Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nous avons au cours de notre travail de thèse tenté de préciser les outils nécessaires àamplifier le potentiel lymphocytaire T de précurseurs hématopoïétiques chez l’Homme. Aucours de la différenciation lymphoïde T deux facteurs semblent importants, Notch et l’IL7.Nous avons étudié le rôle de l’IL7 et de Notch au cours de la différenciation T humaine. Nousavons montré que seule l’IL7 est indispensable à la différenciation des thymocytes immatureshumains. L’activation de la voie Notch potentialise la survie et la prolifération induite parl’IL7 des CD34+TN et des CD4 ISP. Notch maintien l’expression de la chaîne α de l’IL7Rmalgré la présence de l’IL7. Une étude épigénétique a montré que Notch est capable d’induirela déméthylation du promoteur de l’IL-7Rα permettant son expression.Les résultats obtenus avec les cellules CD34+ de sang de cordon ont montré que Notch etnon l’IL7 était indispensable à la différenciation au moins dans les stades précoces. Lesdifférences entre les thymocytes et les CD34+ de sang de cordon ne semblent pas êtreexpliquées par une expression différente des récepteurs Notch. Le système de différenciationdes cellules CD34+ de sang de cordon permet aussi d’augmenter le potentiel T in vitro.Nos données confirment le rôle indispensable de Notch et de l’IL7 dans la différenciationT avec toutefois des implications différentes selon l’origine des précurseurs et du stade dedifférenciation. La poursuite de l’étude du rôle de ces deux signaux au cours de l’ontogénie Thumaine permettrait de définir les conditions de culture optimale à l’amplification dupotentiel T des précurseurs CD34+ dans une optique d’utilisation en thérapeutique humaine / In this work, we have attempted to define tools for amplifying the T lymphocyte potentialof hematopoietic precursor cells in man. Notch and IL7 are important factors for Tlymphocyte differentiation. We have studied the roles of IL7 and Notch during human T celldifferentiation. We have shown that only IL7 is essential for differentiation of humanimmature thymocytes. Notch pathway activation potentiates IL7 induced CD34+ TN and CD4ISP survival and proliferation. Notch maintains IL7Rαchain expression in spite of thepresence of IL7. Epigenetic study showed that Notch is able to induce IL7RαpromoterdemethylationOur results on cord blood CD34+ cells showed that Notch, but not IL7, was essential fordifferentiation, at least in early stages. Differences between thymocytes and cord blood cellsCD34+ cells do not seem to be accounted for by different Notch receptor expression. Inaddition, cord blood CD34+ cell differentiation system increases in vitro T lymphocytepotential.Our data confirm the essential role of Notch and IL7 in T cell differentiation, with somediffferences between these two factors according to precursor origin and differentiation stage.Continuation of this study on the role of these signals in human T cell ontogeny would help indefining optimal culture conditions fot T lymphocyte potential amplification from CD34+precursors, in the perspective of therapeutical use in man

Europeiska Unionens arbete är mångsidigt, och innefattar även normativa delar. Principer om demokrati, rättssäkerhet och mänskliga rättigheter finns exempelvis fördragsstadgade i Artikel 2 i Lissabonfördraget. Trots EU:s normativa värderingar har vi de senaste åren sett hur situationer utvecklats i ett flertal medlemsländer där dessa värderingar på olika sätt kränkts, exempelvis i Ungern, Rumänien och Polen. Utvecklingen kan få stora konsekvenser dels inom unionen men också för EU:s legitimitet som en normativ internationell aktör. Det är oklart hur dessa situationer kan hanteras av EU, och problemet som uppkommit har kommit att kallas Köpenhamnsdilemmat. Syftet med denna uppsats är att belysa den debatt som pågår kring Köpenhamnsdilemmat, genom att urskilja, beskriva och analysera debattens huvudståndpunkter och de argument som först fram.  Uppsatsen urskiljer 4 huvudståndpunkter i debatten: EU bör ej ingripa, EU bör ingripa genom juridiska institutioner, EU bör ingripa genom politiska institutioner, och EU bör ingripa genom oberoende institutioner. Ståndpunkterna och deras argument utkristalliseras och beskrivs genom en beskrivande idéanalys samt undersökts närmare i en jämförande analys.  Undersökningen har funnit att de tre ståndpunkter som anser att EU bör ingripa har en liknande problembeskrivning. EU anses först och främst ha en normativ sida, där principer om rättsäkerhet, demokrati och mänskliga rättigheter bör upprätthållas i samtliga medlemsländer. Aktörerna pekar dessutom ut en bristande efterlevnad av dessa principer, vilket anses vara ett problem för både EU och unionens medlemsländer. EU bör således ingripa när medlemsländer bryter mot principerna, men saknar idag effektiva mekanismer för att göra så. Aktörerna föreslår därför en rad olika lösningar, som utgör grunden för indelningen av de tre ståndpunkterna. Bland de aktörer som anser att EU inte bör ingripa återfanns ett flertal argument: att EU inte har mandat att intervenera, att ingripanden kränker medlemsländernas suveränitet, och att EU har hanterat processerna felaktigt då deras kritik är politiskt motiverad, debatten elitistisk eller anklagelserna orättvisa och felaktiga. Dessa aktörers lösningsförslag blir följaktligen att EU inte bör ingripa, antingen gällande samtliga eller enbart specifika situationer, när medlemsländer anses bryta mot principerna om rättsäkerhet, demokrati och mänskliga rättigheter. Den jämförande analysen fann att aktörernas lösningsförslag väl följer deras problembeskrivning. En bild av problemet som övergripande följs exempelvis av ett lösningsförslag bestående av en bred mekanism, medan en mer specifik bild av problemet återföljs av en snävare fokuserad mekanism. Analysen fann även att debattens aktörer vanligtvis har en antingen pragmatisk eller idealistisk utgångspunkt, och att deras problembeskrivning, argumentation och därmed även lösningsförslag påverkas av denna utgångspunkt.

Di-2-piridil cetona saliciloilhidrazona (DPKSH) é uma hidrazona que forma compostos de coordenação com diversos íons metálicos. As resinas Amberlite XAD-2 e XAD-7 são polímeros não-iônicos que podem ser usados para a pré-concentração de íons metálicos. A adsorção de DPKSH nessas matrizes poliméricas foi etudada utilizando a espectrofotometria. A quantidade de DPKSH adsorvida nessas resinas foi calculada a partir da diferença entre a concentração inicial a concentração remanescente na solução sobrenadante, após o contato com a fase sólida em diferentes intervalos de tempo. Modelos cinéticos de pseudo-primeira e pseudo-segunda ordens foram aplicados aos dados experimentais coletados no estudo cinético. Outros experimentos realizados com tempo constante, mas variando a concentração inicial de DPKSH, forneceram dados experimentais que foram aplicados a três modelos de isotermas (Langmuir, Freundlich and Dubinin-Radushkevich) e alguns parâmetros termodinâmicos foram calculados para descrever a adsorção. Para a XAD-7, um estudo cinético mais completo foi realizado incluindo concentrações iniciais de DPKSH. A resina XAD-7 modificada com DPKSH foi então utilizada para estudar a retenção de íons Cu(II) usando três sistemas diferentes: (a) espectrofotometria direta; (b) uma coluna de vidro parcialmente preenchida com a resina modificada e (c) usando a técnica de análise por injeção em fluxo (FIA) com uma mini-coluna preenchida com a fase sólida. Finalmente, Cu(II) foi determinado em amostras sintéticas e comerciais de aguardente. / Di-2-pyridyl ketone salicyloylhydrazone (DPKSH) is a hydrazone which forms coordination compounds with several metallic ions. Amberlite XAD-2 and XAD-7 resins are non-ionic polymers which can be used to pre-concentrate metallic ions. Adsorption of DPKSH onto these polymeric matrices was investigated using the spectrophotometry. The amount of DPKSH adsorbed onto the resins was calculated as the difference between the initial concentration and the remained concentration in the supernatant solution, after the contact with the solid phase at different intervals of time. Kinetic models of pseudo-first and -second orders and intra-particle diffusion model were applied on experimental data collected from the kinetic study. Other experiments carried out under a constant time, but changing the initial DPKSH concentration, led to experimental data which were applied to three different isotherm models (Langmuir, Freundlich and Dubinin-Radushkevich) and some thermodynamic parameters were calculated and used to describe the adsorption. For XAD-7 a more complete kinetic study was carried out including different initial concentrations of DPKSH. The resin XAD-7 modified with DPKSH was then applied to study the retention of Cu(II) ions using three differents systems: (a) direct spetrophotometry; (b) a glass column filled with the modified resin and (c) using the flow injection analysis (FIA) with a mini-column partially filled with the solid phase. Finally, Cu(II) was determined in commercial and synthesized samples of sugar cane brandy.

O presente estudo foi clínico duplo-cego randomizado, placebo controlado. Avaliou o efeito analgésico do acuponto Estômago 7 (E7) em pacientes portadores de Disfunção Temporomandibular. A possível analgesia foi estudada bilateralmente nos músculos masséter e temporal anterior. A proposição se estendeu a fim de elucidar se existem diferenças nos resultados quando se utiliza um ponto em um lado da face, se o resultado repercute do outro lado da face e se a acupuntura atua no limiar de dor do indivíduo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa. A amostra constou de 56 pacientes. Todos os pacientes receberam a acupuntura real e acupuntura placebo, em sessão única. O acuponto E7 foi puncionado sempre do lado direito da face dos indivíduos. Os parâmetros utilizados para a avaliação foram a Escala Visual Analógica (EVA) e o Limiar de dor à Pressão (LDP). Avaliados antes e após o tratamento. A diminuição média do parâmetro EVA do lado direito foi de 39,73. Para o lado esquerdo, a diminuição média foi de 41,81. O parâmetro LDP aumentou imediatamente. O ponto isolado de acupuntura E7 promoveu a diminuição da dor do músculo masséter dos indivíduos. Foi possível agulhar um lado do paciente e atuar no lado oposto. O limiar de dor a pressão (LDP) medida no músculo-temporal anterior foi aumentado bilateralmente. / This was a clinical, double blind, randomized, placebo controlled study. It had the purpose of assessing the analgesic effect of acupoint Stomach 7 (S7) in patients with Temporomandibular Disorders. The possible analgesia was studied bilaterally on the masseter and anterior temporalis muscles. The proposal intended to find if there are differences in the results when a point on one side of the face is used and whether there is a repercussion on the other side of the face. Moreover, if acupuncture acts on the pain threshold of individuals. The study was approved by the Ethics Committee of Researches of the School of Dentistry of the University of São Paulo under number 544519. Fifty-six patients took part in the study. All the patients received real acupuncture and placebo acupuncture in a single appointment. Acupoint St7 was stimulated always on the right side of the patients faces. The parameters used for the assessment were the Visual Analog Scale (VAS) and the Pressure Pain Threshold (PPT), assessed before and after treatment. The mean decrease of VAS parameter on the right side was 39.73; and on the left side, the mean decrease was 41.81. The parameter PPT increased immediately. The isolated point of acupuncture St7 organized decrease of pain in the masseter muscle of patients. It was possible to puncture one side of the patient and act on the opposite side. The Pressure Pain Threshold (PPT) measured on the anterior temporalis muscle increased bilaterally.

O vítreo apresenta remodelamento de seus componentes durante a patogênese de doenças como descolamento de retina, buraco de mácula e membrana epirretínica e os fatores que levam a essas alterações ainda não são completamente conhecidos. As células gliais de Müller exercem um papel regulatório importante na retina, principalmente na produção de TGF-beta, e participam na formação de membranas contráteis em doenças da interface vítreo retínica. O TGF-beta está aumentado tanto na retina como no vítreo, em condições de doença, tendo o papel importante de ativar a capacidade contrátil na interface do tecidos estudados. MicroRNAs são moléculas de RNA fita simples de 19-25 nucleotídeos, endógenos, não codificantes e potentes reguladores pós-transcricional da expressão gênica, portanto potenciais alvos terapêuticos eficientes para o tratamento das doenças da interface vítreo-retínica. Em linhagem de células de Müller de rato (rMC-1), o tratamento com TGF- &#946 1 em concentração de 5 ng/ml leva a diminuição da expressão gênica de let7-b e let7-c, após 24 horas de tratamento. Já em linhagem humana de Müller ( MIO-M1), a expressão gênica de let-7b e let-7c foi alterada com 10 ng/ml de TGF- &#946 1 e TGF- &#946 2. TGF- &#946 2 induziu a uma queda da expressão de let-7b e let-7c, que variou entre 70% e 40 % , após 24 e 48 horas de tratamento. Investigamos os possíveis alvos desses miRNAs, COL1A1, COL1A2 e HAS2, proteínas que possuem relação com as alterações da interface vítreo-retiniana. Entretanto, a análise da expressão de RNAm de COL1A1 e COL1A2 após a estimulação de MIO-M1 com TGF- &#946 1 e TGF- &#946 2 não apresentou alterações. No estudo com gene reporter de luciferase validamos COL1A2 como um novo alvo de let-7b na célula de Müller. Nos estudos funcionais observamos que o let-7c mimético diminui a contração do gel de colágeno, Dessa forma, neste estudo concluímos que o micro-ambiente das células de Müller nas doenças da interface vítreo-retiniana, pode alterar a expressão dos miRNAs da família let7 e, consequentemente, levar à formação de membranas densas e contráteis. / Vitreous remodeling occurs during disease pathogenesis, such as retinal detachment, macular hole and epiretinal membrane, and the factors that lead to these alterations are still not fully determined. Müller glial cells regulate TGF-beta production in the retina and participate in the formation of contractile membranes in vitreoretinal interface.TGF-beta is increased in both vitreous and retina in disease conditions, and are key participants in activating contractible capacity. MicroRNAs are short (19- 25 nucleotides), endogenous, non-coding RNA, involved in post-transcriptional gene regulation, that have a potential role as new therapeutic targets for vitreoretinal interface diseases. In rat Müller cell line (rMC-1), treatment with 5ng /ml of TGF-&#946 1 induced a downregulation of let7-b and let7-c expression after 24 hours. In Müller human line (MIO-M1), let-7b and let-7c expression were altered with 10 ng / ml of TGF-&#946 1 and TGF-&#946 2. TGF-&#946 2 induced a downregulation ranging from 70% to 40%, after 24 and 48 hours of treatment. We investigated the possible targets of these miRNAs: COL1A1, COL1A2 and HAS2, proteins that are related to vitreoretinal interface alterations. However, the analysis of COL1A1 and COL1A2 mRNA expression after stimulation of MIO-M1 with TGF-&#946 1 and TGF-&#946 2 did not show any changes. The luciferase gene reporter analysis revealed COL1A2 as a let-7b target in the Müller cell. In the functional studies we observed that the let-7c mimic decreases collagen gel contraction. In summary, we conclude that the microenvironment of Müller cells in vitreoretinal interface diseases may alter the expression of the miRNAs of the let7 family and, consequently, lead to the formation of dense and contractile membranes.

A 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) é a principal substância psicoativa comercializada ilegalmente em comprimidos de ecstasy. O MDMA é uma droga de ação psicotrópica e uso proscrito, conforme lista F (grupo F2) da ANVISA, pois apresenta propriedades alucinógenas e estimulantes e seu uso/abuso pode gerar uma série de danos à saúde dos usuários. O desenvolvimento de eletrodos quimicamente modificados (EQMs) na eletroanalítica tem por finalidade a obtenção de sistemas de detecção mais sensíveis e seletivos para o analito de interesse. Também, considera-se necessário desenvolver novas técnicas e métodos para a detecção de compostos em amostras de interesse forense, a fim de obter ferramentas para auxiliar os cientistas forenses no combate ao comércio ilícito de substâncias. Conforme problemática exposta, este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento de eletrodos quimicamente modificados utilizando como modificadores da superfície eletródica de carbono vítreo o Nafion e Nafion/CB[7], utilizando deposição por drop coating e spin coating para a detecção de MDMA através das técnicas de voltametria cíclica e onda quadrada. Conforme o sistema empregado, os melhores EQMs desenvolvidos foram de Nafion (1,5% v/v) e Nafion (1,5% v/v)/CB[7] (10,0 µg.mL-1). Os EQMs desenvolvidos apresentaram limite de detecção e quantificação na faixa de traços e menores que aqueles reportados em outros trabalhos da literatura. Considerando a aplicação dos EQMs para a detecção de MDMA em amostras de ecstasy, verificaram-se as respostas voltamétricas de outras substâncias: cafeína, metanfetamina, teobromina, lidocaína, cloridrato de procaína, (±)-metanfetamina e cloridrato de cocaína. Nas condições experimentais empregadas, observou-se que as substâncias estudadas não atuam como falsos positivos para o MDMA. Paralelamente, obtiveram-se onze lotes de comprimidos de ecstasy (apreendidos e cedidos pela Polícia técnico-científica de Ribeirão Preto-SP) e realizaram-se análises qualitativas e quantitativas nos mesmos, utilizando técnicas colorimétricas (Marquis, Ácido sulfúrico, Simon e Simon com acetona) e cromatográficas (CG-EM E CLAE-EM). Considerando o melhor EQM desenvolvido, quantificaram-se 11 lotes de ecstasy pela técnica voltamétrica e cromatográfica, dentre os lotes estudados, dois não continham MDMA, um apresentou uma mistura de MDMA e cafeína e os demais continham MDMA. A concentração de MDMA presente nos lotes variou de 0 até 61 % em massa. A detecção de MDMA em ecstasy pelo método voltamétrico desenvolvido se mostrou viável e sensível para o analito de interesse. / The 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) is the main psychoactive component of ecstasy tablets, that have an illicit trade. MDMA has been an illicit psychotropic drug, and it has a prohibited use (group F2, in ANVISAs F list), because of its hallucinogenic and stimulating effects, and the use/abuse can poses serials health risks. The development of chemically modified electrodes (CME) in electroanalytical methods aims to get more sensitive and selective systems to detect the analytes. In this context, it is necessary to develop new techniques and methodologies to the detection of illicit samples; it provides more tools to help the forensic scientists to combat the illicit drug trade. So, this work focused in the development of chemically modified electrodes (CMEs) with modifications on the glassy carbon surface by drop coating and spin coating using Nafion and Nafion/CB[7] solutions. The CMEs were tested using cyclic, and square wave voltammetry to detect MDMA. Considering the employed system, the best CMEs were made by Nafion (1.5% v/v), and Nafion (1.5% v/v)/CB[7] (10.0 µg.mL-1) thin films. It was possible to observe better sensitivities for these sensors, in comparison to other MDMA studies reported in the literature. The specificity of the proposed sensors was checked in relation to other drugs: caffeine, methamphetamine, theobromine, lidocaine, procaine hydrochloride, and cocaine hydrochloride. These drugs do not interfere in this voltammetric method. Additionally, we studied eleven lots of ecstasy samples, allowed by the Scientific Police - Ribeirão Preto-SP, and we provide qualitative and quantitative studies using colorimetric techniques (Marquis, Sulfuric acid, Simon, and Simon with acetone), and chromatografic techniques (GC-MS and HPLC-MS). The MDMA quantification in real samples was obtained by high performance liquid chromatography with a mass spectrophotometer, and we compared with the voltammetric technique, using the developed CME. Between the analyzed lots, two of them didnt present in their composition, one lot had a mix of caffeine and MDMA, and another presented MDMA. The MDMAs concentration in lots had a large variation, with 0 to 61 % w/w. The MDMAs voltammetric detection in ecstasy lots was viable. And, it is also possible to apply this methodology to analyze MDMA traces.

O câncer de mama representa problema mundial de saúde pública e a causa mais frequente de morte por câncer entre as mulheres. A identificação de agentes moduladores de marcas epigenéticas, tais como metilação global do DNA e modificações pós-tradução em histonas, compreende alternativa promissora para estabelecimento de estratégias de controle da carcinogênese mamária. Dentre os nutrientes, o elemento traço essencial selênio (Se) pode ser destacado como agente dietético com potencial anti-câncer de mama e que poderia atuar modulando processos epigenéticos. Entretanto seus mecanismos de ação são pouco elucidados. Este estudo objetivou, assim, identificar efeitos do tratamento com selênio no crescimento e marcas epigenéticas de células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7. Células MCF-7, positivas para o receptor de estrógeno, foram tratadas com ácido metilselenínico (MSA) ou selenito de sódio (ST) por diferentes tempos e em diferentes concentrações. Foram avaliados: padrão de proliferação (ensaio cristal violeta) e viabilidade celular (método de exclusão azul de tripan); integridade de membrana plasmática (citometria de fluxo); níveis de fragmentação do DNA (citometria de fluxo), distribuição das fases do ciclo celular (citometria de fluxo); apoptose (citometria de fluxo/ marcação dupla com Anexina V - Iodeto de propídio); níveis de lisina 9 acetilada (H3K9ac) e trimetilada (H3K9me3) em histona H3; níveis de lisina 16 acetilada (H4K16ac) em histona H4 (Western blot); padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD); expressão de gene supressor de tumor (RASSF1a; qPCR) e padrão de metilação da região promotora (RASSF1a e RAR&#946;; MS-PCR); expressão da enzima DNA metilstransferase 1 (DNMT1) (Western Blotting). Comparado ao grupo controle de células não tratadas (GC), ambos os tratamentos com MSA ou ST inibiram a proliferação e viabilidade de células MCF-7 de forma dose e tempo dependente. Ambas as formas químicas de Se induziram a parada do ciclo celular, aumentando (p< 0,05) a proporção de células na fase G2/M e reduzindo (p< 0,05) a proporção daquelas nas fases G0/G1 e S. Os tratamentos com MSA favoreceram a morte celular por apoptose, que foi associada com nível de fragmentação de DNA aumentado (p< 0,05), e reduzida ruptura da membrana plasmática associada com a exposição aumentada (p< 0,05) de fostadilserina. Por outro lado, o ST aumentou (p< 0,05) a fragmentação do DNA e (p< 0,05) a positividade ao iodeto de propídio associado à indução de necrose (p< 0,05). Dentre os mecanismos epigenéticos investigados, 1,6&#181;M e 2&#181;M reduziram a acetilação de H3K9ac (72h; p< 0,05) e aumentaram a de H4K16ac (96h; p< 0,05). O tratamento por 96h com 2&#181;M de MSA reduziu (p< 0,05) a metilação de H3K9me3. Ambos MSA e ST não alteraram o padrão de metilação global do DNA, mas reduziram a expressão de DNMT1, após 96h com 2&#181;M de MSA (p< 0,001; 88%) e após 120h com 10&#181;M de ST (p< 0,001; 96%). ST, mas não o MSA, aumentou (p< 0,05; 45%) a expressão do gene RASSF1a. Em ambos os grupos tratados com MSA ou ST, bem como no GC, a região promotora dos genes RASSF1a e RAR estavam predominantemente metiladas. Estes resultados fornecem evidências de que as ações anti-câncer de mama de compostos do selênio dependem de sua forma química. Além disso, a modulação de processos epigenéticos parecem ser relevantes para as ações inibitórias do MSA em células de câncer de mama. / Breast cancer is a global public health problem and the most frequent cause of cancer death among women. The identification of agents able to modulate epigenetic marks, such as global DNA methylation and histone post-translational modifications, comprises promising alternative for establishing control strategies on mammary carcinogenesis. Among the nutrients, the essential trace element selenium (Se) can be highlighted as a dietary agent with potential anti-breast cancer and could act by modulating epigenetic processes. However its mechanisms of action are poorly understood. This study aimed, therefore, to identify the effects of selenium treatment on growth and epigenetic marks of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells. MCF-7 cells, positive for estrogen receptor, were treated with methylseleninic acid (MSA) or sodium selenite (ST) for different times and in different concentrations. Evaluated parameters included: cell proliferation (crystal violet assay) and cell viability (trypan blue exclusion assay); plasma membrane integrity (flow cytometry); levels of DNA fragmentation (flow cytometry), apoptosis (flow cytometry - double labeling with Annexin V - propidium iodide); distribution of cell cycle phases (flow cytometry); acetylated (H3K9ac) and trimethylated (H3K9me3) lysine 9 levels on histone H3; acetylated (H4K16ac) lysine 16 level on histone H4 (Western blot); global DNA methylation (HPLC-DAD); tumor suppressor gene expression (RASSF1a; qPCR) and promoter methylation (RASSF1a, RAR&#946;; MS-PCR); DNA methyltransferase 1 (DNMT1) expression (Western blot). Compared to untreated cells (controls), both MSA and ST inhibited (p< 0.05) MCF-7 cell proliferation and viability in a dose- and time-dependent manner. Treatments with MSA favored cell death by apoptosis, that was associated with increased (p< 0.05) DNA fragmentation level, reduced plasma membrane rupture associated with high (p< 0.05) phosphatidylserine exposure. On the other hand, ST increased (p< 0.05) DNA fragmentation, enhanced (p< 0.05) propidium iodide positivity associated to necrosis induction (p< 0,05). Both chemical forms of Se induced nduced cell cycle arrest, increasing (p< 0.05) the proportion of cells in G2/M phase and reducing (p< 0.05) the proportion of those in G0/G1 and S phases. Among the epigenetic mechanisms investigated, 1.6&#181;M and 2&#181;M of MSA reduced acetylation of H3K9ac (72h, p< 0.05) and increased the H4K16ac (96h, p< 0.05). The treatment for 96h with 2&#181;M of MSA reduced (p< 0.05) the H3K9me3 methylation. Neither MSA nor ST altered (p> 0.05) global DNA methylation, while both compounds reduced (p< 0.05) DNMT1 protein expression, after 96h with 2&#181;M of MSA (p< 0.001; 88%) and after 120h with 10&#181;m of ST (p< 0.001; 94%). ST, but not MSA, increased (p< 0.05; 45%) RASSF1a gene expression. In control and Se-treated cells promoter regions of RASSF1a and RAR&#946; were predominantly methylated. These results provide evidence that the anti-breast cancer actions of selenium compounds depend on its chemical form. Additionally, modulation of epigenetic processes seems to represent a relevant feature of MSA inhibitory effects in breast cancer cells.

Les cellules T régulatrices Foxp3+ (Treg) représentent une sous-population T CD4 cruciale pour le maintient de l'immuno-tolerance. Mieux comprendre la biologie des Treg, leur hétérogénéité, leur développement, leur mécanisme d’action et les facteurs assurant leur survie en périphérie reste un objectif majeur. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie Treg et d’évaluer l’éventuelle contribution des perturbations de l’homéostasie Treg en pathologie humaine.Dans la première partie de ce travail de thèse nous avons essayé de finalement définir dans le modèle murin le rôle joué par l'IL-7 dans le contrôle de l’homéostasie Treg. Nous avons montré que l'expression de CD127, la chaîne alpha du récepteur à l'IL-7, est finement régulée à la surface des Treg et qu'elle dépend de leur activation ainsi que de leur localisation tissulaire. Nous avons démontré que l’expression de CD127 par les Treg activées est fonctionnelle, identifiant ces cellules comme cibles potentiels de l'IL-7. En utilisant des modèles murins présentant une altération de la voie de signalisation IL-7/IL-7R et des modèles de transfert adoptif, nous avons obtenu une démonstration définitive du rôle direct de l'IL-7 dans la régulation du nombre de cellules Treg. Enfin, nous avons démontré que la signalisation IL-7 optimise la capacité de ces cellules de réagir à l'IL-2, une cytokine importante dans la régulation de l’homéostasie Treg. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié l’homéostasie Treg dans le contexte de l'infection par le VIH. Cette étude a bénéficié de l’accès à des patients au cours de la primo infection et des HIV contrôleurs. Nous avons montré que les Treg effecteurs plus que les Treg naïves sont affectés par l'infection par le VIH. De plus, nous avons montré que le nombre des effecteurs Treg corrélant inversement avec les réponses T CD8 spécifiques, offrant une preuve ex vivo de l'implication des Treg dans l'immunité anti-VIH. / Regulatory T cells (Treg) represent a crucial CD4 T cells subset involved in maintenance of immune-tolerance. Since their first description important efforts have been undertaken to better understand their biology, their development and their mechanisms of action. However, little is known about factors controlling Treg peripheral homeostasis. The aim of this thesis work was to better define mechanisms involved in governing Treg homeostasis and to investigate the eventual contribution of perturbation of Treg homeostasis in human disease. In the first part of this thesis work we tried to define in the murine system the role played by IL-7 in governing Treg homeostasis. We showed that Treg surface expression of CD127, the IL-7 receptor alpha chain, is finely regulated as it depends on their activation as well as on their tissue localization. More importantly, we demonstrated that Treg do express functional levels of CD127, identifying these cells as potential target of IL-7. Using both genetically modified murine models of altered IL-7 signaling and adoptive transfer models, we obtained definitive evidence for a direct role of IL-7 in governing Treg cell numbers. Finally, we demonstrated that IL-7 signaling in Treg optimizes their capacity to react to IL-2 an important cytokine regulating Treg homeostasis. In the second part of this work we investigated Treg homeostasis in the context of HIV infection. Employing for the first time in HIV infection a novel consensus Treg identification strategy and applying it to different groups of HIV infected patients, including primary infected patients and HIV controllers, we showed that HIV infection is characterized by an early and long lasting alteration of Treg homeostasis. In particular we demonstrated that effector rather than naive Treg are affected by HIV infection. Moreover, we showed that effector Treg numbers inversely correlated with HIV specific CD8 T cells responses, providing ex vivo evidence of Treg involvement in HIV immunity.

Bisfenol A (BPA) é um insumo largamente utilizado na produção de plástico policarbonato e amplamente difundido no meio ambiente, levando o ser humano à exposição crônica desde o período intrauterino. A literatura aponta a possibilidade de BPA aumentar o risco de diversos tipos de câncer, mas são necessários estudos que possibilitem o entendimento de mecanismos pelos quais isso pode ocorrer. Neste trabalho foram investigados os efeitos do BPA ou nitro-BPA em células HL-60, MCF-7 e tecidos de ratos. Células HL-60 foram expostas ao BPA ou nitro-BPA nas concentrações de 25, 100 e 250 &#181;M (0,1 % DMSO v/v) por 2, 24 ou 48 horas na presença ou ausência de H2O2 (40 nmol/5 x 104 células). Células MCF-7 foram expostas da mesma forma, sem o uso de H2O2, mas na presença e ausência de agonista (PCB) de receptor Ah. Ratos Sprague-Dawley machos receberam BPA diariamente ao longo de 4 semanas (50 mg/kg de peso corpóreo) por gavagem, na vigência e ausência de diabetes, com subsequente coleta de urina, fígado, rins, medula óssea e sangue. Nos experimentos com as células, a viabilidade, ciclo celular, fragmentação do DNA e a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROs) foram avaliadas por citometria de fluxo, a atividade da cadeia respiratória mitocondrial pelo ensaio do XTT, e a atividade de MPO de células HL-60 por ensaio de fluorescência, bem como a produção de &#8226;NO. A metilação e hidroximetilação global do DNA e os adutos 8-oxodG, CEdG, 1,N6-&#949;dA, 1,N2-&#949;dG e BPA-Gua no DNA das células, tecidos, meio de cultura e urina foram analisados por HPLC-ESI-MS/MS. O hemograma e mielograma dos animais foram obtidos no Laboratório de Hematologia Experimental da FCF USP. Observou-se que tanto BPA quanto nitro-BPA induziram a geração de ROS em células HL-60 logo após 2h de incubação. BPA levou subsequentemente à perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, aumento da permeabilidade da membrana plasmática, fragmentação do DNA, parada na fase G2/M do ciclo celular e hipermetilação acompanhada de hipohidroximetilação global do DNA. A citotoxicidade induzida pelas mesmas concentrações de nitro-BPA em células HL-60 foi menos pronunciada, sem perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, com pouca fragmentação do DNA, mas com parada na fase G0/G1 do ciclo celular e indução de hipohidroximetilação global do DNA na presença de H2O2. Não foi observada a indução de adutos de DNA nas células HL-60 incubadas com BPA, mas sim de CEdG nas células incubadas com nitro-BPA. Os dados obtidos a partir da exposição das células HL-60 a BPA e nitro-BPA nos indicam que as duas moléculas provocam alterações metabólicas distintas nesse tipo celular, independentes da via estrogênica, que levam a alterações predominantemente epigenéticas (BPA) ou genéticas e epigenéticas (nitro-BPA), que podem ter consequências fenotípicas, como progressão maligna, que precisam ser investigadas. Foi observado que as células MCF-7 são mais resistentes que as células HL-60 à citotoxicidade induzida por BPA e nitro-BPA. Como resultado da exposição das células MCF-7 a BPA, houve pequeno aumento da permeabilidade da membrana plasmática (250 &#181;M), indução dos níveis de ROS após 24 h (25 &#181;M) e aumento da população de células em sub G1, ou seja, com DNA fragmentado (100 &#181;M e 250 &#181;M), mas sem alteração do ciclo celular. No caso de nitro-BPA, foi observada parada do ciclo celular em G2/M (25 &#181;M, 100 &#181;M e 250 &#181;M), assim como aumento de permeabilidade da membrana plasmática após 24 h de incubação (25 &#181;M, 250 &#181;M), sem indução de ROS ou aumento de células em sub G1. Entretanto, observou-se aumento dos níveis de CEdG e 8-oxodG no DNA das células incubadas com BPA (100 &#181;M, 250 &#181;M) sem a ativação prévia de receptores Ah. A ativação dos receptores Ah com PCB levou a menor aumento do nível das lesões após as incubações com BPA. A maior resistência das células MCF-7 aos efeitos citotóxicos do BPA está provavelmente relacionada à ação estrogênica desse xenobiótico. A sinalização estrogênica juntamente com o aumento dos níveis de lesões no DNA aumenta a chance de mutações e de transformação maligna. Nas células com ativação do receptor Ah, BPA levou ainda ao aumento da hidroximetilação global, sem alteração da metilação global do DNA. Os animais não diabéticos expostos ao BPA apresentaram quantidades diminuídas de promielócitos, blastos e bastonetes na medula óssea (aplasia medular), sem alteração no hemograma. Houve aumento dos níveis de CEdG no fígado, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, e não foi observada alteração das marcas epigenéticas e adutos de DNA no rim ou na urina. Os animais diabéticos expostos ao BPA apresentaram aumento do número de eosinófilos e linfócitos na medula óssea, podendo-se sugerir a indução de um estado inflamatório alérgico, e aumento do número total de hemácias circulantes e do hematócrito. Houve aumento dos níveis de CEdG, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, aumento dos níveis de 8-oxodG no DNA renal, sem alteração das marcas epigenéticas no rim, e não foi observada alteração dos adutos de DNA na urina. Os dados obtidos apontam para a geração de ROS como uma importante via de cito- e genotoxicidade induzidas por BPA. Sua biotransformação para BPA-3,4- quinona nos modelos utilizados parece ter menor importância para os efeitos, uma vez que não foi detectada a lesão BPA-Gua em nenhuma amostra de DNA, meio de cultura das células ou urina dos animais. Alterações metabólicas induzidas por BPA e ROS podem favorecer as alterações das marcas epigenéticas observadas no DNA das células HL-60, MCF-7 e fígado dos animais. Todas essas alterações podem contribuir para a transformação maligna de células expostas ao BPA. / Bisphenol A (BPA) is a compound widely used in polycarbonate plastic production and widespread in the environment, humans are chronic exposed to BPA in intrauterine period and entire life. The literature suggests the possibility of BPA increase the risk of developing cancers, but studies are required to enable the understanding of mechanisms by which this can occur. HL -60 cells were exposed to BPA or nitro-BPA at concentrations of 25, 100 and 250 uM (0.1% DMSO v/v) for 2, 24 or 48 hours in presence or absence of H2O2 (40 nmol/5x104 cells), MCF-7 cells followed a similar profile of exposure without the use of H2O2, but in presence or absence of Ah agonist receptor (PCB126). Male Sprague-Dawley rats received BPA daily over 4 weeks (50 mg/kg body weight) by gavage in presence and absence of diabetes, with subsequent collection of urine, liver, kidney, bone marrow and circulating blood. The viability, cell cycle, DNA fragmentation and the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by flow cytometry, MPO activity and NO production was evaluated by fluorescence assay for HL- 60 cells, mitochondrial activity by XTT assay, and the global DNA methylation was checked by HPLC-PDA. DNA adducts 8-oxodG, CEdG, 1,N6-&#949;dA, 1,N6-&#949;dG and BPA-Gua were quantified by HPLC- ESI-MS/MS in DNA of cells, culture medium, urine and tissue collected from Sprague-Dawley rats. Blood count and bone marrow examination were obtained in collaboration with Experimental Hematology Laboratory of University of Sao Paulo We observed that both BPA and BPANO2 induced ROS generation in HL- 60 cells after 2 hours of incubation. BPA subsequently led to failure of mitochondrial respiratory chain activity, increased permeability of the plasma membrane, DNA fragmentation, arrest in G2/M phase of cell cycle, DNA hypermethylation with global hipohydroxymethylation. We saw low cytotoxicity in HL-60 cells induced by nitro-bpa n the same concentration, without loss of mitochondrial respiratory chain activity, discrete DNA fragmentation, but leading cell cycle to stopping at G0/G1 phase, and induction of DNA global hypermethylation. No lesions were observed in the DNA of HL-60 cells.The results obtained from the exposure of HL-60 cells to BPA and nitro-BPA indicate that these two molecules induce different metabolic abnormalities in this cell line, independent of estrogen pathway, leading to changes in epigenetic (BPA) or genetic and epigenetic (nitro-BPA) profile, that can induce phenotypic consequences such as malignant progression. It was observed along the study that MCF-7 cells are more resistant than HL-60 cells to cell damage induced by BPA and nitro-BPA. As a result of MCF-7 cells exposure to BPA, we saw a slight increase in membrane permeability (250 mM), ROS generation after 24h (25 mM) and increase in cell population in sub G1, so we had DNA fragmentation (100 uM and 250 uM), but with no effect on cell cycle. However, we observed increased levels of CEdG and 8-oxodG on DNA of cells incubated with BPA (100 uM, 250 mM) without prior activation of Ah receptors. The activation of Ah receptors with PCB took a small increase in the level of DNA lesions after incubations with BPA. MCF-7 cells resistance to the cytotoxic effects of BPA is probably related to estrogen action of this compound. Estrogen signaling in addition with the increased levels of DNA damage increases the chance of mutations and malignant transformation. In cells with Ah receptor activation, BPA also led to increased DNA global hydroxymethylation, without changing the global DNA methylation. Nondiabetic animals exposed to BPA had decreased amounts of promyelocytes, blasts and rods in the bone marrow, with any change in blood count. There were an increase of CEdG levels in liver, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, and was observed any alteration on epigenetic markers and DNA adducts in kidney or urine. On the other hand diabetic animals exposed to BPA showed increased numbers of eosinophils and lymphocytes in bone marrow, suggesting the induction of an allergic inflammatory state. There were increased levels of CEdG, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, increased 8-oxodG levels on kidney DNA without changing epigenetic markers, was not observed DNA adducts in urine. The data obtained indicate that the generation of ROS could be the major route of cytotoxic and genotoxic induced by BPA exposure. BPA biotransformation to BPA-3,4-quinone used in the models seem to have poor effects, since we was not detected BPA-Gua lesion in any DNA sample, culture medium of cells or urine of the animals. Metabolic changes induced by BPA and ROS can enable changes in epigenetic markers observed in the DNA of HL-60 cells, MCF-7 and liver tissue. All these changes may contribute to malignant transformation of cells that were exposed to BPA.