Plasmodium dans les poches de sang pour prévenir le paludisme transfusionnel et plus spécifiquement, il s'agit de déterminer par goutte épaisse (GE) et Enzyme Linked lmmunosorbent Assay {ELISA), la prévalence du paludisme asymptomatique chez les donneurs de sang au Sud du Bénin. Le second objectif est de répertorier les marqueurs moléculaires les plus adéquats pour la recherche d'antigène et d'anticorps de Plasmodium, utilisables en dépistage de masse dans les centres de transfusion sanguine. / Malaria is a disease due a protozoan. lt is transmitted to humans by the bite of a mosquito form Anopheles group. Blood transfusion is the third potential way of malaria transmission. Incidence of Malaria has increased the proportion of blood donors suspected to be contaminated by Plasmodium sp. The goal of that study is to determine the immunoreactivity of some biomarkers that could be used for the prevention of the blood transfusion transmitted malaria. For that purpose we used thick and thin blood film microscopical determination and an Enzyme Linked lmmunoSorbent Assay technology detecting malaria antigen (pan-pLDH) and malaria antibodies. These methods were used for the screening of 2515 blood donors during ten following months insouthern-Benin, sample were separated in the 4 following seasons observed in Western Africa.

GASP1 modulerait le trafic intracellulaire des RCPG après endocytose provoquée par les ligands. Au cours de ce travail nous nous sommes focalisés sur l’interaction de GASP-1 avec le récepteur beta2-adrénergique (B2AR) et ses conséquences fonctionnelles. Les agonistes du récepteur B2AR sont des bronchodilatateurs puissants utilisés dans le traitement de l’asthme. Avec le Dr N. Frossard, nous avons montré qu'un traitement chronique avec un agoniste B2AR induit le développement d'une hyper-réactivitée bronchique chez les souris sauvages mais pas chez les KO GASP1. Ce phénotype n’est pas relié à une différence dans la dégradation du récepteur B2AR entre les souris sauvages et KO GASP-1 mais est corrélé avec une augmentation du niveau de collagène dans les poumons des souris sauvages. Nos résultats indiquent que GASP1 joue un rôle important dans ce phénomène adaptatif qui serait relié à un remaniement des tissus bronchiques dépendant de cette protéine. / GASP1 have been shown to modulate the postendocytic sorting of different GPCRs.In order to better understand the role of GASP1 in regulating the activity and intracellular traffic king of GPCRs, we have focused our project on the functional consequences of the interaction between GASP1 and beta2-adrenergic receptor (B2AR). B2AR agonists are potent bronchodilators used in the treatment of asthma. With Dr. N. Frossard, we have shown that achronic treatment with a B2AR agonist induces the development of bronchial hyperresponsiveness in wild-type but not in KO GASP1 mice. Furthermore, we have shown that this phenotype is not related to a difference of B2AR receptor degradation between wild type and KO animals but correlates with an increase in collagen levels in the lungs of wild type mice that is not observed in GASP1KO animals. Altogether, our data suggest thatGASP1 is critically involved in these adaptations, which could be related to a GASP1-dependent modification of lung tissues.

La maladie d’Alzheimer est souvent précédée de troubles cognitifs légers (MCI) associés à la lésion du cortex entorhinal, une région interconnecté avec l’hippocampe. Cependant, un tiers des patients MCI présentent une rémission cognitive suggérant l’action de mécanismes compensatoires. Ces mécanismes pourraient être déficitaires chez les patients porteurs de l’allèle APOE4 présentant un MCI plus agressif.Par des approches multidisciplinaires chez la Souris, ce travail a démontré que la lésion entorhinale induit des déficits comportementaux et une hyperactivité de l’hippocampe. Or, le bourgeonnement des fibres cholinergique dans l’hippocampe compense ces déficits. Comme le bourgeonnement cholinergique est inhibé en présence de l’APOE4, cela pourrait contribuer au déclin cognitif exacerbé de ces patients. Par conséquent, l’inhibition de l’hyperactivité hippocampique chez les 50% de patients APOE4 représente une alternative prometteuse pour le traitement symptomatique du MCI. / Mild Cognitive Impairments (MCI) often precedes Alzheimer’s disease (AD) and is characterized by the loss of entorhinal neurons leading to a hippocampal disconnection. However, MCI patients also revert to normal cognition, suggesting compensatory mechanisms that alter the disease progression. This compensation may be impaired in patients bearing the APOE4 allele that are more prone to MCI, present less cognitive reversion and faster transition to AD.This work in mice, demonstrated that the sprouting of cholinergic fibers compensates entorhinal lesions through the reduction of the related hippocampal hyperactivity. As in APOE4 mice the cholinergic sprouting was altered in association with cognitive impairments, such impaired synaptic compensation may contribute to the faster cognitive decline of these patients. Therefore, supporting or mimicking the cholinergic control on hippocampal hyperactivity may represent a promising alternative therapeutic strategy for APOE4-carriers.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire fatale. Elle est accompagnée par des altérations métaboliques, se manifestant précocement dans des modèles murins. L’objectif de cette thèse a été d’identifier les cibles moléculaires impliquées dans ces changements. Pour ce faire, nous avons étudié le muscle glycolytique, le premier touché par la dénervation au cours de la maladie dans un modèle de SLA, la souris SOD1G86R. Nous avons montré un déséquilibre entre les voies métaboliques glucidiques et lipidiques à un stade présymptômatique, avec une préférence pour la voie catabolique des lipides. Cette altération peut expliquer notre observation sur le changement des capacités à l’exercice des souris SOD1G86R présymptômatiques. Dans ce contexte, nous avons montré que l’inhibition pharmacologique de PDK4, un des principaux inhibiteurs de la glycolyse, est bénéfique, retardant l’apparition des symptômes. En prenant compte des spécificités métaboliques des différents éléments de l’axe neuromusculaire, ce travail ouvre des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal degenerative disease characterized by loss of upper and lower motor neurons, denervation and skeletal muscle atrophy. ALS is accompanied by metabolic alterations that are early events in mouse models for ALS. The main objective was to identify molecular targets responsible for these alterations. For this, we analyzed several metabolic regulators localized in presymptomatic glycolytic muscle tissue of an ALS mouse model, the SOD1G86R. We identified a pre-symptomatic alteration of metabolic equilibrium, showing an inhibition of glycolysis accompanied by an upregulation of lipid catabolic pathway. This alteration has functional significance, being reflected in a modified capacity of SOD1G86R mice to adapt to different types of exercise. Pharmacological inhibition of PDK4, one of the main inhibitors of glycolysis, delayed disease onset, underpinning the importance of metabolic equilibrium in disease progression. Taking into consideration the metabolic specificity of the different elements on the neuromuscular axis, this work opens towards new therapeutic approaches for ALS.

La SLA est une maladie neurodégénérative grave touchant l’adulte qui se caractérise principalement par la perte sélective des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones bulbaires et spinaux. La SLA se caractérise également par des altérations de l’homéostasie énergétique et du métabolisme des lipides. L’objectif de ce travail de thèse était, dans un premier temps, d’identifier des changements dans la composition en acides gras, dans le sang, comme potentiels biomarqueurs diagnostiques et pronostiques de la SLA. Dans un second temps, le but était de moduler ces changements, par des approches nutritionnelles, afin de mieux comprendre l’implication d’un métabolisme lipidique altéré dans le processus pathologique de la SLA. Ces travaux ont montré que des taux élevés d’acides gras mono-insaturés (MUFA), ainsi que des taux diminués d’acides gras poly-insaturés (PUFA), sont associés à un meilleur pronostic. L’analyse des effets de la modification de la composition en acides gras, dans des modèles de dénervation pathologique et lésionnelle, a confirmé l’implication de l’antagonisme MUFA/PUFA dans le processus neurodégénératif. Ces travaux font apparaitre des mises en garde quant à l’utilisation des acides gras dans des approches à visée thérapeutique pour la SLA. / ALS is a fatal neurodegenerative condition characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons. The disease is also characterized by alterations of energy homeostasis and lipid metabolism. The objective of this PhD work was, first, to identify changes in fatty acid composition of lipids in blood of ALS patients, as potential diagnosis and prognosis biomarkers of the disease. The second goal was to modulate these changes, by nutritional approaches, in order to better understand the involvement of an altered lipid metabolism in the pathological process. Our results showed that high levels of monounsaturated fatty acid (MUFA), as well as low levels of polyunsaturated fatty acids (PUFA), are associated with a better prognosis. The analysis of the effects of a modified fatty acid composition in both pathological and lesion models of denervation, has confirmed implication of the antagonistic relationship between MUFA and PUFA in the neurodegenerative process. This work suggests a cautious usage of fatty acids in therapeutic approaches targeting ALS.

Chez les vertébrés, le foie est un des organes majeurs du métabolisme en étant le siège de la régulation de différentes voies du métabolisme qui contrôlent l’homéostasie du glucose et des lipides. En se basant sur des travaux de recherche récents suggérant que le système de conjugaison de l'ubiquitine est engagé en réponse à différents signaux métaboliques, nous avons réalisé une analyse protéomique globale dans le but d’identifier des protéines ubiquitylées dans le foie de souris soumises á un protocole de jeûne – re-nourrissage. Parmi les 117 protéines différemment ubiquitylé sur le jeûne ou le re-nourrissage, nous avons identifié complément 3 (C3) dans le foie de souris réalimentées. Nous avons observé qu'un produit d'activation de C3, C3a, est ubiquitylé dans les hépatocytes primaires traités avec les médias riches en nutriments. Ainsi, nous proposons que l'ubiquitination de C3 joue un rôle dans la régulation des fonctions inflammatoires ou métaboliques de C3 dans le foie. / In vertebrates, the liver has developed to be a major metabolic organ able to control glucose and lipid homeostasis. It activates or inhibits specific pathways in a regulated manner, depending on the metabolic state of our organism. Based on the emerging experimental evidence suggesting that the ubiquitin conjugation system is engaged in response to different metabolic cues, we conducted a global proteomic analysis to identify metabolic pathways modified by ubiquitylation. To this end, we used livers of mice subjected to a fasting – refeeding protocol. Amongst the 117 proteins differentially ubiquitylated upon fasting or refeeding conditions, we identified complement 3 (C3) to be ubiquitinated in livers of refed mice. We observed that an activation product of C3, C3a, is ubiquitylated in primary hepatocytes treated with nutrient-rich media. Thus, we suggest that the ubiquitylation of C3 plays a role in the regulation of inflammatory or metabolic functions of C3 in the liver.