O objetivo do projeto foi desenvolver linhagens celulares para um anticorpo terapêutico anti-hTNFα e comprovar sua funcionalidade. Os genes anti-hTNFα foram clonados em células CHO para seleção da população estável mista, demonstrando expressão de anticorpo com reconhecimento de hTNFα em estrutura tridimensional. A população de transfectantes de maior produtividade específica foi escolhida para geração de linhagem monoclonal utilizando a tecnologia robótica ClonePix FL. Não houve diferença estatística entre o anti-hTNFα purificado e o produto de referência na cinética de ligação ao TNFα e reconhecimento diferencial por FcγRs em ensaios por SPR O ensaio de atividade funcional mostrou que o anti-TNFα desenvolvido pôde neutralizar a citotoxicidade induzida em células L929 e inibir a expressão de ELAM-1 em HUVEC. Os resultados finais permitiram identificar os três melhores clones, estáveis por 60 gerações. A comparabilidade entre o anti-TNFα desenvolvido e a referência permite admiti-lo como não inferior, um dos requisitos para o desenvolvimento de biossimilar. / The aim of the project was to develop a therapeutic anti-hTNFα antibody and evaluate its functionality. The anti-hTNFα synthezised genes were cloned into CHO cells and stable pools were selected, producing antibodies able to hTNFα three-dimensional structure recognition. The stable pools displaying higher antibody yields were the source for the generation of monoclonal lineage by ClonePix FL robotic technology. The clones selection proceeded using different criteria as cell density, specific productivity, fed-batch performance, kinetics measured by surface plasmonic resonance, hTNFα binding through ELISA, western-blotting and SPR, FcγRs binding by SPR. Besides, a small number of clones was tested in functional assays by the impairment of cytotoxicity of hTNFα over L929 cells and the inhibition of ELAM-1 expression by HUVEC. The long term stability testing allowed to finally select 3 top clones, not inferior to adalimumab reference by the above criteria.

O parasita Schistosoma mansoni é um dos principais causadores da esquistossomose, doença que acomete 200 milhões de indivíduos no mundo. O parasita possui um complexo ciclo de vida composto de seis estágios evolutivos em dois hospedeiros. S. mansoni possui um sofisticado sistema de interação com seus hospedeiros de modo a escapar da resposta imune e interagir com moléculas produzidas por eles. Alguns trabalhos na literatura descreveram o efeito do TNF-α humano sobre o processo de ovoposição do parasita adulto. Nosso trabalho teve por objetivo analisar o perfil de expressão gênica do S. mansoni ao longo de seus estágios de desenvolvimento, avaliar o efeito do TNF-α humano sobre o perfil de expressão gênica do parasita em dois estágios de desenvolvimento e descrever o gene homólogo ao receptor de TNF-α humano em S. mansoni. Para isso, duas plataformas de microarrays distintas foram utilizadas: uma composta por 4000 sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisa e a outra, composta por 44000 sondas de oligonucleotídeos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com estas plataformas foi detectada a expressão de 5798 genes em vermes adultos, sendo que 156 genes apresentavam a transcrição nas fitas senso e anti-senso; 6 destes tiveram confirmadas a transcrição nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 229 genes diferencialmente expressos entre vermes adultos machos e fêmeas. A análise de expressão gênica entre 5 estágios de desenvolvimento do parasita mostrou dois tipos de conjuntos de dados: (i) 1423 genes diferencialmente expressos entre dois estágios subseqüentes de desenvolvimento e (ii) 342 genes com expressão enriquecida em um estágio exclusivamente. 68 destes são transcritos intrônicos que não possuem potencial codificador de proteinas. Um gene ortólogo ao receptor de TNF-α humano (SmTNFR) foi clonado e sequenciado. O transcrito SmTNFR possui 1967pb e codifica uma proteína de 599 aminoácidos. Outros 9 genes codificando elementos conservados da via de sinalização de TNF-α também foram identificados no conjunto de ESTs público, revelando uma via completa de sinalização de TNF-α no parasita. Por fim, identificamos com microarrays o conjunto de genes com expressão alterada pela adição de TNF-α humano em esquistossômulos e vermes adultos. 340 genes tiveram expressão alterada em vermes adultos utilizando a plataforma de cDNA. 411 genes sofreram mudanças de expressão em esquistossômulos e 1093 genes em vermes adultos detectados na plataforma de oligonucleotídeos. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação parasita-hospedeiro em nível molecular. / The parasite Schistosoma mansoni is one of major causative agents of schistosomiasis, a disease which affects 200 million people in the world. The parasite has a complex life cycle with six developmental stages in two hosts. S. mansoni has a sofisticated system of interaction with the hosts, permitting it to escape the immune response and to interact with molecules produced by the hosts. The effect of human TNF-α on adult parasite egg-laying has been described in the literature. The present work intended to analyse the gene expression profile of S. mansoni among its developmental stages, to evaluate the effect of human TNF-α on gene expression profile in two different developmental stages and to describe a homologous gene to human TNF-α receptor in S. mansoni. Two microarrays platfoms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another, comprised by 44000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With these platforms, we detected the expression of 5798 genes in adult worms, of which 156 showed transcription in sense and anti-sense strands; 6 of them had their expression levels confirmed by strand specific Real Time PCR. 229 genes were identified as differentially expressed between male and female adult worms. Gene expression analysis among 5 parasite developmental stages identified two data sets: (i) 1423 differentially expressed genes between two subsequent developmental stages and (ii) 342 expressed genes enriched in one exclusive stage. 68 of them are intronic transcripts with no protein-coding potential. An ortologue to human TNF-α receptor (SmTNFR) was cloned and sequenced. SmTNFR transcritpt has 1967bp and encodes a 599-amino acid protein. Other 9 genes encoding conserved elements of the TNF-α signaling pathway were identified among the public S. mansoni ESTs dataset, thus revealing a complete TNF-α signaling pathway in the parasite. Finally, we identified with microarrays the set of genes that have an altered gene expression upon exposure of schistosomula and adult worms to human TNF-α. 340 genes were identified with altered expression in adult worms using the cDNA platform. 411 genes changed their expression pattern in schistosomula and 1093 genes in adult worms using the oligonucleotide platform. This work represents an important contribution to the understanding of host-parasite interaction at the molecular level.

A disfunção mitocondrial pode ser um mecanismo chave associado à ocorrência de doenças metabólicas como o diabetes. Neste contexto, é importante obeservar os mecanismos envolvidos nesse processo. MicroRNAs (miRs) são conhecidos por regular a expressão de genes em vários processos fisiológicos, incluindo o metabolismo de glicose e ácidos graxos, biogênese mitocondrial, proliferação, diferenciação e morte celular no músculo esquelético. Usando análise \"in silico\" (Sfold2.2) identificamos 219 microRNAs que, potencialmente, se ligam à região 3 \'UTR do PGC-1?, um gene envolvido na biogênese mitocondrial e no metabolismo de glicose. Dos 219 candidatos, encontramos um alto valor de energia livre de hibridização entre o microRNA miR-696 e PGC-1? (-29,8 kcal / mol), sugerindo que o miR-696 poderia estar envolvido na regulação negativa do PGC-1? resultando em disfunção mitocondrial. Consistente com esta hipótese, observamos que a expressão do miR-696 apresentou-se aumentada nos músculos esqueléticos de dois modelos de camundongos com diabetes: camundongos diabéticos induzidos por STZ e camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Para compreender se o miR-696 regula a disfunção mitocondrial utilizamos células musculares C2C12 expostas a uma alta dose de ácido palmítico (700 µM) durante 24 horas, o que causou uma redução na expressão de genes mitocondriais, bem como no consumo de oxigênio. Vale destacar que a inibição do miR-696 através da transfecção de oligonucleotídeos antisenso (ASO) preveniu, parcialmente, a perda da função mitocondrial de células C2C12 tratadas com ácido palmítico. Curiosamente, não houve nenhuma alteração nos níveis de miR-696 em modelos envolvidos com a proteína AMPK, tal como em células C2C12 incubadas com uma droga ativadora de AMPK (AICAR) e no músculo esquelético de camundongos transgênicos superexpressando AMPK?2 com o domínio quinase inativo ou AMPK?3 com mutação de ativação crônica (R70Q). Em contraste, a expressão alterada de uma quinase relacionadas com a AMPK, SNF1-AMPK-related kinase (SNARK), recentemente demonstrada por ter sua expressão aumentada em virtude do envelhecimento, exerceu efeitos significativos sobre a expressão do miR- 696, como por exemplo sua redução dependente do knockdown de SNARK em células C2C12. Consistente com estes resultados, a superexpressão de SNARK em células C2C12 resultou no aumento da expressão do miR-696 e redução na expressão do PGC-1?, bem como no consumo de oxigénio. Nossos resultados demonstram que o estresse metabólico aumenta a expressão do miR-696 no músculo esquelético, que por sua vez inibe a sinalização da PGC-1? e a função mitocondrial. Ainda, apesar da AMPK não se apresentar como mediadora da expressão do miR-696, SNARK pode desempenhar um papel neste processo através do mecanismo de sinalização SNARKmiR-696-PGC-1?. / Mitochondrial dysfunction may be a key underlying mechanism for occurrence of metabolic disease and diabetes; thus elucidating how this process occurs is of great value. MicroRNAs (miRs) are known to regulate gene expression in several physiological processes including metabolism, mitochondrial biogenesis, proliferation, differentiation and cell death in multiple tissues including adipose tissue and skeletal muscle. Using \"in silico\" analysis (Sfold2.2) we identified 219 unique microRNAs that potentially bind to the 3\'UTR region of PGC-1?, a gene involved in mitochondrial biogenesis and glucose metabolism. Out of the 219 candidates, there was a high value of hybridization free energy between the microRNA miR-696 and PGC-1? (- 29.8 kcal/mol), suggesting that miR-696 could be involved in the downregulation of PGC-1?, which in turn could cause mitochondrial dysfunction. Consistent with this hypothesis we found that miR-696 expression was increased in the skeletal muscles of two mouse models of diabetes that have impaired mitochondrial function: STZ-induced diabetic mice and chronic high fat fed mice. To understand if miR-696 regulates mitochondrial dysfunction we used C2C12 muscle cells exposed to a high dose of palmitic acid (700 µM) for 24 hours, which caused a decrease in mitochondrial gene expression and in oxygen consumption. Importantly, inhibition of miR-696 using an antisense oligo approach rescued the mitochondrial function by restoration of mitochondrial-related genes and increased oxygen consumption in the palmitic acid-treated C2C12 cells. Interestingly, there was no change in miR-696 levels in models involved with AMPactivated protein kinase such as C2C12 cells incubated with AICAR, skeletal muscle from AMPK?2 dominant-negative transgenic mice, and transgenic mice overexpressing the activating R70Q AMPK mutation. In contrast, altered expression of the AMPK-related kinase, SNF1- AMPK-related kinase (SNARK), recently shown to increase with aging, had significant effects on miR-696 expression. Knockdown of SNARK in C2C12 cells significantly decreased miR-696. Consistent with these findings, SNARK overexpression in C2C12 cells increased miR-696 concomitant with a decrease in PGC-1? expression and decreased oxygen consumption. Our findings demonstrate that metabolic stress increases miR-696 expression in skeletal muscle which in turn inhibits PGC-1? signaling and mitochondrial function. While AMPK does not mediate miR-696 expression, SNARK may play a role in this process through a SNARK-miR- 696-PGC-1? signaling mechanism.

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.

Chiral &amp / #945 / -hydroxy and &amp / #945 / -acetoxy enones are important starting materials in the synthesis of many biologically active materials. In this work, enantiomerically pure &amp / #947 / -hydroxy enone and polyoxo cyclohexenones are synthesized starting from 1,3-cyclohexandione. In the first step, 1,3-cyclohexandione is protected under acid catalyzation and 3-methoxy-2-methyl-2-cyclohexen-1-one is obtained. &amp / #945 / &#039 / -Acetoxy enone is obtained by Mn(OAc)3 mediated oxidation which is an attractive alternative to other multi-step procedures in the literature. Enzymatic kinetic resolution is applied to the racemic form of this product and enantiomerically pure &amp / #945 / &#039 / -acetoxy enone and &amp / #945 / &#039 / -hydroxy enone is obtained. In this stage, for the screening of the reaction many enzymes were tried. Reduction of &amp / #945 / &#039 / -hydroxy enone furnished enantiopure &amp / #947 / -hydroxy enone.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4350402 bytes, checksum: bd6bf9393be337ef287514591c95188f (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The ectomycorrhizal association is a mutualistic interaction between plant roots and soil fungi that causes morphophysiological changes in the plant root system. The nutritional benefits result from the capacity of the fungus to increase the uptake of mineral nutrients by the host plant in exchange for photoassimilates. For the ectomycorrhizal association between Scleroderma laeve and Eucalyptus grandis, there is no information on which genes are decisive for the symbiosis and how they relate to the formation of ectomycorrhizas. Transcripts of the genes ras and ef1α were dentified as differentially expressed in many symbiotic associations and are related to signal transduction pathways and protein synthesis, respectively. Thus, the objectives of this work were to establish the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro, to isolate partial sequences of the genes ras and ef1α of S. laeve, and to evaluate the functional expression of these genes during ectomycorrhizal formation. Our works demonstrates the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro for the first time. The typical structures of ectomycorrhizas, such as the mantle and the Hartig net, were observed. At three days of contact between S. laeve and E. grandis roots the beginning of mantle formation could be observed. At 15 days, the mantle was completely formed, the epidermal cells were elongated, and the Hartig net formation was in progress. At 30 days, the ectomycorrhizas presented all the typical morphological structures fully developed. To evaluate gene expression during the association, partial sequences of ras and ef1α were isolated and the transcripts evaluated at the pre-symbiotic phase and at 3, 15 and 30 days after physical contact of the fungus with the plant roots. The transcripts of the gene ef1α were expressed at all evaluated times. Transcripts of ras were only detected in the ectomycorrhizas after three, 15, and 30 days of contact. These results are fundamental for a better understanding of the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis and suggest that ras-mediated signal transduction pathways may be functional during the establishment of the symbiosis between the fungus and the host roots. / A associação ectomicorrízica é uma interação mutualista entre raízes de plantas e fungos do solo, resultando em mudanças morfofisiológicas do sistema radicular das plantas. Os benefícios nutricionais advêm da capacidade do fungo em aumentar a absorção de nutrientes minerais pelas plantas, recebendo em troca os fotoassimilados. Na associação entre Scleroderma laeve e Eucalyptus grandis ainda não se tem informações de quais genes são decisivos e estão relacionados a este processo. Transcritos dos genes ras e ef1α foram identificados durante a formação da simbiose e sendo diferencialmente expressos na associação ectomicorrízica, e estão relacionados a vias de transdução de sinal e atuando na síntese protéica, respectivamente. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer a associação ectomicorrízica in vitro entre S. laeve e E. grandis, isolar sequências parciais dos genes ras e ef1α do fungo ectomicorrízico S. laeve, e avaliar a expressão funcional destes genes durante as fases de formação das ectomicorrizas. Este trabalho comprova a associação in vitro entre S. laeve e E. grandis, sendo registrada pela primeira vez. As estruturas típicas das ectomicorrizas, como a formação do manto fúngico e da rede de Hartig foram observadas. Nos tempos avaliados, em três dias de contato já havia a formação do manto fúngico. Aos 15 dias, o manto fúngico estava completamente formado, as células da epiderme alongadas e a rede de Hartig, em formação. Aos 30 dias, as ectomicorrizas apresentavam todas as estruturas típicas desenvolvidas. Para avaliar a expressão dos genes durante a associação, sequências parciais dos genes ras e ef1α foram isolados, e os transcritos destes genes foram avaliados na fase pré-simbiótica e aos três, 15 e 30 dias após o contato físico. Os transcritos do gene ef1α foram expressos durante todos os tempos avaliados. Os transcritos do gene ras foram detectados nas ectomicorrizas após três, 15 e 30 dias. Estes resultados são fundamentais para uma melhor compreensão da associação ectomicorrízica entre S. laeve e E. grandis e sugerem que as vias de transdução de sinais mediada por ras podem ser funcionais durante o estabelecimento da simbiose entre os fungos e as raízes de plantas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O desenvolvimento de mudanças neuropatológicas características da doença de Alzheimer (DA) nos portadores de síndrome de Down (SD) a partir dos 40 anos de idade e a alta taxa de indivíduos com SD em famílias nas quais a DA está presente sugerem uma susceptibilidade comum entre as duas doenças. Além disso, mulheres jovens (<35 anos na concepção) que tiveram filhos com a SD têm um risco cinco vezes maior de desenvolverem DA do que a população em geral. Esta alta suscetibilidade compartilhada poderia envolver um processo de envelhecimento acelerado, que levaria à SD em filhos de mães jovens e a um risco aumentado de demência nestas mães. Até o momento, os genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945;, envolvidos direta ou indiretamente na deposição cerebral de beta amilóide e reconhecidos dentre os determinantes genéticos para a DA, parecem também intervir na patogênese da demência na SD. Neste estudo, analisamos a freqüência dos alelos &#949;2, &#949;3 e &#949;4 do gene APOE e dos polimorfismos -48C>T no gene PSEN1 e -850C>T no gene TNF-&#945; em mães de portadores da SD em comparação com mães de indivíduos cromossomicamente normais. Para isto, amostras de DNA foram extraídas a partir do sangue periférico de 114 mães de portadores da trissomia livre do cromossomo 21 com idade inferior a 35 anos no momento da concepção e de 110 mães controle. Para a triagem dos polimorfismos dos alelos do gene APOE e dos polimorfismos PSEN1 -48C>T e TNF-&#945; -850C>T foi realizada a técnica de PCR seguida da digestão dos produtos amplificados com as endonucleases de restrição HhaI, HgaI e HincII, respectivamente. Os produtos digeridos foram analisados através de eletroforese em géis de poliacrilamida corados por prata. A análise estatística através do teste exato de Fisher revelou que não houve diferenças significativas entre as distribuições genotípicas observadas nas amostras caso e controle tanto para os alelos do gene APOE, quanto para os polimorfismos PSEN1-48C>T e TNF-&#945; -850C>T (c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectivamente). Diferenças significativas também não foram observadas tanto na análise da interação gênica multiplicativa entre os alelos dos genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945; como na interação entre estes alelos e polimorfismos participantes do metabolismo do folato (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). No Brasil, este é o primeiro relato da investigação destes genes entre as mães de indivíduos com SD. Nossos resultados sugerem que os alelos APOE e4, PSEN1-48 C e TNF-&#945; -850T não são fatores de risco independentes para a DA nestas mães. Entretanto, em virtude da complexidade tanto da SD como da DA, a análise de variantes em outros genes é de fundamental importância para melhor elucidar o aparecimento insidioso de DA em mães jovens que tiveram filhos com SD. / The development of neuropathological changes of Alzheimer's disease (AD) in patients with Down syndrome (DS) from 40 years old and the high rate of DS births in families of DA individuals suggest a common susceptibility between the two diseases. Besides a five-fold higher risk for AD has been reported in young mothers of DS individuals. This shared genetic susceptibility involving DS and AD could be due to an accelerated ageing process, leading to the birth of a DS child in the offspring of young mothers and to an increased risk of dementia among them. Between the genetic risk factors for AD, APOE, PSEN1 and TNF-&#945; genes are directly or indirectly involved in cerebral amyloid deposition and seem to play a role in the pathogenesis of dementia in DS. In this study, we analyzed the frequency of APOE alleles &#949;2, &#949;3 e &#949;4 and the polymorphisms -48C>T in the PSEN1 gene and -850C>T in the TNF-&#945; gene in DS young mothers in comparison to mothers who had had chromosomicaly normal children. With this purpose, DNA samples were extracted from 114 mothers of DS individuals (full trisomy 21) with less than 35 years-old at conception, and from 110 control mothers. For the screening of the APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms, polymerase chain reaction (PCR) was accomplished, followed by the digestion of the amplification products with the restriction endonucleases HhaI, HgaI and HincII, respectively. The digested products were analysed by polyacrilamide gels electrophoresis followed by silver staining. No significant differences were observed between the genotype distributions observed in control and case samples with respect APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms (Fisher exact test: c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectively). No differences were also observed in the gene multiplicative interaction analysis for APOE, PSEN1 and TNF-&#945; alleles and in the interaction of these alleles with folate pathway polymorphisms (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). This is the first study reporting the investigation of these genes in Brazilian DS mothers. Our findings suggest that APOE &#949;4, PSEN1 -48C and TNF-&#945; -850T alleles are not independent risk factors for AD in young DS mothers. However, considering the complexity of both DS and AD, polymorphisms in other genes should be investigated to evaluate the actual relationship between the genetic risk factors and AD in DS young mothers.

Os desreguladores endócrinos são compostos micropoluentes de ação deletéria que causam efeitos aos animais e aos seres humanos. Estes vêm trazendo a várias décadas, problemas relacionados à má formação ou ainda infertilidade de várias espécies. A presença destes compostos na ordem de ng L-1 já é capaz de gerar efeitos nocivos ao sistema endócrino. Este trabalho visou à determinação da presença e quantidade de alguns destes compostos como 17&#945;-etinilestradiol, bisfenol A e estrona entre outros, nas águas do rio Arroio Fundo, localizado em Jacarepaguá no RJ que possui um índice de qualidade de água ruim. A primeira etapa deste trabalho foi a implementação e validação de metodologia para determinação do 17&#945;-etinilestradiol por cromatografia líquida acoplada a detector de fluorescência onde foram estabelecido limite de detecção, de quantificação e linearidade conforme orientação do Inmetro (2010). Além da avaliação das amostras ambientais através da metodologia estabelecida. Na etapa subsequente foram realizados os experimentos relativos à determinação dos desreguladores endócrinos através da espectrometria de massas por detector tipo tandem quadrupolo, onde também foram realizados os procedimentos de validação e determinação dos compostos bisfenol A e estrona que não foram suscetíveis a efeito de matriz durante a ionização, que acabou impedindo a determinação de outros desreguladores endócrinos. Os resultados indicam que não há redução da presença dos desreguladores endócrinos detectados, e de outros compostos orgânicos também detectados, mas não identificados, entre os pontos a montante e a jusante da Unidade de Tratamento do Rio Arroio Fundo. Todavia em função do grande efeito de matriz oriundo do fato da amostra ser de extrema complexidade, não foi possível realizar uma identificação e quantificação de todos os compostos alvos. / Endocrine disrupters are compounds micropollutants of deleterious effects that cause effects to animals and humans has brought these problems to several decades related to poor training or infertility of various species. The presence of these compounds in the ng L-1 order is already capable of generating negative effects on the endocrine system. This work aimed at determining the presence and amount of some of these compounds as 17&#945;-ethinylestradiol, bisphenol A and estrone among others, in the waters of the river Arroio Fundo, located in Jacarepaguá in Rio de Janeiro that has a bad water quality index. The first stage of this work was the implementation and validation of a method for determination of 17&#945;-ethinylestradiol by liquid chromatography-fluorescence detection which were established limit of detection, quantification and linearity as directed by Inmetro (2010). Besides the evaluation of the samples through the established methodology. In subsequent step were carried out experiments on the determination of endocrine disruptors by tandem quadrupole mass spectrometry detector, were being performed validation procedures and determination of the compounds bisphenol A and estrone, which were not susceptible to matrix effect during ionization, which prevented the determination of other endocrine disrupters. The results indicate that there is no reduction of the presence of detected endocrine disruptors and other organic compounds, also detected but not identified, between the points upstream and downstream of Arroio Fundo treatment plant. However due to the large matrix effect originating from the fact that the sample be extremely complex, could not perform an identification and quantification of all target compounds.

Os desreguladores endócrinos são compostos micropoluentes de ação deletéria que causam efeitos aos animais e aos seres humanos. Estes vêm trazendo a várias décadas, problemas relacionados à má formação ou ainda infertilidade de várias espécies. A presença destes compostos na ordem de ng L-1 já é capaz de gerar efeitos nocivos ao sistema endócrino. Este trabalho visou à determinação da presença e quantidade de alguns destes compostos como 17&#945;-etinilestradiol, bisfenol A e estrona entre outros, nas águas do rio Arroio Fundo, localizado em Jacarepaguá no RJ que possui um índice de qualidade de água ruim. A primeira etapa deste trabalho foi a implementação e validação de metodologia para determinação do 17&#945;-etinilestradiol por cromatografia líquida acoplada a detector de fluorescência onde foram estabelecido limite de detecção, de quantificação e linearidade conforme orientação do Inmetro (2010). Além da avaliação das amostras ambientais através da metodologia estabelecida. Na etapa subsequente foram realizados os experimentos relativos à determinação dos desreguladores endócrinos através da espectrometria de massas por detector tipo tandem quadrupolo, onde também foram realizados os procedimentos de validação e determinação dos compostos bisfenol A e estrona que não foram suscetíveis a efeito de matriz durante a ionização, que acabou impedindo a determinação de outros desreguladores endócrinos. Os resultados indicam que não há redução da presença dos desreguladores endócrinos detectados, e de outros compostos orgânicos também detectados, mas não identificados, entre os pontos a montante e a jusante da Unidade de Tratamento do Rio Arroio Fundo. Todavia em função do grande efeito de matriz oriundo do fato da amostra ser de extrema complexidade, não foi possível realizar uma identificação e quantificação de todos os compostos alvos. / Endocrine disrupters are compounds micropollutants of deleterious effects that cause effects to animals and humans has brought these problems to several decades related to poor training or infertility of various species. The presence of these compounds in the ng L-1 order is already capable of generating negative effects on the endocrine system. This work aimed at determining the presence and amount of some of these compounds as 17&#945;-ethinylestradiol, bisphenol A and estrone among others, in the waters of the river Arroio Fundo, located in Jacarepaguá in Rio de Janeiro that has a bad water quality index. The first stage of this work was the implementation and validation of a method for determination of 17&#945;-ethinylestradiol by liquid chromatography-fluorescence detection which were established limit of detection, quantification and linearity as directed by Inmetro (2010). Besides the evaluation of the samples through the established methodology. In subsequent step were carried out experiments on the determination of endocrine disruptors by tandem quadrupole mass spectrometry detector, were being performed validation procedures and determination of the compounds bisphenol A and estrone, which were not susceptible to matrix effect during ionization, which prevented the determination of other endocrine disrupters. The results indicate that there is no reduction of the presence of detected endocrine disruptors and other organic compounds, also detected but not identified, between the points upstream and downstream of Arroio Fundo treatment plant. However due to the large matrix effect originating from the fact that the sample be extremely complex, could not perform an identification and quantification of all target compounds.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O desenvolvimento de mudanças neuropatológicas características da doença de Alzheimer (DA) nos portadores de síndrome de Down (SD) a partir dos 40 anos de idade e a alta taxa de indivíduos com SD em famílias nas quais a DA está presente sugerem uma susceptibilidade comum entre as duas doenças. Além disso, mulheres jovens (<35 anos na concepção) que tiveram filhos com a SD têm um risco cinco vezes maior de desenvolverem DA do que a população em geral. Esta alta suscetibilidade compartilhada poderia envolver um processo de envelhecimento acelerado, que levaria à SD em filhos de mães jovens e a um risco aumentado de demência nestas mães. Até o momento, os genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945;, envolvidos direta ou indiretamente na deposição cerebral de beta amilóide e reconhecidos dentre os determinantes genéticos para a DA, parecem também intervir na patogênese da demência na SD. Neste estudo, analisamos a freqüência dos alelos &#949;2, &#949;3 e &#949;4 do gene APOE e dos polimorfismos -48C>T no gene PSEN1 e -850C>T no gene TNF-&#945; em mães de portadores da SD em comparação com mães de indivíduos cromossomicamente normais. Para isto, amostras de DNA foram extraídas a partir do sangue periférico de 114 mães de portadores da trissomia livre do cromossomo 21 com idade inferior a 35 anos no momento da concepção e de 110 mães controle. Para a triagem dos polimorfismos dos alelos do gene APOE e dos polimorfismos PSEN1 -48C>T e TNF-&#945; -850C>T foi realizada a técnica de PCR seguida da digestão dos produtos amplificados com as endonucleases de restrição HhaI, HgaI e HincII, respectivamente. Os produtos digeridos foram analisados através de eletroforese em géis de poliacrilamida corados por prata. A análise estatística através do teste exato de Fisher revelou que não houve diferenças significativas entre as distribuições genotípicas observadas nas amostras caso e controle tanto para os alelos do gene APOE, quanto para os polimorfismos PSEN1-48C>T e TNF-&#945; -850C>T (c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectivamente). Diferenças significativas também não foram observadas tanto na análise da interação gênica multiplicativa entre os alelos dos genes APOE, PSEN1 e TNF-&#945; como na interação entre estes alelos e polimorfismos participantes do metabolismo do folato (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). No Brasil, este é o primeiro relato da investigação destes genes entre as mães de indivíduos com SD. Nossos resultados sugerem que os alelos APOE e4, PSEN1-48 C e TNF-&#945; -850T não são fatores de risco independentes para a DA nestas mães. Entretanto, em virtude da complexidade tanto da SD como da DA, a análise de variantes em outros genes é de fundamental importância para melhor elucidar o aparecimento insidioso de DA em mães jovens que tiveram filhos com SD. / The development of neuropathological changes of Alzheimer's disease (AD) in patients with Down syndrome (DS) from 40 years old and the high rate of DS births in families of DA individuals suggest a common susceptibility between the two diseases. Besides a five-fold higher risk for AD has been reported in young mothers of DS individuals. This shared genetic susceptibility involving DS and AD could be due to an accelerated ageing process, leading to the birth of a DS child in the offspring of young mothers and to an increased risk of dementia among them. Between the genetic risk factors for AD, APOE, PSEN1 and TNF-&#945; genes are directly or indirectly involved in cerebral amyloid deposition and seem to play a role in the pathogenesis of dementia in DS. In this study, we analyzed the frequency of APOE alleles &#949;2, &#949;3 e &#949;4 and the polymorphisms -48C>T in the PSEN1 gene and -850C>T in the TNF-&#945; gene in DS young mothers in comparison to mothers who had had chromosomicaly normal children. With this purpose, DNA samples were extracted from 114 mothers of DS individuals (full trisomy 21) with less than 35 years-old at conception, and from 110 control mothers. For the screening of the APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms, polymerase chain reaction (PCR) was accomplished, followed by the digestion of the amplification products with the restriction endonucleases HhaI, HgaI and HincII, respectively. The digested products were analysed by polyacrilamide gels electrophoresis followed by silver staining. No significant differences were observed between the genotype distributions observed in control and case samples with respect APOE alleles, PSEN1 -48C>T and TNF-&#945; -850C>T polymorphisms (Fisher exact test: c2 =4,26; g.l. = 4; P =0,37; c2 =0,22; g.l. = 2; P =0,89; c2 = 4,24; g.l. = 2; P = 0,12, respectively). No differences were also observed in the gene multiplicative interaction analysis for APOE, PSEN1 and TNF-&#945; alleles and in the interaction of these alleles with folate pathway polymorphisms (MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, MTR 2756A>G, RFC-1 80G>A, TC 776C>G e CBS 844ins68). This is the first study reporting the investigation of these genes in Brazilian DS mothers. Our findings suggest that APOE &#949;4, PSEN1 -48C and TNF-&#945; -850T alleles are not independent risk factors for AD in young DS mothers. However, considering the complexity of both DS and AD, polymorphisms in other genes should be investigated to evaluate the actual relationship between the genetic risk factors and AD in DS young mothers.