Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 193-234. Publié aussi en version électronique.

El complejo taeniasis/cisticercosis por Taenia solium es una enfermedad parasitaria de importancia en salud pública. La transmisión de los huevos de la familia Taeniidae en el medio ambiente puede ocurrir de forma directa o indirecta. Entre las formas indirectas reportadas se encuentran los escarabajos. Experimentalmente, se ha demostrado que los escarabajos son excelentes portadores de huevos de T. solium; sin embargo, falta estudios en campo. Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo detectar y secuenciar el gen mitocondrial COX 1 de huevos de T. solium en escarabajos colectados de una zona endémica a cisticercosis. En este estudio, se colectaron un total de 309 escarabajos, los cuales fueron agrupados en 54 muestras. Cada muestra correspondia a un punto geográfico, a un tiempo o a un género diferente y contenía entre 1 a 18 escarabajos. Se extrajo el ADN de cada muestra y luego se realizó un PCR anidado para amplificar el gen de la proteína oncosferal Tso31. Todas las muestras positivas al PCR anidado fueron amplificadas y secuenciadas para un fragmento del gen Citocromo C Oxidasa Subunidad 1 (COX 1). Siete de las 54 muestras fueron positivas a T. solium mediante la amplificación del gen Tso31. Sin embargo, solo dos (2/7) fueron compatibles con T. solium mediante la secuenciación parcial del gen COX 1. Se dectetó en el estudio, mediante secuenciación de un fragmento del gen COX 1, huevos de T. solium presente en escarabajos de una zona endémica a cisticercosis. / Tesis

El documento digital no refiere un asesor / Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Dinamiza la investigación criminal a través de una idónea identificación genética en los casos en que se cuente con restos biológicos para afianzar el código procesal penal del 2004, y así obtener la máxima eficacia en la lucha contra el crimen, para esto, es importante la informatización de la identificación por ADN; y para ello previamente el nacimiento en el Perú de una legislación cimentada en principios bioéticos. Es así que para poder alcanzar la meta de brindar a la colectividad jurídica un trabajo de investigación que sirva de punto de partida para otros nuevos y formar conciencia sobre el tema, se ha intentado desarrollarlo de la forma más didáctica posible, para lo cual, se ha optado por distribuirlo en seis capítulos debidamente estructurados y concatenados. / Tesis

Antropóloga Física / Punta Arenas fue formada a partir de inmigrantes chilenos y europeos, mayormente chilotes y croatas, que llegaron durante los siglos XIX y XX. Las diferencias culturales y su pertenencia a distintas clases socio-económicas sugieren la existencia de barreras que dificultan el flujo génico entre los grupos. La población actual no ha sido caracterizada para marcadores genéticos que permitan corroborar la contribución de los grupos de inmigrantes. Entonces nos preguntamos ¿cuáles son los patrones de mestizaje entre inmigrantes chilotes y croatas de Punta Arenas y cómo influyen en la configuración de la variabilidad genética actual de la ciudad? Se describe el fenómeno del mestizaje entre chilotes y croatas en Punta Arenas considerando las variables genéticas y sociales involucradas a través de la caracterización de una muestra de 135 voluntarios vía marcadores uniparentales (Cromosoma Y y ADN mitocondrial) y de una encuesta. El componente materno corresponde en un 86% a pueblos originarios, predominando los macrohaplogrupos C (35%), D (33%) y B (17%). En los linajes paternos predomina el componente no amerindio (92%), destacándose el haplogrupo R1b (48%) y la baja frecuencia de los preponderantes en Croacia (R1a1= 5%, I2a1= 3%). Se da cuenta de la relación existente entre marcadores genéticos, apellidos y lugar de origen de los individuos, de la existencia de un sesgo por sexo en el mestizaje y de la inexistencia de una asociación entre ancestría y estrato socio-económico. Los resultados no presentan diferencias significativas respecto a otras poblaciones urbanas de Chile, evidenciando una discordancia entre la relevancia dada a la inmigración europea en el relato histórico y su real contribución genética a la población de la ciudad de Punta Arenas, mostrando un predominio de la inmigración desde Chiloé

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El objetivo de este trabajo fue identificar genes expresados diferencialmente en un organismo cuyo genoma no ha sido secuenciado. Investigamos los patrones globales de expresión en respuesta a cambios en la concentración de Mn2+ en el medio de cultivo, con el fin de identificar genes involucrados en el metabolismo y homeostasis de este catión. El organismo modelo usado fue Ceriporiopsis subvermispora, un hongo ligninolítico altamente selectivo, el cual posee una maquinaria enzimática compuesta por peroxidasas dependientes de manganeso y lacasas principalmente. Para lograr el objetivo propuesto desarrollamos un protocolo de cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length Polymorphism) basado en la amplificación de fragmentos derivados de transcritos, para analizar los patrones de expresión génica en cultivos con diferente concentración de Mn2+. Al analizar los patrones generados obtenidos del hongo creciendo en diferentes concentraciones de manganeso, identificamos 34 fragmentos derivados de transcritos diferencialmente expresados en respuesta a manganeso. Veintidós de ellos mostraron homología con genes de función conocida o putativa, mientras que catorce de ellos no mostraron coincidencias considerables. El resultado más interesante fue identificar dos fragmentos derivados de transcritos que correspondían a la familia de transportadores tipo ABC (ATP Binding Cassette) altamente relacionados con la homeostasis de Mn2+ y Ca2+ / The aim of this work was to identify differentially expressed genes in an organism whose genome has not been sequenced. We investigated the global gene expression pattern regulated by manganese, in order to identify genes involved in its metabolism and homeostasis. The model organism used was Ceriporiopsis subvermispora, a highly selective ligninolytic fungus, which possesses an enzymatic machinery composed of manganesedependent peroxidases and laccase. In order to achieve this objective we developed a cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length Polymorphism) protocol based on the amplification of transcript derived fragments (TDFs) to analyze the gene expression patterns on different Mn2+ concentration cultures. When analyzing cDNA-AFLP generated patterns obtained from the fungus grown on different concentrations of manganese, we identified 34 manganesedifferentially expressed transcript derived fragments. Twenty of them showed significant homology to genes with known or putative function, while fourteen fragments did not show significant matches. Interestingly we identified two TDFs that correspond to members of the ABC (ATP Binding Cassette) transporter family closely related with Mn2+/Ca2+homeostasis

Cette thèse de doctorat est un projet franco-polonais en co-tutelle entre le Département du Fonctionnement des Ecosystèmes Marins (l'Université de Gdansk, Pologne) et le laboratoire DIMAR (l'Université de la Méditerranée, France). La variation physiologique et la structure génétique des populations d’une espèce lagunaire, le bivalve, Cerastoderma glaucum, ont été étudiées. C. glaucum est une espèce sessile avec une phase larvaire planctonique. Elle est présente surtout dans les bassins isolés ou semi-isolés sans marée, comme les lagunes, les estuaires, les baies et les lacs. Ces habitats sont extrêmes de par des changements de conditions environnementales à court terme plus importants que dans le milieu marin. Ils sont souvent isolés, le flux de gènes est limité et des adaptations locales sont attendues. C. glaucum a révélé une forte variabilité des paramètres morphométriques et physiologiques entre les 3 populations de la Mer Baltique, la Mer du Nord et la Méditerranée. Les coques de la Mer Baltique sont beaucoup plus petites que celles des autres populations et leur taux de respiration est le plus élevé, ce qui est probablement provoqué par le stress osmotique. Les populations de l’Europe du nord ont un pattern de la reproduction monocyclique, tandis que la population de la Méditerranée peut se reproduire tout au long de l’année. Les changements saisonniers dans la composition biochimique sont corrélés avec les changements de condition trophique et avec le cycle reproductif. / This PhD is a Polish-French project between the Department of Marine Ecosystems Functioning (University of Gdansk, Poland) and DIMAR laboratory (Université de la Méditerranée, France). Physiological variation and genetic structure of the populations of lagoon specialist, the bivalve, Cerastoderma glaucum, have been studied. C. glaucum is a sessile species with a planctonic larval stage. It inhabits mainly non-tidal areas, like lagoons or brackish lakes. Those habitats are extreme, because they are much more subject to short-term variations in environmental conditions than marine habitats. They are also often isolated and as a consequence the gene flow among populations is limited and local adaptations are expected. The lagoon cockle revealed a strong interpopulation variability of morphometric and physiological parameters among 3 populations studied: from the Baltic Sea, the North Sea, and the Mediterranean Sea. The cockles from the Baltic Sea were much smaller than those from other populations and they exhibited the highest respiration rate, probably due to osmotic stress. The populations from the northern Europe had a monocyclic reproductive pattern, whereas the Mediterranean population seemed to reproduce throughout the year. Seasonal changes in biochemical components contents appeared to be correlated with changes in trophic conditions and the reproductive cycle. High respiration rates in populations from the northern Europe in spring and autumn could have resulted from gamete development (in spring) and phytoplankton blooms (in spring and autumn).

Busca determinar el perfil inmunogénico Th1 y Th2 de una proteína de membrana externa P6-like recombinante de P. multocida aislada de casos neumónicos fatales en alpacas obtenida mediante tecnología recombinante, donde fue seleccionada la proteína in silico, clonada, expresada y purificada, para luego ser enfrentados con PBMC de alpaca en una concentración de 10ηg por cultivo. Estos cultivos fueron colocados a 38°C durante las 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48 y 72 horas. Posteriormente se extrajeron el ARNm de cada cultivo y mediante la prueba de RT-PCR en Tiempo Real se observaron los niveles de expresión de citoquinas de perfil Th1 y Th2. Este estudio tiene como objetivo observar el perfil citocínico que estimula la P6-Like recombinante. Esta evaluación in vitro forma parte de la elaboración de una vacuna de última generación para la prevención de neumonías pasteurelósicas en crías de alpacas. / Tesis

Grado de magíster en biomedicina celular y molecular / síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica, inflamatoria y sistémica que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lagrimales. Resultados de nuestro laboratorio demuestran que las células acinares de las GS de pacientes SS presentan estrés de retículo endoplásmico (RER) y un aumento en la expresión del sensor ATF6α y del factor de transcripción ATF4 de la vía PERK de la respuesta a proteínas mal plegadas. También, se ha determinado niveles variables de transcrito de la chaperona calreticulina (CALR). Considerando el rol relevante que se le ha atribuido a la epigenética en la patogénesis de otras enfermedades autoinmunes surge la pregunta: ¿Es posible que la expresión diferencial de ATF4, ATF6α y CALR en GS de pacientes SS pueda estar regulada por mecanismos epigenéticos, tal como la metilación del DNA? Para determinarlo se evaluó el porcentaje de metilación del DNA de los respectivos promotores utilizando MS-HRM y los resultados se correlacionaron con los datos clínicos de los pacientes SS. Interesantemente, las GS de pacientes SS han mostrado que las células epiteliales contribuyen con el ambiente inflamatorio al sobreexpresar citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IFN-. En esta tesis se determinó el efecto de IFN- y TNF-α en la metilación de los promotores de los genes de interés en acinos 3D. Con el propósito de averiguar si los cambios observados se relacionaron con las enzimas metilasas y desmetilasas, es que se determinaron los niveles de transcrito de DNMT1, DNMT3A y TET2. Los resultados obtenidos en GS labiales de pacientes SS comparado con controles mostraron: 1. un aumento significativo en la metilación del DNA para el promotor del gen de ATF4 que se correlacionó positivamente con los niveles de transcritos de TNF-α e IFN-, 2. una disminución de la metilación del promotor del gen de ATF6α que se correlacionó negativamente con los niveles de los transcritos de las citoquinas evaluadas, y 3. no se encontraron cambios en la metilación del promotor de CALR. Paralelamente, se determinó que el porcentaje de metilación del promotor de ATF6α correlacionó negativamente con los autoanticuerpos ANA. Sin embargo, es complejo establecer cuáles son los blancos antigénicos que dan cuenta de esta correlación. Asimismo, las correlaciones clínicas obtenidas validan la muestra de pacientes utilizada en este estudio, mostrando que la inflamación se asocia al daño glandular y consecuentemente a la alteración de la función de las GS. En los acinos 3D estimulados por 24 h con TNF-α o IFN- (1 y 10 ng/mL) se corroboró lo observado en GSL de pacientes SS, evidenciando un aumento del porcentaje de metilación del promotor del gen de ATF4, una disminución del promotor del gen de ATF6α y no cambios en CALR. Por otra parte, la metilación del promotor de los genes de ATF4 y de ATF6α correlacionó negativamente con los niveles de transcritos respectivos. Paralelamente, los niveles de transcritos de DNA-metiltransferasas (DNMT1, DNMT3A) y la desmetilasa TET2 aumentaron significativamente en acinos 3D estimulados con citoquinas. Este aumento en los niveles de transcritos explicaría, en parte, la metilación diferencial del promotor de ATF4 y de ATF6α bajo las condiciones de estudio. Por lo tanto, las citoquinas proinflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores de los genes estudiados. Además, los niveles de transcritos de metilasas y desmetilasa se podrían incidir en la metilación diferencial de los promotores de ATF4 y ATF6α bajo las condiciones del estudio. En conclusión, las citoquinas pro-inflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores génicos ATF4 y ATF6α y, estos cambios en la metilación de los promotores podrían contribuir a la regulación de la UPR en las GSL de pacientes con SS. / Sjögren's syndrome (SS) is a chronic, autoimmune, inflammatory and systemic exocrinopathy that mainly affects salivary glands (SG) and lacrimal glands. Results from our laboratory demonstrate that SG acinar cells from SS patients show stress in the endoplasmic reticulum and an increased expression of ATF6α sensor and ATF4 transcription factor, member of the PERK pathway of the unfolded protein response. Also, SS patients showed variable levels calreticulin transcript levels (CALR). Considering the relevant role attributed to epigenetics in the pathogenesis of autoimmune diseases, the question arises: Is it possible that the differential expression of ATF4, ATF6α and CALR in SG from SS-patients could be regulated by epigenetic mechanisms, such as DNA methylation? The percentage of DNA methylation of the ATF4, ATF6α and CALR gene promoters were evaluated using methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM). Results were correlated with the clinical data of SS patients. Interestingly, SG from SS-patients has shown that epithelial cells contribute to the inflammatory environment by overexpressing relevant pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ. In this thesis we determined the effect of IFN-γ and TNF-α on methylation of promoters of the genes of interest in 3D acini. To determine if the observed changes were related to the levels of methylase and demethylase enzymes, transcript levels of DNMT1, DNMT3A and TET2 were determined. The results obtained in labial SG (LSG) of SS patients compared with controls showed: 1. a significant increase of DNA methylation in ATF4 gene promoter that positively correlated with TNF -α and IFN-γ transcript levels, 2. a significant decrease in DNA methylation in ATF6α gene promoter that negatively correlated with TNF-α and IFN-γ transcript levels, 3. no changes were found in the methylation of the CALR promoter. The methylation of the ATF6α promoter correlated negatively with ANA antibodies levels. However, it is complex to establish the antigenic targets that account for this correlation. Aditionally, the clinical correlations obtained validate the set of patients used in this study showing that the inflammation is associated with the glandular damage and consequently to the alteration of the GS function. Results observed in LSG of SS patients were confirmed in 3D acini stimulated with TNF-α or IFN-γ (1 and 10 ng/mL) for 24 h, showing an increase in the methylation percentage of the ATF4 gene promoter, a decrease of the ATF6α gene promoter and no changes in CALR. On the other hand, promoter methylation of the ATF4 and ATF6α genes negatively correlated with their respective transcript levels. In parallel, levels of DNA-methyltransferase transcripts (DNMT1, DNMT3A) and TET2 desmethylase increased significantly in cytokine-stimulated 3D acini. These results could partly explain the differential methylation of the ATF4 promoter and ATF6α under the present experimental conditions. Therefore, proinflammatory cytokines promote changes of promoter DNA methylation of the studied genes. Comparatively, levels of methylase and desmethylase transcripts could influence the differential methylation of ATF4 and ATF6α promoters under conditions studied. In conclusion, proinflammatory cytokines promote changes in the methylation of ATF4 and ATF6α promoters and these changes in DNA methylation would contribute to the regulation of UPR in the LSG of patients with SS.

La vertiente occidental de los Andes peruanos es un ecosistema árido y rico en flora endémica, actualmente amenazada por la industria y expansión urbana. Se caracteriza por una flora de cactáceas y arbustos caducifolios, entre estos últimos se encuentra Orthopterygium huaucui (A. Gray) Hemsley, una Anacardiaceae endémica de género monotípico, que habita la vertiente occidental en forma de matorrales dispersos en laderas rocosas a lo largo de 500 km de la costa central y cuyas especies más próximas pertenecen al género Amphipterygium (presente en México y Centroamérica) con la cual existe una disyunción de más de 3500 km. Con la finalidad de determinar 1) La estructura poblacional de O. huaucui, 2) su posición filogenética en la tribu Rhoeae de la familia Anacardiaceae y 3) el tiempo de origen de O. huaucui en la familia, se realizó una filocronología bayesiana de la familia calibrada con cinco registros fósiles y se evaluó la diversidad genética. Para ambos objetivos se emplearon los marcadores TrnL, Rps16 (intrones plastidiales) e ITS (nuclear), utilizados en estudios filogenéticos y filogeográficos en vegetales. Se extrajo ADN de material fresco de 54 individuos de O. huaucui abarcando la distribución conocida, se secuenciaron ambas hebras y se editaron manualmente. Asimismo, fueron descargadas secuencias disponibles en GenBank de otras Anacardiaceae. La disyunción entre Orthopterygium y su género hermano Amphipterygium resultó entre 16,52 y 14,82 millones de años, entre ambos se halló una distancia genética similar a linajes con una mayor diversificación; mientras que, no se detectaron mutaciones intraespecíficas en Orthopterygium. Este último resultado respondería a una baja dispersión y/o baja tasa mutacional, en vista de estudios ecológicos y moleculares realizados. Sin embargo, siendo la ausencia de mutaciones en marcadores nucleares un patrón común en especies recientes no obstante el origen miocénico detectado en Orthopterygium, podría tratarse de un linaje afectado por un severo cuello de botella genético. Más aun tratándose del único representante del género, Orthopterygium huaucui sería el resultado de un proceso migratorio de una especie ancestral desde el hemisferio norte de América, a través de un Itsmo de Panamá ya formado, que aprovechó la aridez de la vertiente, cuyas características se han mantenido por más de 15 millones de años, para su establecimiento. / Peruvian western slopes of the Andes are an arid ecosystem rich in endemic flora currently threatened by industrial and urban expansion. It is characterized by a flora of cacti and deciduous shrubs. Orthopterygium huaucui (A. Gray) Hemsley is an endemic monotypic genus of Anacardiaceae family which inhabits this ecosystem as scattered thickets on rocky slopes along 500 km of the central coast and whose closest species belonging to the genus Amphipterygium (found in Mexico and Central America). Between those two genera there is a disjunction of more than 3500 km. In order to determine 1) the population structure of O. huaucui, 2) the phylogenetic position of O. huaucui within the tribe Rhoeae of the Anacardiaceae family and 3) the divergence time of O. huaucui within Anacardiaceae, we performed a Bayesian phylochronology calibrated with five fossil records and determined the genetic diversity. To get these aims we sequenced TrnL, Rps16 (plastid introns) and ITS (nuclear) markers broadly used in plant phylogenetic and phylogeographic studies. We extracted DNA from 51 individuals of O. huaucui, we amplified the three regions by PCR, we sequenced each one and edited manually. We downloaded sequences of other anacardiacean species available in GenBank. The disjunction between Orthopterygium and Amphipterygium resulted in 16,52 and 14,82 million years and a genetic distance between these two species was similar to lineages with greater diversification; whereas no intraspecific mutations were detected in Orthopterygium. This result would respond to a low dispersion or low mutation rate in view of ecological and molecular studies. In spite of the fact that the absence of mutations in nuclear markers is a common pattern in recent species and the Miocenic origin of Orthopterygium, we propose that this species was affected by a severe genetic bottleneck. Moreover, by considering as the single representative of the genus, Orthopterygium huaucui would be the result of an ancestral species migration from the northern hemisphere which has got the western slopes, an arid ecosystem for more than 15 million years, through a well-established Panama isthmus. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa los niveles de cfDNA en plasma mediante PCR digital en pacientes con cáncer de mama para implementar una técnica de diagnóstico temprano. Estandariza el método para obtener cfDNA en plasma. Evalúa los niveles de cfDNA en plasma por PCR digital a través de los genes PUM1 y RNasa P. Establece los niveles de cfDNA en plasma en pacientes con cáncer de mama e individuos sanos. Relaciona los niveles de cfDNA en plasma con el estadio neoplásico. Es una investigación descriptiva, prospectiva, cuantitativa, transversal, observacional y de caso-control. Utiliza una muestra de 16 mujeres con edades entre 28-80 años diagnosticadas con cáncer de mama y otra de 21 mujeres sin diagnóstico positivo para cáncer de mama, mayores de 40 años, las cuales son codificadas como grupo control. Encuentra que el cfDNA es un biomarcador apropiado como herramienta diagnóstica en cáncer de mama, la extracción de cfDNA con perlas magnéticas es un método idóneo que asegura la mayor concentración y pureza de la muestra y que la PCR digital está calificada para la cuantificación absoluta de cfDNA en muestras de pacientes y controles. Señala la existencia de diferencias significativas entre niveles de cfDNA de pacientes con cáncer de mama y controles. / Tesis