Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A microalga cianofÃcea Spirulina platensis tem sido comercializada e estudada devido ao seu alto valor nutricional, possuindo vitaminas, minerais, proteÃnas, Ãcidos graxos poli-insaturados, carotenÃides, ficobilinas e polissacarÃdeos com propriedades terapÃuticas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os teores de -caroteno e -tocoferol presentes na microalga S. platensis cultivada em laboratÃrio com diferentes fotoperÃodos. A microalga S. platensis foi cultivada em seis aquÃrios de 20 L sob quatro condiÃÃes diferentes de iluminaÃÃo. Um cultivo foi submetido a um fotoperÃodo de 8 horas de luz (L) e 16 de escuro (E), o segundo a 12 L e 12 E, o terceiro a 16 L e 8 E e o Ãltimo exposto a 24 h de iluminaÃÃo constante. Os aquÃrios foram dispostos lado a lado em duas incubadoras de madeira, com temperatura ambiente de mantida em 28  2ÂC com auxÃlio de um âcoolerâ (220 V) e iluminÃncia na superfÃcie da Ãgua em torno de 78,1 μ E cm-2 s-1 fornecida por duas lÃmpadas fluorescentes de 40 W. Os cultivos foram monitorados por espectrofotometria a 680 nm e pela contagem dos filamentos (tricomas) microalgais utilizando um microscÃpio Ãptico comum. A anÃlise simultÃnea dos carotenos e tocoferÃis foi realizada por cromatografia lÃquida de alta eficiÃncia em uma coluna Waters Spherisorb-Hichrom S5 ODS-2 (4,6 x 250 mm) com uma fase mÃvel de MeOH: THF (90:10, v/v), fluxo de 1,5 mL min-1 e detecÃÃo a 450 nm e 292 nm, respectivamente. A extraÃÃo de -caroteno foi realizada suspendendo-se 0,1 g de Spirulina liofilizada em 10 mL de metanol:Ãgua Milli-Q (90:10, v/v). Para a saponificaÃÃo dos lipÃdios, a mistura foi homogeneizada com 7% de hidrÃxido de potÃssio, levada ao banhomaria a 70ÂC por 30 min e submetida à partiÃÃo em n-hexano que foi evaporado. O resÃduo foi suspenso em 1 mL de metanol e 100 μL foram injetados manualmente, em duplicata, no sistema cromatogrÃfico. O -caroteno foi detectado na biomassa obtida de todos os cultivos e o -tocoferol apenas nos cultivos com fotoperÃodos de 8 L e 16 E e de 12 L e 12 E, enquanto o -tocoferol nÃo foi detectado. O teor de -caroteno variou de acordo com a intensidade luminosa e quando as culturas foram expostas a 24 h de iluminaÃÃo constante, atingiram mais rapidamente a produtividade mÃxima e apresentaram o maior teor de -caroteno / The microalga cyanophyceae Spirulina platensis has been commercialized and studied due to its high nutritional value. It has shown to be a rich source of a great variety of vitamins, minerals, proteins, polyunsaturated fatty acids, carotenoids, phycobilins, and polysaccharides that exhibit potential therapeutic properties. The aim of the present work was to evaluate the content of -carotene and -tocopherol in S. platensis cultivated in laboratory under different conditions of photoperiods. S. platensis was cultivated within six 20-liter reservoirs under four different illumination conditions. The first culture was grown under 8- hour light (L) and 16-hour dark (D) photoperiod; the second, 12 L and 12 D photoperiod; the third, 16 L and 8 D photoperiod, and the forth cultivation condition was constant illumination. The reservoirs were placed side by side in two wood chambers, where room temperature was kept at 28  2ÂC with a cooler (220 V). The water surface illumination of 78.1 μE cm-2 s-1 was supplied by two 40-Watt fluorescent lamps. The cultures were monitored by spectrometry at 680 nm and by counting microalga filaments (trichomes) under an optical microscope. The simultaneous analysis of carotenoids and tocopherols was performed by high performance liquid chromatography in a Waters Spherisorb-Hichrom S5 ODS-2 (4.6 x 250 mm) column using MeOH:THF (90:10, v/v) as mobile phase, delivered at 1.5 mL min-1. The detector was set at 450 nm and 292 nm for carotenes and tocopherols, respectively. For the extraction of both compounds, three portions of 0.1 g lyophilized Spirulina were suspended in 10 mL methanol:MiliQ water (90:10, v/v). The mixture was homogenized with a 7% potassium hydroxide aqueous solution, brought to a water bath at 70ÂC for 30 min, for saponification, followed of partitioning into n-hexane which was evaporated to dryness. The residues were suspended in 1 mL methanol, and 100 μL aliquots were manually injected in the chromatographic system. -Carotene was detected in the biomass obtained from all the cultures and a-tocopherol was detected only in 8 L and 16 D and 12 L and 12 D photoperiods cultures. -Tocopherol, on the other hand, was not detected. The content of -carotene varied with illumination intensity and in the cultivation performed under constant illumination both maximum productivity and highest -carotene content were reached rapidly

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In the pursue for a molecular improvement for BCG and thus enable the development of a widely used method of prophylaxis, a recombinant BCG was produced by electroporation of BCG Moreau, using three different recombinant plasmid constructions (pLA71, pLA73 and pMIP12), all of them containing the fusion protein CMX coding sequence. However, only the pLA71 transformant expressed the CMX fusion protein in the western blot. In order to evaluate the profile of memory B cells, the specific antibodies against CMX and the efficacy of the vaccine, BALB/c mice were immunized with a single dose of BCG or rBCG-CMX or PBS (control). Serum samples were collected from all animals 30, 60 and 90 days after the immunization and the induction of memory B cells was assessed by flow citometry of the splenocytes cell suspensions. Ninety days after the last immunization, animals were challenged with Mtb H37Rv by the intravenous route and forty five days later, lungs were harvested to analyze the bacterial load and the level of inflammation induced by the infection in immunized mice. Even though no specific antibodies against rCMX, rHspX and rMPT-51 proteins were detected, animals immunized with rBCG-CMX showed specific IgG1 (p<0,0001) and IgG2a (p=0,0007) levels against the BCG culture sediment, higher than those induced in the animals vaccinated with BCG. Besides, the rBCG-CMX vaccine was able to induced delayed long lived memory B cells (p=0,0069), reduced the bacterial load in the lungs (p=0,0041) in a similar way as BCG and generated less tissue damage when compared to BCG Moreau. The recombinant BCG vaccine expressing the CMX fusion protein induced specific antibodies for BCG extract and B cell response to stronger memory than BCG, but, the protection induced by both vaccines (BCG and rBCG) were similar. / A tuberculose (TB) constitui um problema de saúde pública mundial e apesar da recente redução da incidência de novos casos e de mortes em todo mundo ainda há países em desenvolvimento onde estes índices ainda não são tão otimistas. A única vacina indicada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) contra a TB é a BCG que embora esta seja eficiente contra as formas graves de TB na infância, apresenta uma eficácia questionável contra a tuberculose pulmonar (TBP) em adultos. Com o objetivo de contribuir para o melhoramento molecular da BCG e possibilitar assim o aprimoramento de um método de profilaxia amplamente utilizado, foram produzidos, por eletroporação da BCG (subcepa Moreau), três recombinantes utilizando diferentes construções plasmidiais (pLA71, pLA73 e pMIP12), ambas, contendo sequência codificadora para a proteína de fusão CMX de Mycobacterium tuberculosis. No entanto, apenas o transformante utilizando o pLA71 apresentou expressão da proteína CMX no imunoblot. Com o objetivo de avaliar o perfil de células B de memória, anticorpos específicos para CMX e a eficácia da vacina, camundongos BALB/c foram imunizados com dose única de BCG ou rBCG-CMX ou PBS (controle). A avaliação do perfil de células B de memória induzido pela imunização foi realizada 30 e 90 dias após a imunização, pela marcação de esplenócitos para citometria de fluxo. Noventa dias após a imunização, os animais foram desafiados, via endovenosa, com Mtb H37Rv e 45 dias após, foram obtidos pulmão dos camundongos para determinação da carga bacilar e do nível de inflamação induzido pela infecção nos camundongos imunizados. Não foram detectados níveis séricos de anticorpos específicos para proteínas rCMX, rHspX e rMPT-51, no entanto, animais vacinados com a rBCG-CMX apresentaram níveis de anticorpos séricos, das classes IgG1 (p<0,0001) e IgG2a (p=0,0007), específicos para extrato de BCG superiores ao induzido em animais vacinados com a BCG. Além disso, a vacina rBCG-CMX mostrou-se capaz de induzir tardiamente células B de memória de vida longa (p=0,0069); reduzir a carga bacilar no pulmão de camundongos infectados com Mtb (p=0,0041), semelhante ao BCG; e promover menor dano tecidual no pulmão de animais vacinados e infectados com Mtb. A vacina BCG recombinante expressando a proteína de fusão CMX mostrou-se capaz de induzir anticorpos específicos para extrato de BCG e resposta de células B de memória mais robustas do que a BCG, entretanto, a proteção induzida por ambas as vacinas (BCG e rBCG) foram semelhantes.

Neste trabalho foram realizados estudos de uma rota sintética comum para a obtenção de duas lactonas sesquiterpênicas, conocenolido A e conocenolido B. Estes compostos, por apresentarem um novo esqueleto carbônico, fazem parte de uma classe de produtos naturais sesquiterpênicos denominados tremulanos, dos quais se destacam por apresentarem a ruptura de uma ligação C-C do esqueleto básico, de onde vem a denominação 5,6-seco-tremulanos. Para fins de estudos sintéticos podemos destacar, na molécula desses tremulanos, as seguintes unidades estruturais: a) um ciclopentano substituído, b) uma ligação dupla tetrassubstituída e c) um anel de lactona (uma -lactona presente em conocenolido A e uma -lactona em conocenolido B). Em nossa proposta inicial, a estrutura do anel de ciclopentano seria preparada por contração de anel de uma epoxiciclo-hexanona. Ao contrário, porém, do esperado com base nos exemplos da literatura, esta reação não produziu nada de 2-formilciclopentanona. A estrutura do anel de ciclopentano desejada foi, então, preparada por um caminho alternativo partindo da cetona metílica e vinílica. Nos estudos relacionados à preparação da ligação dupla tetrassubstituída foram empregadas as reações clássicas de olefinação (Wittig e HWE) e reações de condensação (Stobbe e Reformatsky). O trabalho com fosforanas (Reagente de Wittig) envolveu um estudo de dinâmica rotacional destes compostos por RMN. Os estudos da reação tipo Reformatsky foram realizados tanto no contexto de preparação de olefinas quanto na obtenção de lactonas (derivados do ácido paracônico). Um estudo detalhado das estruturas destas lactonas foi realizado por meio da determinação estrutural dos derivados do ácido paracônico. / In this work were realized studies towards a common synthetic route for the preparation of two sesquiterpenes lactones, conocenolide A and conocenolide B. These compounds belong to a class of sesquiterpenoids known as tremulanes presenting a novel carbon skeleton. A special structural feature of both lactones that set them apart from class is the lack of a carbon-carbon bond in the basic skeleton, so their denomination 5,6-seco-tremulanes. For the purpose of synthetic studies, we highlight in the molecule of these tremulanes the following structural units: a) one substituted cyclopentane, b) one tetrasubstitued double bond and c) one lactone ring ( one -lactone ring is present in conocenolide A and one -lactone ring is present in conocenolide B). In our initial proposal, the structure of the cyclopentane ring would be prepared by ring contraction of an epoxycyclohexanone. However, in spite of some literature examples, the ring contraction to provide the 2-formyl-cyclopentanone did not occur. The desired cyclopentane ring was prepared by an alternative route from methyl vinyl ketone. The studies related to the preparation of tetrasubstituted double bond was based on classical olefination reactions (Wittig and Horner-Emmons) and condensation reactions (Stobbe and Reformatsky). In addition, a NMR study dealing with the rotational dynamics of phosphoranes was realized. Studies exploring the versatility of a Reformatsky-type reaction were carried out both in the context of olefin preparation as well as for the preparation of lactones (paraconic acid derivatives). A detailed study of the structures of these lactones was accomplished through structural determination of paraconic acid derivatives.

Os pigmentos naturais, além de fornecerem cor e beleza aos diferentes organismos, desempenham importantes funções e ações biológicas, como as funções vitais de fotossíntese, respiração celular e a ação antioxidante. Assim, o presente estudo investigou os potenciais citotóxicos, genotóxicos e protetores dos pigmentos naturais clorofila b (CLb) e luteína (LT), isolados e em combinação, em doses normalmente consumidas na dieta. Para isso foram utilizados o teste do micronúcleo em células da medula óssea e do sangue periférico e o ensaio cometa em células do sangue periférico, rim e fígado de camundongos. Também foram avaliados parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo, glutationa e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no rim e no fígado, além de glutationa e catalase no sangue periférico, a fim de investigar o papel antioxidante desses pigmentos. A capacidade da LT de alterar a expressão de genes de resposta ao estresse oxidativo e defesa antioxidante foi avaliada no tecido hepático dos camundongos utilizando a técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR) array. Para a verificação da atividade protetora dos pigmentos, a cisplatina (cDDP) foi utilizada como indutor de danos oxidativos e ao DNA. Adicionalmente, foram avaliados os potenciais citotóxicos, genotóxicos e antioxidantes da LT em cultura de células de hepatocarcinoma humano por meio do teste do MTT [3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio], ensaio cometa e avaliação de parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo, a fim de se estabelecer comparações entre resultados in vitro e in vivo, bem como propor mecanismos de ação para os efeitos antigenotóxicos da LT. Nossos resultados mostraram que os tratamentos com os pigmentos, tanto a LT quanto a CLb, isolados ou em combinação não causaram qualquer dano ao material genético nos testes empregados e ofereceram proteção frente aos danos induzidos no DNA pela cDDP tanto in vitro como in vivo. Efeitos antioxidantes para ambos pigmentos foram observados no sangue periférico e nos tecidos renais e hepáticos, e a LT também melhorou os parâmetros de estresse oxidativo avaliados in vitro. Na avaliação da expressão de genes de resposta ao estresse oxidativo em células do fígado de camundongos, a cDDP diminuiu a expressão 16 genes, entre eles, importantes genes responsáveis pela manutenção do estado redox da célula. Além disso, a LT mostrou que pode atuar como antioxidante não só agindo diretamente no seqüestro de radicais livres, mas também, induzindo a expressão de 11 dos 84 genes avaliados, e de 15 genes quando associada à cDDP. Em resumo, nossos resultados mostraram que a LT e a CLb, isoladas ou em combinação, nas doses consumidas normalmente na dieta, podem contribuir para a promoção da saúde considerando seus efeitos antigenotóxicos e antioxidantes. / The natural pigments, in addition to providing color and beauty to the different organisms, play important biological role, including the vital functions of photosynthesis, cellular respiration and antioxidant action. Thus, this study investigated the genotoxic and protective potential of natural pigments, alone and in combination, chlorophyll b (CLb) and lutein (LT), in concentrations usually consumed in the diet. For this purpose, we used the micronucleus test in bone marrow and peripheral blood cells and the comet assay in peripheral blood, kidney and liver of mice. Biochemical parameters of oxidative stress were also evaluated, such as glutathione and thiobarbituric acid reactive substances in the kidney and liver and catalase and glutathione in peripheral blood in order to investigate the antioxidant properties of these pigments. The ability of lutein to alter the expression of genes involved in oxidative stress response and antioxidant defense was evaluated in liver tissue of mice using the technique of real-time PCR (RT-qPCR) array. To verify the protective activity of the pigments, cisplatin (cDDP) was used as an inducer of oxidative stress and DNA damage. Additionally, we assessed the genotoxic and antioxidant potential of LT in cell cultures of human hepatocellular carcinoma using the test of MTT [3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium], comet assay and assessment of biochemical parameters of oxidative stress, in order to make comparisons between results in vitro and in vivo, as well to propose mechanisms to antigenotoxic effects of LT. Our results showed that treatment with the pigments, both the LT and the CLb, alone or in combination, did not cause any DNA damage in the tests employed and offered protection against DNA damage induced by cDDP in both in vitro and in vivo. Antioxidant effects were observed for both pigments in peripheral blood, kidney and liver, and LT also improved the oxidative stress parameters measured in vitro. In the evaluation of the expression of genes involved in response to oxidative stress in liver cells of mice, cDDP decreased the expression of 16 genes, among them, important genes responsible for maintaining the redox status of the cell. Moreover, LT showed that it can act as an antioxidant not only acting directly in the scavenging of free radicals, but also by inducing the expression of 11 of the 84 genes evaluated and 15 when LT was associated to cDDP. In summary, our results showed that the LT and CLb, alone or in combination, at concentrations usually consumed in the diet can contribute to health promotion considering their antigenotoxic and antioxidant effects.

A caracterização das flutuações dos resíduos da proteína em torno do seu estado nativo é essencial para estudar mudanças conformacionais, interação proteína-proteína e interação proteína-ligante. Tal caracterização pode ser capturada pelo modelo de rede gaussiana (GNM). Este modelo tem sido modificado e novas propostas têm surgido nos últimos anos. Nesta Tese, apresentamos um estudo sobre como melhorar o GNM e exploramos o seu desempenho em predizer os fatores-B experimentais. Modelos de redes elásticas são construídos a partir das coordenadas experimentais dos levando em consideração pares de átomos de C? distantes entre si até um dado raio de corte Rc . Estes modelos descrevem as interações entre os atómos por molas com a mesma constante de força. Desenvolvemos um método baseado em simulações numéricas com um campo de forças simplificado para atribuir pesos a estas constantes de mola. Este método considera o tempo em que dois átomos de C? permanecem conectados na rede durante o desenovelamento parcial, estabelecendo assim uma forma de medir a intensidade de cada ligação. Examinamos dois diferentes campos de forças simplificados e exploramos o cálculo desses pesos a partir do desenovelamento das estruturas nativas. Nós comparamos o seu desempenho na predição dos fatores-B com outros modelos de rede elástica. Avaliamos tal desempenho utilizando o coeficiente de correlação entre os fatores-B preditos e experimentais. Mostramos como o nosso modelo pode descrever melhor os fatores-B / The characterization of the fluctuations in protein residues around its native state is essential to study conformational changes, protein binding interaction and protein-protein interaction. Such characterization can be captured by simple elastic network models as the Gaussian Network Model (GNM). This model has been modified and new proposals have emerged in recent years. In this Thesis we propose an extended version of GNM, namely wGNM. Elastic network models are built on the experimental C? coordinates,and they only take the pairs of C? atoms within a given cutoff distance Rc into account. These models describe the interactions by elastic springs with the same force constant to predicted the experimental B-factors, providing insights into the structure-function properties of proteins. We have developed a method based on numerical simulations with a simple coarse-grained force field, to attribute weights to these spring constants. This method considers the time that two C? atoms remain connected in the network during partial unfolding, establishing a means of measuring the strength of each link. We examined two different coarse-grained force fields and explored the computation of these weights by unfolding native structures. We compare the B-factors predicted by different elastic network models with the experimental ones employing the correlation coefficient between these two quantities. We show that wGNM performs better and consequently provides better evaluation of the B-factors

As meningites representam um importante agravo no quadro sanitário nacional, por suas características epidemiológicas e por seu impacto sócio-econômico. O Haemophilus influenzae tipo b (HIB), causa infecções respiratórias e doenças invasivas como meningites, pneumonias, epiglotites, sinusites, bacteremias, otites e artrites. Entre essas enfermidades, a meningite tem sido a mais estudada, em virtude de sua alta morbi-mortalidade e por ser de notificação compulsória. A proposta deste trabalho foi a de avaliar a tendência, em série histórica, da morbimortalidade e da letalidade das meningites caudadas por HIB no Brasil, como uma alternativa para avaliação do impacto da vacinação específica. O estudo seguiu um delineamento observacional do tipo ecológico e relativo ao período de 1983 a 2002. Foram calculados os coeficientes de incidência, mortalidade e letalidade de meningites por HIB, a partir de base de dados do Ministério da Saúde e da Fundação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Para a análise de tendência destes indicadores foram estimadas retas de predição, com intervalos de confiança de 95%. Os softwares utilizados para a fase de gerenciamento e para a análise de dados foram: Excel, Epiinfo e Stata. No Brasil, entre 1983 e 2002, foram notificados 23.921 casos de meningites por HIB, dos quais 10.524 (43,99%) em menores de 1 ano e 9.269 (38,75%) na faixa de 1 a 4 anos. Os coeficientes de incidência, mortalidade e letalidade de maior magnitude foram observados nas faixas etárias de menores de 1 ano e de 1 a 4 anos. A partir de 1988, houve incremento na magnitude dos coeficientes de incidência e mortalidade. As regiões Norte e Nordeste apresentaram menor magnitude para esses indicadores, enquanto que para a letalidade, a região Nordeste apresentou indicadores de maior magnitude em menores de 1 ano. De modo geral, embora a letalidade tenha apresentado um padrão de declínio desde o inicio da série, sua magnitude permaneceu elevada até 2001. O impacto da vacinação sobre a letalidade, apenas a partir de 2002, sugere que esta pode levar até três anos, em média, para exercer efeito sobre o prognóstico das meningites por HIB. Com exceção da região Nordeste, a tendência para a incidência e a mortalidade no Brasil e regiões, foi semelhante, no período prévacinação (ascensão), detectando-se declínio após a introdução da vacina na rotina do Programa Nacional de Imunização. No Brasil e nas regiões Norte, Nordeste, Sul e Sudeste (nesta, em menores de 1 ano), a tendência da letalidade foi de declínio em toda a série. Nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, o impacto da introdução da vacina sobre a incidência e a mortalidade foi mais precoce (1999-2000), em relação às outras regiões do estudo, talvez pelo fato dessas regiões terem apresentado cobertura vacinal mais elevada. O impacto da vacinação foi mais evidente sobre a incidência e a mortalidade do que sobre a letalidade. Os resultados revelaram um impacto positivo das estratégias de vacinação contra HIB, no Brasil e macrorregiões, inclusive em faixas etárias não vacinadas. Recomenda-se a monitorização contínua desses agravos, através de ações de Vigilância Epidemiológica, com aprimoramento do Sistema de Informação em Saúde. / Meningitis is an important disease within the national health system, due to its epidemiological characteristics and socioeconomic impact. The Haemophilus influenzae (HIB) type B causes respiratory infections as well as invasive diseases such as meningitis, pneumonias, epiglottitis, sinusitis, bacteremias, otitis and arthritis. Among these diseases, the meningitis has been the most studied due to its high morbi-mortality rate and also because requires compulsory notification. The purpose of this study was to evaluate the trend, considering the history series, regarding morbi-mortality and case fatality rates of meningitis caused by Hib in Brazil, as an alternative for the evaluation of the impact of a specific vaccination. This research was an ecologic observation from 1983 to 2002. The author calculated the incidence, mortality and case fatality rates of Hib meningitis, based on data from the National Health Department and the Geography and Statistics Brazilian Foundation Institute. In order to analyze these indicators\' trends, authors estimated prediction lines, with confidence intervals of 95%. The softwares used to manage and analyze data were: Excel, Epiinfo and Stata. In Brazil, from 1983 to 2002, 23.921 cases of Hib meningitis were notified. Among them, 10.524 (43.99%) in babies with less than one year and 9.269 (38.75%) in children with age varying from 1 to 4 years. The higher magnitude of incidence, mortality and case fatality rates were observed in the ages less than 1 year and varying from 1 to 4 years. Since 1988, the author observed an increment in the magnitude of the incidence and mortality rates. The North and Northeast regions presented a lower magnitude for these indicators, while for case fatality, the Northeast region presented indicators of higher magnitude in babies with age less than 1 year old. In general, although the case fatality rates presented a decreasing pattern since the beginning of the series, its magnitude was high until 2001. The impact of vaccination on case fatality rates was perceived only after 2002, suggesting that it can take three years, in average, to have some effect on the Hib meningitis prognosis. With exception to the Northeast region, the trends regarding the incidence and mortality in Brazil were similar, in the pre-vaccination period (increase), detecting a decrease after the introduction of vaccination in the routine of the do Programa Nacional de Imunização. In Brazil and in the North, Northeast, South and Southeast (age less than one year) regions, the case fatality trend was of decline during all series. In the Centerwest and Southwest regions, the impact of the vaccination introduction on the incidence and mortality rates was precocious (1999-2000), if compared to the other regions studied and maybe due to the fact that in these regions the vaccination achieved a greater amount of the population. The impact of vaccination was clearer on the incidence and mortality than on the case fatality rates. Results revealed a positive impact of the vaccination strategies against Hib in Brazil and in macro regions, including the age ranges that were not vaccinated. The author recommends the continuous monitoring of these diseases, through epidemiological surveillance actions and the improvement of the Health Information System.

Este estudo comparou o desempenho de quatro protocolos de extração de DNA a partir de homogeneizados de diferentes órgãos provenientes de vacas infectadas experimentalmente com a B. abortus 2308. Os protocolos de extração comparados foram o método de GT (lise com isotiocianato de guanidina), Boom (lise com GT e tratamento com suspensão carreadora Diatomaceous earth), PK (lise com proteinase K) e Santos (lise por fervura e congelamento com nitrogênio líquido). Foram constituídos os grupos padrão ouro positivo e negativo baseados na bacteriologia clássica e compostos por: 54 cotilédones (27 pos. e 27 neg.), 39 linfonodos supra mamários (12 pos. e 27 neg.), 44 pré-escapulares (17 pos. e 27 neg.), 33 fígados (6 pos. e 27 neg.), 37 baços (10 pos. e 27 neg.), e 34 úberes (7 pos. e 27 neg.). Todas as amostras foram submetidas aos quatro protocolos de extração e a um mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. Nos resultados consolidados por órgãos, a proporção de positivos no cotilédone foi maior do que a encontrada no linfonodo supramamário (p=0,0001), linfonodo pré-escapular (p<0,0001), fígado (p=0,0006), baço (p<0,0001) ou úbere (p=0,0019). Os resultados acumulados para os métodos de extração mostraram que o protocolo de Santos teve maior sensibilidade relativa do que o método de Boom (p=0,003) e GT (p=0,0506), e foi igual ao PK (p=0,2969). As demais comparações de proporções não resultaram em diferenças estatisticamente significantes. No estudo verificou-se amostas positivas a PCR e negativas ao isolamento e viceversa. Assim, apesar das desvantagens do método bacteriológico clássico, a melhor estratégia para o diagnóstico direto da infecção de vacas por B. abortus em homogeneizado de órgãos é a utilização conjunta do isolamento e da PCR, examinando os cotilédones e utilizando os métodos de extração de DNA Santos ou PK. / This study compared the performance of four protocols of DNA extraction from suspensions of different tissues from experimentally infected cows with 2308 strain. The compared extraction protocols were GT protocol (lyse with guanidine isotiocianate), Boom (lyse with GT and treated with the carrying suspension Diatomaceous earth), PK (lise with proteinase K) and Santos (lyse by boiling and freezing with liquid nitrogen). Based on classical bacteriology, positive and negative gold standard groups were built and consisted of 54 cotyledons (27 pos. and 27 neg.), 39 supramammary lymph nodes (12 pos. and 27 neg.), 44 prescapulars (17 pos. and 27 neg.), 33 livers (6 pos. and 27 neg.), 37 spleens (10 pos. and 27 neg.), and 34 udders (7 pos. and 27 neg.). All the samples were submitted to the four DNA extraction protocols and the same amplification process using the primers B4 and B5. According to consolidated results by tissue, the proportion of positives in cotyledon was bigger than supramammary lymph node (p=0,0001), prescapular lymph node (p<0,0001), liver (p=0,0006), spleen (p<0,0001) and udder (p=0,0019). The consolidated results for the extraction methods show that Santos protocol had bigger relative sensitivity than Boom method (p=0,003) and GT (p=0,0506), and was equal than PK (p=0,2969). There were not significant statistical differences in the others comparisons of proportions. In the study, PCR-positive and isolation-negative samples and vice-versa were verified. However, the disadvantages of the classic bacteriological method, the best strategy for direct diagnosis of the infection of cows for B. abortus in homogenized of tissues is combined use of isolation and PCR, examining the cotyledons and using the methods of DNA extraction from Santos or PK.

A resposta imune ao P. chabaudi se caracteriza pela ativação policlonal de linfócitos B na fase aguda da doença, que resulta em uma intensa produção de anticorpos IgM e IgG de baixa afinidade e autoanticorpos. Apesar de esses anticorpos contribuírem para o controle da infecção, pode retardar a geração de anticorpos de alta afinidade que garantem a destruição dos parasitas e a proteção contra infecções subseqüentes. O nosso objetivo foi caracterizar os mecanismos envolvidos na ativação policlonal dos linfócitos B na infecção pelo P. chabaudi AS. Os nossos resultados mostraram que a cooperação T-B e importante nessa fase da infecção. Os ensaios in vitro mostraram que os linfócitos T da fase aguda da infecção são capazes de estimular linfócitos B naives, aumentando a expressão do CD69 e induzindo proliferação e produção de anticorpos. A molécula de classe II do MHC é importante na ativação policlonal dos linfócitos B, aumentando a expressão do CD69 e induzindo a proliferação de anticorpos, devido ao seu envolvimento na ativação dos linfócitos T. Assim, moléculas como CD28, CD40L e ICOS são importantes na ativação, proliferação e produção de anticorpos. / Polyclonal B cell activation is a feature of the early spleen B cell response to human and murine malaria, which results in intense production of parasite low-affinity IgM and IgG and autoantibodies. Although this response may contribute for the initial parasite control, it may also hinder the generation of high-affinity IgG that guarantees parasite elimination and protection against secondary infections. To characterize the mechanism involved in the polyclonal B cell response to P. chabaudi AS, we have analyzed in vivo and in vitro the role of several molecules known to be involved in antibody production. According to our in vivo results, this response depends on the cooperation of CD4+ T cells with B cells. The in vitro assays shows that the expression of MHC class II molecules is crucial for B cell activation in terms of CD69 expression, proliferation and antibody production, apparently due to their requirement for T cell activation. Signaling pathways mediated by the co-stimulatory receptor CD28, CD40L and ICOS has a central role for B cell proliferative response and antibody production. This study may help to clarify the molecular basis of polyclonal B cell activation induced during acute malaria.

A água de coco, como comercializada atualmente, é esterilizada e adicionada de conservante químico ou antioxidante, o que ocasiona a redução de suas qualidades sensorial e nutricional. Para evitar esses efeitos indesejados tem se estudado o aquecimento da água de coco através da radiação por micro-ondas, o que possibilitaria uma bebida de melhor qualidade sensorial e sem adição de conservante ou com menor quantidade dessa substância. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a viabilidade da pasteurização da água de coco por micro-ondas, utilizando esporos de B. coagulans como indicador biológico do processo. Esporos de B. coagulans CCGB (LFB-FIOCRUZ) 1433 foram inoculados em amostras de água de coco, obtida diretamente de frutos verdes (Cocos nucífera L.) e previamente acidificada (ácido ascórbico e cítrico), seguida de pasteurização em micro-ondas com frequência de 2450 MHz. Os ensaios, provenientes de um Delineamento Central Composto Rotacional, com 4 variáveis (temperatura, quantidade e composição dos ácidos e potência do aparelho de micro-ondas) foram realizados aleatoriamente, com tempo de processo de até 20 minutos. Os testes foram conduzidos com 3 repetições do ponto central. Também foi realizado o processo em manta de aquecimento a fim de comparar os dois métodos. Os resultados da inativação foram expressos em log número de esporos/mL de água de coco. A temperatura é o fator preponderante para o processo de pasteurização da água de coco através da análise dos resultados obtidos pela DCCR. Também foi possível observar que, nas seguintes condições: a) potência de 120 W; b) 76 mg de ácidos adicionados à bebida e c) composição dos ácidos de 22% ascórbico e 78% cítrico, houve uma separação dos resultados em dois grupos. Um grupo à temperatura de 86 °C, em que, a redução da população de esporos foi menor (entre 0,5 log e 3,7 log número de esporos/mL de água de coco), e outro à temperatura de 92 °C, que apresentou maiores reduções logarítimicas do micro-organismo (entre 3,4 log e 7,0 log número de esporos/mL de água de coco). Realizado o teste ANOVA, ficou comprovado que o aumento predito foi significativo. Houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre o aquecimento por micro-ondas e o convencional. Porém, essa diferença não foi considerada uma vez que microbiologicamente pode ser desprezada. Quanto ao tempo de processo, são necessários, em média, 10 a 15 minutos de retenção na temperatura desejada para atingir o maior nível de inativação de esporos nas condições do ponto central (89 °C, 125 W, 75 mg de ácidos adicionados à água de coco e a composição desses ácidos de 75% cítrico e 25% ascórbico). A pasteurização da água de coco por micro-ondas mostrou-se viável, mas outros estudos são necessários para otimizar o processamento. / Coconut water, as currently marketed, is sterilized and added with chemical preservative or antioxidant, which reduces its sensory and nutritional qualities. In order to avoid these undesired effects, the heating of coconut water through microwaves radiation has been studied, which would allow a drink of better sensorial quality and without addition of preservatives or with reduced amount of these substances. The objective of this study was to evaluate the viability of the pasteurization of coconut water by microwave, using spores of B. coagulans as biological indicator of the process. Spores of B. coagulans CCGB (LFB-FIOCRUZ) 1433 were inoculated in samples of coconut water, obtained directly from green fruits (Cocos nucífera L.) and previously acidified (ascorbic and citric acid), followed by pasteurisation using microwaves with frequency of 2450 MHz. The tests, from a Rotational Composite Central Design, with 4 variables (temperature, quantity and composition of the acids and power of the microwave apparatus) were carried out randomly, with a process time of up to 20 minutes. The tests were conducted with 3 replicates of the central point. The conventional heating process was also carried out in order to compare the two methods. Inactivation results were expressed as log of spores /mL of coconut water. Temperature is the preponderant factor for the process of pasteurization of coconut water through the analysis of the DCCR. It was also possible to observe that, under the following conditions: a) power of 120W; b) 76 mg of acids added to the beverage and c) composition of acids of 22% ascorbic and 78% citric acid, the results were separated into two groups: one group at a temperature of 86 °C, where the reduction of the spore population was lower (between 0,5 log and 3,7 log of spores/mL of coconut water), and another one at a temperature of 92 °C, which presented higher logarithmic reductions of the microorganism (between 3,4 log and 7,0 log of spores/mL of coconut water). Once the ANOVA test was performed, it was verified that the predicted increase was significant. There was a difference statistically significant between conventional and microwave heating. However, this difference was not taken into account because microbiologically it could be neglected. As for processing time, an average of 10 to 15 minutes of retention at the desired temperature is required to achieve the highest level of inactivation of spores at the center point conditions (89 °C, 125 W, 75 mg of acids added to the cocnut water and the composition of acids of 75% cítrico e 25% ascórbico). The pasteurisation of coconut water by microwave has proved to be feasible, but other studies are needed to optimize processing.

Made available in DSpace on 2016-08-17T17:39:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-IngridCamposAlbuquerque.pdf: 2786506 bytes, checksum: d6bc418f7fa6e1b080b2dbffb2078ddf (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / INTRODUCTION: The concomitant presence of HBsAg and anti-HBs in hepatitis B virus (HBV) infections mainly results from isolated mutations in the a-determinant, which causes changes HBsAg antigenicity. This in turn causes variants unsusceptible to the neutralizing action of anti-HBs, thus permitting immune escape. Therefore, this study had the aim of identifying subjects with this profile among HBsAg carriers identified in an HBV prevalence study. METHODS: The study included participants enrolled in a study of viral hepatitis prevalence from the state of Maranhão in northeastern Brazil. These participants had tested positive for HBsAg and anti-HBs and had quantified HBV DNA. All samples were evaluated for HBsAg, anti-HBs, and anti-HBc. Mutations were sought in the a-determinant located in the S gene s major hydrophilic region (MHR). RESULTS: Among the 3,987 individuals evaluated, 92 (2.3%) were HBsAg carriers. Among these, three had the atypical HBsAg and anti-HBs-positive profile (3.26%). All were identified as subgenotype D4. Only one individual had two S gene mutations, within the a-determinant (Y134N/T140I). CONCLUSION: The frequency of individuals concomitantly positive for HbsAg and anti-HBs was low in the patient sample. Only one individual had mutations in the S gene a-determinant, which is known to be associated with this profile. Nevertheless, the existence of immune escape in communities can have great importance, especially for evaluating immunization programs. / INTRODUÇÃO: A concomitante presença do HBsAg e anti-HBs na infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) deve-se, principalmente, a mutações pontuais no determinante a que causam alterações na antigenicidade do HBsAg levando à existência de variantes não sensíveis à ação neutralizante do anti-HBs que possibilitam o escape imune. Assim, o objetivo desse estudo foi identificar indivíduos positivos para esse perfil entre portadores do HBsAg identificados em um estudo de prevalência HBV. MÉTODOS: Foram incluídos participantes de um estudo de prevalência de hepatites virais realizado em uma região do Estado do Maranhão, Nordeste do Brasil, que apresentaram positividade para HBsAg e anti-HBs e tinham HBV-DNA quantificado. Todas as amostras foram submetidas à realização do HBsAg, anti-HBs e Anti-HBc. Foram pesquisas mutações no determinante a inserido na Major Hidrophilic Region (MRH) do gene S. RESULTADOS: Entre 3987 indivíduos avaliados no estudo, 92 (2,3%) eram portadores do HBsAg. Dentre estes, três tinham o perfil anômalo HBsAg e anti-HBs positivos (3,26%). Todos foram identificados como subgenótipo D4. Apenas um indivíduo apresentou duas mutações do gene S, dentro do determinante a (Y134N/T140I). CONCLUSÃO: Em uma comunidade do Nordeste do Brasil foi identificada baixa frequência do perfil atípico HBsAg e AntiHBs positivos simultaneamnente. Entre eles, apenas um indivíduo apresentou mutações no determinante a do gene S, já descritos anteriormente associados a esse perfil. De qualquer modo, a existência de escape imune em uma comunidade pode ter grande importância, especialmente na avaliação dos programas de imunização.