A anaplasmose bovina é uma das principais causas de perdas produtivas e mortes no Rio Grande do Sul em rebanhos bovinos. O Anaplasma marginale é o principal agente causador da enfermidade e provoca hipertermia, anemia, prostração, abortos e perdas produtivas nos animais acometidos. Tendo em vista o controle deste hemoparasita em uma propriedade leiteira localizada no município de Eldorado do Sul no Rio Grande do Sul, na qual a incidência da doença era alta, 473 animais foram imunizados com Anaplasma centrale na busca de desenvolvimento cruzado para Anaplasma marginale. No experimento foram verificadas que a incidência que normalmente era acima de 30% na propriedade passou para níveis inferires a 5%. No entanto, foram verificados abortos decorrentes da imunização, principalmente nos animais que possuíam menos de 90 dias de prenhes. Já o número de mortes globais na fazenda caiu consideravelmente tendo em vista que a principal causa de morte era a anaplasmose bovina. Dos animais inoculados com A. centrale em torno de 15% apresentaram sintomatologia clínica da enfermidade e precisaram ser tratados com oxitetraciclina no período entre 15 e 30 dias após a imunização. O custo com tratamento empregado na propriedade posterior à imunização caiu em torno de 85% o que provocou impacto significativo economicamente na propriedade. / Bovine anaplasmosis is a major cause of production losses and deaths in Rio Grande do Sul cattle herds. The Anaplasma is the main causative agent of cattle disease. It causes hyperthermia, anemia, prostration, abortions and reduces milk production in affected animals. In order to control this hemoparasite on a dairy farm located in the municipality of Eldorado do Sul in Rio Grande do Sul, where the disease incidence was high, 473 animals were immunized with Anaplasma centrale in the search for cross-protectiv immunity for Anaplasma marginale. The property anaplasmosis incidence, which usually was above 30%, became 5% after the immunization. However, abortions were observed resulting from innoculaition, especially in animals that had less than 90 days of pregnancy. The global number of deaths on the farm dropped considerably given that the main cause of death was the bovine anaplasmosis. 15% of animals inoculated with A. centrale showed clinical symptoms of the disease between 15 and 30 days after immunization and had to be treated with oxytetracycline . The amount of money spent with anaplasmosis treatment decay 85% after the immunization, which caused significant economic impact on the property.

A anaplasmose bovina é uma das principais causas de perdas produtivas e mortes no Rio Grande do Sul em rebanhos bovinos. O Anaplasma marginale é o principal agente causador da enfermidade e provoca hipertermia, anemia, prostração, abortos e perdas produtivas nos animais acometidos. Tendo em vista o controle deste hemoparasita em uma propriedade leiteira localizada no município de Eldorado do Sul no Rio Grande do Sul, na qual a incidência da doença era alta, 473 animais foram imunizados com Anaplasma centrale na busca de desenvolvimento cruzado para Anaplasma marginale. No experimento foram verificadas que a incidência que normalmente era acima de 30% na propriedade passou para níveis inferires a 5%. No entanto, foram verificados abortos decorrentes da imunização, principalmente nos animais que possuíam menos de 90 dias de prenhes. Já o número de mortes globais na fazenda caiu consideravelmente tendo em vista que a principal causa de morte era a anaplasmose bovina. Dos animais inoculados com A. centrale em torno de 15% apresentaram sintomatologia clínica da enfermidade e precisaram ser tratados com oxitetraciclina no período entre 15 e 30 dias após a imunização. O custo com tratamento empregado na propriedade posterior à imunização caiu em torno de 85% o que provocou impacto significativo economicamente na propriedade. / Bovine anaplasmosis is a major cause of production losses and deaths in Rio Grande do Sul cattle herds. The Anaplasma is the main causative agent of cattle disease. It causes hyperthermia, anemia, prostration, abortions and reduces milk production in affected animals. In order to control this hemoparasite on a dairy farm located in the municipality of Eldorado do Sul in Rio Grande do Sul, where the disease incidence was high, 473 animals were immunized with Anaplasma centrale in the search for cross-protectiv immunity for Anaplasma marginale. The property anaplasmosis incidence, which usually was above 30%, became 5% after the immunization. However, abortions were observed resulting from innoculaition, especially in animals that had less than 90 days of pregnancy. The global number of deaths on the farm dropped considerably given that the main cause of death was the bovine anaplasmosis. 15% of animals inoculated with A. centrale showed clinical symptoms of the disease between 15 and 30 days after immunization and had to be treated with oxytetracycline . The amount of money spent with anaplasmosis treatment decay 85% after the immunization, which caused significant economic impact on the property.

Cette thèse décrit des méthodes de construction de martingales avec marginales spécifiées. La première collection de méthodes procède par quantization. C'est-à-dire en approximant une mesure par une autre mesure dont le support consiste en un nombre fini de points. Nous introduisons une méthode de quantization qui préserve l'ordre convexe. L'ordre convexe est un ordre partiel sur l'espace des mesures qui les compare en termes de leur dispertion relative. Cette nouvelle méthode de quantization présente l'avantage que si deux mesures admettent une transition de martingale alors les mesures quantisées en admettent aussi. Ceci n'est pas le cas pour la méthode de quantization habituellement utilisée en probabilités (la méthode de quantization L2). Pour les mesures quantifiés nous présentons plusieurs méthodes de construction de transition de martingale. La première méthode procède par programmation linéaire. La deuxième méthode procède par construction de matrices avec diagonale et spectre données. La troisième méthode procède par l'algorithme de Chacon et Walsh. Dans une seconde partie la thèse présente une nouvelle solution au problème du plongement de Skorokhod. Dans une troisième partie la thèse étudie la construction de martingales à temps continu avec marginales données. Des constructions sont données à l'aide du draps Brownien. D'autres constructions sont données en modifiant une méthode développée par Albin, les martingales construites ainsi possèdent une propriété de scaling.. Dans une partie annexe, certaines conséquences de cette théorie concernant le management du risque des options asiatiques, par rapport à leur sensibilité à la volatilité et à la maturité sont établies.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-29T17:59:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Flábio Ribeiro de Araújo.pdf: 1589352 bytes, checksum: eef290e5cf5f5ad0b3942824ce7c94fd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T17:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Flábio Ribeiro de Araújo.pdf: 1589352 bytes, checksum: eef290e5cf5f5ad0b3942824ce7c94fd (MD5) / FUNDECT;CNPq / A anaplasmose é uma importante enfermidade de bovinos de áreas tropicais e subtropicais do mundo, causada pela riquétsia intra-eritrocítica Anaplasma marginale. A vacinação tem sido a forma mais econômica e eficiente de controlar a anaplasmose bovina. No entanto, os métodos de imunização tradicionais, que utilizam organismos provenientes de eritrócitos infectados, apresentam limitações em seu uso, razão pela qual, estudos para o descobrimento de novos imunógenos são necessários. Nos últimos anos, esses estudos têm se concentrado nas proteínas de membrana da riquétsia, sobretudo MSP1a e MSP2, as quais mostraram-se promissoras em ensaios de proteção com as proteínas nativas, utilizadas isoladamente. Este trabalho teve como objetivo geral testar a imunoproteção induzida pelas proteínas de membrana MSP1a e MSP2 recombinantes de A. marginale, associadas com adjuvante CpG ODN 2006, frente a desafio heterólogo e avaliar a resposta imune gerada pela imunização. Para tanto, diversas etapas experimentais foram executadas, desde a clonagem e expressão dos genes que codificam as duas proteínas, padronização dos testes de diagnóstico usados no estudo, imunização e desafio dos animais experimentais e acompanhamento das respostas imunes humoral e celular. Os ELISAS indiretos baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes apresentaram sensibilidades de 99,0% e especificidades de 100% (para ambos os testes). A PCR para o gene msp5 da riquétsia detectou infecções ainda no período pré-patente, antes da conversão sorológica. Os bovinos da raça Aberdeen Angus foram imunizados três vezes com 200 μg de MSP2 e/ou MSP1a recombinantes (produzidas a partir do isolado Pernambuco – Zona da Mata), associadas com CpG ODN 2006 e alúmen. Posteriormente, foram desafiados com 3 x 107 eritrócitos infectados do isolado heterólogo de A. marginale (Mossoró - Rio Grande do Norte). Os animais experimentais apresentaram quadro clínico de anaplasmose (redução do volume globular, febre e riquetsemias detectáveis por distensões sangüíneas coradas). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos imunizados e os controles (que receberam CpG ODN 2006 e alúmen ou alúmen isoladamente) quanto ao percentual de redução do volume globular, riquetsemias máximas e temperaturas retais máximas, indicando que as imunizações não foram protetoras. A despeito da significativa produção de IgG total contra MSP1a e MSP2, detectada no dia do desafio, os animais imunizados apresentaram produção significativa de 14 IgG2 apenas contra MSP1a. Não foi possível detectar resposta proliferativa de células mononucleares de sangue periférico, tanto no momento do desafio quanto após o pico das riquetsemias. Possivelmente, a ausência de proteção deveu-se a uma deficiente ou ausente estimulação de imunidade celular nos bovinos imunizados.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-07-10T13:03:11Z No. of bitstreams: 1 2010 - Daniel da Silva Guedes Junior .pdf: 3397672 bytes, checksum: fea6a394bbb430b666ddc9c054a24c27 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T13:03:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Daniel da Silva Guedes Junior .pdf: 3397672 bytes, checksum: fea6a394bbb430b666ddc9c054a24c27 (MD5) Previous issue date: 2010-02-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq, Brasil. / The geographic distribution of bovine borreliosis is determined by the dispersion of its vector. Borrelia theileri is the predominant species in cattle, and B. coriaceae and B. burgdorferi also been reported causing clinical disease. B. theileri cause mild disease in cattle, and still is important for its potential to be confused with the spirochete of Lyme disease, B. burgdorferi, and agents of epizootic bovine abortion, B. coriaceae. In Brazil, as well as in other South American countries, the agent of this disease has not been isolated further confusing the diagnosis. The objective of this study was to identify genotypically Borrelia sp that affects cattle in Brazil. DNA extraction, was performed from blood and ticks of cattle with positive serology by indirect ELISA with crude antigen of Borrelia burgdorferi. Primers were designed for genes of Borrelia burgdorferi and B. theileri groups: 16S, flaA, flaB, GroEL, hbb, recA, 5s-23s, p66, rrs, rpoB and glpq. After the PCR reaction, only the primers amplified rrs and rpoB sequences. The predictive amino acid sequence of RRS3 revealed 99% homology with B. hermsii and B. duttonii and predictive amino acid sequence of RPOB showed 67% homology with B. duttonii and B. recurrentis. This suggests that the species of Borrelia sp present in Brazil is not owned by group B. burgdorferi. Little is known regarding the genetic variability of genes that encode membrane proteins of Brazilian isolates of A. marginale. The products of these genes constitute an important tool, as there may be significant antigen polymorphism, which may damage cross-protection between isolates and the chances of identifying candidate immunogens. The aim of the present study was to determine the degree of conservation of sequences of these genes in a Brazilian isolate of A. marginale comparing with Saint Maries and Florida isolates. For this, primers were designed to amplify the genes omp1, omp4, omp5, omp7, omp8, omp10, omp14, omp15, sodb, opag1, opag3, virb3, am097 (VirB9-1), am956 (PepA), am254 (ef-tu), am854 by PCR. The genes were then sequenced by Sanger method and the predicted amino acid sequences aligned and homology analyzed by the program CLUSTAL W. With the exception of OMP 7 all proteins (OMP1, OMP4, OMP5, OMP8, OMP10, OMP14, OMP15, SODB, OPAG1, OPAG3, VIRB3, VIRB9-1, PepA, EF-Tu, AM854) exhibited homology greater than 92% with other A. marginale isolates. However, only OMP1, OMP5, EF-Tu, VirB3, SODB, VIRB9-1 e AM854 showed homology greater than 72% regarding to A. marginale centrale which confers cross-protection against A. marginale. / A distribui??o geogr?fica da borreliose bovina ? determinada pela dispers?o do seu vetor. Borrelia theileri ? a esp?cie predominante em bovinos, sendo que B. burgdorferi e B. coriaceae tamb?m foram relatadas causando doen?a cl?nica. Portanto, B. theileri causa doen?a leve em bovinos, e ainda ? importante pelo seu potencial em ser confundido com a espiroqueta da Doen?a de Lyme, B. burgdorferi, e com agentes do Aborto Epizo?tico bovino, B. coriaceae. No Brasil, assim como em outros pa?ses Sul americanos, o agente desta enfermidade ainda n?o foi isolado prejudicando ainda mais o diagn?stico. O objetivo deste trabalho foi ? identifica??o genot?pica da esp?cie de Borrelia sp que acomete bovinos no Brasil. Foram utilizados para extra??o de DNA, o sangue e carrapatos de bovinos com sorologia positiva ao ELISA indireto com ant?geno bruto para Borrelia burgdorferi. Foram desenhados oligonucleot?deos iniciadores para genes dos grupos Borrelia burgdorferi e B. theileri: 16S, flaA, flaB, groel, hbb, recA, 5s-23s, p66, rrs, rpob e glpq. Ap?s a rea??o de PCR, somente os oligonucleot?deos iniciadores rrs e rpob amplificaram seq??ncias. A seq??ncia preditiva de amino?cidos de RRS3 revelou homologia de 99% com B. hermsii e B. duttonii e a seq??ncia preditiva de amino?cidos de RPOB demonstrou 67% de homologia com B. duttonii e B. recurrentis. Isto sugere que a esp?cie de Borrelia presente no Brasil n?o seja pertencente ao grupo de B. burgdorferi. Pouco se sabe sobre a variabilidade gen?tica dos genes que codificam prote?nas de membrana de isolados brasileiros de A. marginale. O produto destes genes constitui uma ferramenta importante, pois pode haver polimorfismo antig?nico, que pode prejudicar a prote??o cruzada entre os isolados e as chances de identifica??o de candidatos a imun?genos. O objetivo do presente estudo foi determinar o grau de conserva??o das seq??ncias destes genes em um isolado brasileiro de A. marginale frente aos isolados Saint Maries, Florida e A. marginale centrale. Para tanto, oligonucleot?deos foram desenhados para amplificar os genes omp1, omp4, omp5, omp7, omp8, omp10, omp14, omp15, sodb, opag1, opag3, virb3, am097 (VirB9- 1), am956 (PepA), am254 (ef-tu), am854 por PCR. Os genes foram ent?o seq?enciados pelo m?todo de Sanger e as seq??ncias preditas de amino?cidos alinhadas e a homologia analisada atrav?s do programa CLUSTAL W. Com exce??o de OMP 7 todas as demais (OMP1, OMP4, OMP5, OMP8, OMP10, OMP14, OMP15, SODB, OPAG1, OPAG3, VIRB3, VIRB9-1, PepA, EF-Tu, AM854) apresentaram n?veis de homologia de 92 a 100% entre os isolados de A. marginale. Destas, apenas OMP1, OMP5, EF-Tu, VirB3, SODB, VIRB9-1 e AM854 apresentaram homologia superior a 72% em rela??o a A. marginale centrale, o qual confere prote??o cruzada contra A. marginale.

O patógeno intracelular Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é endêmico em muitas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A infecção do bovino com A. marginale causa anaplasmose bovina, devido à replicação do microrganismo nos eritrócitos do hospedeiro, sendo responsável por consideráveis perdas econômicas à criação de gado. A transmissão de A. marginale para bovinos ocorre biologicamente por carrapatos ou mecanicamente por insetos hematófagos e instrumentos contaminados com sangue infectado. Uma cepa de A. centrale, naturalmente atenuada tem sido usada extensivamente para controle da anaplasmose bovina em diversas regiões do mundo. A vacina de A. centrale é produzida em bovinos esplenectomizados oriundos de áreas livres de carrapato, todavia uma contaminação acidental por A. marginale é um risco durante o processo de produção. Por este motivo, a produção da vacina deve ser avaliada, para garantir uma amostra de A. centrale livre de contaminação. Durante a fase aguda da doença, o diagnóstico é realizado pela observação de A. marginale por esfregaço sanguíneo, porém durante a fase crônica, este método não tem a sensibilidade necessária para detectar animais que portam níveis baixos de parasitemia. Sendo, o método de detecção molecular o mais indicado para detectar tanto anaplasmose aguda quanto crônica e diferenciar entre A. marginale e A. centrale. Deste modo, no presente trabalho um ensaio de PCR foi padronizado para detectar e diferenciar A. marginale de A. centrale em amostras de sangue bovino. Foram utilizados primers para o gene msp4 de Anaplasma sp. para a amplificação do material obtido a partir de uma extração de DNA de sangue congelado de bovinos experimentalmente infectados com A. centrale e A. marginale. A PCR se mostrou específica, sem amplificar o DNA de outros hemoparasitas. O teste se mostrou sensível para detectar a quantidade 0,25 pg para o DNA de A. centrale e 0,125 pg para detectar o DNA de A. marginale, mostrando-se útil para detectar animais à campo persistentemente infectados com A. marginale e vacinados com A. centrale, os quais foram indetectáveis pela microscopia óptica. Em resumo, a PCR é um teste mais sensível e específico que a microscopia óptica para detectar e diferenciar as espécies de A. centrale e A. marginale, mostrando-se útil para auxiliar no controle de qualidade durante a produção da vacina. / The intracellular pathogen Anaplasma marginale (Rickttsiales: Anaplasmataceae), is endemic in many tropical and subtropical regions of the world. Infection of cattle with A. marginale causes bovine anaplasmosis, due to replication of the microrganism inside the erythrocytes being responsible for considerable economic losses to livestock. The transmission of A. marginale to cattle occurs biologically by ticks or mechanically by blood sucking insects and instruments contaminated with infected blood. A strain of A. centrale, naturally attenuated, has been used extensively to control bovine anaplasmosis in various regions of the world. The vaccine with A. centrale is produced in splenectomized cattle from tick-free areas, however accidental contamination by A. marginale represents a risk during the production process. Therefore, production of the vaccine should be evaluated to ensure a sample of A. centrale free of contamination. During the acute phase of the disease, diagnosis is made by observing A. marginale by blood smear, but during the chronic phase, this method is not as sensitivity as required to detect animals that carry low levels of parasitemia. Being, the molecular detection method more appropriate for detecting both acute and chronic anaplasmosis and differentiate between A. centrale and A. marginale. Thus, in this study a PCR assay was standardized to detect and differentiate A. centrale and A. marginale in samples of bovine blood. Primers for msp4 gene of Anaplasma sp. were used for amplification of material obtained from a DNA extraction of frozen blood from bovines experimentally infected with A. centrale and A. marginale. The PCR showed to be specific, do not amplifying the DNA of other hemoparasites. The test was sensitive to detect the amount of 0.25 pg of DNA from A. centrale and 0.125 pg of DNA from A. marginale, proving to be useful for detecting field animals persistently infected with A. marginale and vaccinated with A. centrale, which were undetectable by optical microscopy. Briefly, PCR is a more sensitive and specific test than the optical microscopy analysis to detect and differentiate the species A. centrale and A. marginale showing to be useful to assist the quality control during the vaccine production.

O patógeno intracelular Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é endêmico em muitas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A infecção do bovino com A. marginale causa anaplasmose bovina, devido à replicação do microrganismo nos eritrócitos do hospedeiro, sendo responsável por consideráveis perdas econômicas à criação de gado. A transmissão de A. marginale para bovinos ocorre biologicamente por carrapatos ou mecanicamente por insetos hematófagos e instrumentos contaminados com sangue infectado. Uma cepa de A. centrale, naturalmente atenuada tem sido usada extensivamente para controle da anaplasmose bovina em diversas regiões do mundo. A vacina de A. centrale é produzida em bovinos esplenectomizados oriundos de áreas livres de carrapato, todavia uma contaminação acidental por A. marginale é um risco durante o processo de produção. Por este motivo, a produção da vacina deve ser avaliada, para garantir uma amostra de A. centrale livre de contaminação. Durante a fase aguda da doença, o diagnóstico é realizado pela observação de A. marginale por esfregaço sanguíneo, porém durante a fase crônica, este método não tem a sensibilidade necessária para detectar animais que portam níveis baixos de parasitemia. Sendo, o método de detecção molecular o mais indicado para detectar tanto anaplasmose aguda quanto crônica e diferenciar entre A. marginale e A. centrale. Deste modo, no presente trabalho um ensaio de PCR foi padronizado para detectar e diferenciar A. marginale de A. centrale em amostras de sangue bovino. Foram utilizados primers para o gene msp4 de Anaplasma sp. para a amplificação do material obtido a partir de uma extração de DNA de sangue congelado de bovinos experimentalmente infectados com A. centrale e A. marginale. A PCR se mostrou específica, sem amplificar o DNA de outros hemoparasitas. O teste se mostrou sensível para detectar a quantidade 0,25 pg para o DNA de A. centrale e 0,125 pg para detectar o DNA de A. marginale, mostrando-se útil para detectar animais à campo persistentemente infectados com A. marginale e vacinados com A. centrale, os quais foram indetectáveis pela microscopia óptica. Em resumo, a PCR é um teste mais sensível e específico que a microscopia óptica para detectar e diferenciar as espécies de A. centrale e A. marginale, mostrando-se útil para auxiliar no controle de qualidade durante a produção da vacina. / The intracellular pathogen Anaplasma marginale (Rickttsiales: Anaplasmataceae), is endemic in many tropical and subtropical regions of the world. Infection of cattle with A. marginale causes bovine anaplasmosis, due to replication of the microrganism inside the erythrocytes being responsible for considerable economic losses to livestock. The transmission of A. marginale to cattle occurs biologically by ticks or mechanically by blood sucking insects and instruments contaminated with infected blood. A strain of A. centrale, naturally attenuated, has been used extensively to control bovine anaplasmosis in various regions of the world. The vaccine with A. centrale is produced in splenectomized cattle from tick-free areas, however accidental contamination by A. marginale represents a risk during the production process. Therefore, production of the vaccine should be evaluated to ensure a sample of A. centrale free of contamination. During the acute phase of the disease, diagnosis is made by observing A. marginale by blood smear, but during the chronic phase, this method is not as sensitivity as required to detect animals that carry low levels of parasitemia. Being, the molecular detection method more appropriate for detecting both acute and chronic anaplasmosis and differentiate between A. centrale and A. marginale. Thus, in this study a PCR assay was standardized to detect and differentiate A. centrale and A. marginale in samples of bovine blood. Primers for msp4 gene of Anaplasma sp. were used for amplification of material obtained from a DNA extraction of frozen blood from bovines experimentally infected with A. centrale and A. marginale. The PCR showed to be specific, do not amplifying the DNA of other hemoparasites. The test was sensitive to detect the amount of 0.25 pg of DNA from A. centrale and 0.125 pg of DNA from A. marginale, proving to be useful for detecting field animals persistently infected with A. marginale and vaccinated with A. centrale, which were undetectable by optical microscopy. Briefly, PCR is a more sensitive and specific test than the optical microscopy analysis to detect and differentiate the species A. centrale and A. marginale showing to be useful to assist the quality control during the vaccine production.

O patógeno intracelular Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é endêmico em muitas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A infecção do bovino com A. marginale causa anaplasmose bovina, devido à replicação do microrganismo nos eritrócitos do hospedeiro, sendo responsável por consideráveis perdas econômicas à criação de gado. A transmissão de A. marginale para bovinos ocorre biologicamente por carrapatos ou mecanicamente por insetos hematófagos e instrumentos contaminados com sangue infectado. Uma cepa de A. centrale, naturalmente atenuada tem sido usada extensivamente para controle da anaplasmose bovina em diversas regiões do mundo. A vacina de A. centrale é produzida em bovinos esplenectomizados oriundos de áreas livres de carrapato, todavia uma contaminação acidental por A. marginale é um risco durante o processo de produção. Por este motivo, a produção da vacina deve ser avaliada, para garantir uma amostra de A. centrale livre de contaminação. Durante a fase aguda da doença, o diagnóstico é realizado pela observação de A. marginale por esfregaço sanguíneo, porém durante a fase crônica, este método não tem a sensibilidade necessária para detectar animais que portam níveis baixos de parasitemia. Sendo, o método de detecção molecular o mais indicado para detectar tanto anaplasmose aguda quanto crônica e diferenciar entre A. marginale e A. centrale. Deste modo, no presente trabalho um ensaio de PCR foi padronizado para detectar e diferenciar A. marginale de A. centrale em amostras de sangue bovino. Foram utilizados primers para o gene msp4 de Anaplasma sp. para a amplificação do material obtido a partir de uma extração de DNA de sangue congelado de bovinos experimentalmente infectados com A. centrale e A. marginale. A PCR se mostrou específica, sem amplificar o DNA de outros hemoparasitas. O teste se mostrou sensível para detectar a quantidade 0,25 pg para o DNA de A. centrale e 0,125 pg para detectar o DNA de A. marginale, mostrando-se útil para detectar animais à campo persistentemente infectados com A. marginale e vacinados com A. centrale, os quais foram indetectáveis pela microscopia óptica. Em resumo, a PCR é um teste mais sensível e específico que a microscopia óptica para detectar e diferenciar as espécies de A. centrale e A. marginale, mostrando-se útil para auxiliar no controle de qualidade durante a produção da vacina. / The intracellular pathogen Anaplasma marginale (Rickttsiales: Anaplasmataceae), is endemic in many tropical and subtropical regions of the world. Infection of cattle with A. marginale causes bovine anaplasmosis, due to replication of the microrganism inside the erythrocytes being responsible for considerable economic losses to livestock. The transmission of A. marginale to cattle occurs biologically by ticks or mechanically by blood sucking insects and instruments contaminated with infected blood. A strain of A. centrale, naturally attenuated, has been used extensively to control bovine anaplasmosis in various regions of the world. The vaccine with A. centrale is produced in splenectomized cattle from tick-free areas, however accidental contamination by A. marginale represents a risk during the production process. Therefore, production of the vaccine should be evaluated to ensure a sample of A. centrale free of contamination. During the acute phase of the disease, diagnosis is made by observing A. marginale by blood smear, but during the chronic phase, this method is not as sensitivity as required to detect animals that carry low levels of parasitemia. Being, the molecular detection method more appropriate for detecting both acute and chronic anaplasmosis and differentiate between A. centrale and A. marginale. Thus, in this study a PCR assay was standardized to detect and differentiate A. centrale and A. marginale in samples of bovine blood. Primers for msp4 gene of Anaplasma sp. were used for amplification of material obtained from a DNA extraction of frozen blood from bovines experimentally infected with A. centrale and A. marginale. The PCR showed to be specific, do not amplifying the DNA of other hemoparasites. The test was sensitive to detect the amount of 0.25 pg of DNA from A. centrale and 0.125 pg of DNA from A. marginale, proving to be useful for detecting field animals persistently infected with A. marginale and vaccinated with A. centrale, which were undetectable by optical microscopy. Briefly, PCR is a more sensitive and specific test than the optical microscopy analysis to detect and differentiate the species A. centrale and A. marginale showing to be useful to assist the quality control during the vaccine production.

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

No Brasil, carrapatos do gênero Rhipicephalus são representados pelas espécies Rhipicephalus sanguineuss.l. (Latreille) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), sendo que a primeira espécie possui especificidade com cães domésticos e a segunda com bovinos. Para o cão, R. sanguineus s.l. é o principal vetor de agentes causadores da babesiose canina e da erliquiose, enquanto que nos bovinos, R. microplus é responsável, principalmente, pela transmissão de agentes causadores da babesiose e anaplasmose. Alguns dos patógenos causadores dessas doenças são difíceis de serem cultivados in vitro, e não crescem em meios artificiais, especialmente Anaplasma spp. Assim, muitas linhagens celulares de carrapatos foram desenvolvidas nos últimos 40 anos e têm sido amplamente utilizadas para isolamento e propagação de microrganismos patogênicos. Cultivos celulares obtidos de células embrionárias de carrapatos oferecem um sistema de vetor in vitro, que é útil principalmente para estudos de agentes intracelulares. Dessa forma, a obtenção de culturas de células embrionárias de R. sanguineus (origens tropical e temperada) e de R. (B.) microplus, bem como, sua infecção com Ehrlichia canis e Anaplasma marginale, respectivamente, são objetivos do presente estudo. Os cultivos celulares dessas espécies de carrapatos foram preparados com massas de ovos de diferentes idades e mantidos à 30 °C em meio de cultura L15-B, suplementado com 10% de Triptose Fosfato e 20% de Soro Fetal Bovino. Subcultivos foram realizados após a formação da monocamada celular confluente. As identidades celulares foram confirmadas pela PCR e sequenciamento, utilizando um fragmento do gene mitocondrial 16S rDNA. As sequências das culturas de células de R. sanguineus (tropical e temperada) e de R. microplus foram depositadas no GenBank. Essas culturas de células foram infectadas com E. canis e A. marginale (cepas Jaboticabal), respectivamente, e mantidas em meio L-15B (Vitrocell) suplementado com Soro Fetal Bovino enriquecido com ferro (Hyclone) nas concentrações de 2% e 5%. As células infectadas foram mantidas em propagações sucessivas até a terceira passagem, para novas culturas de células não infectadas, sendo então criopreservadas. O DNA extraído das células infectadas e não infectadas de R. sanguineus (de ambas as origens) e de R. microplus, foi analisado pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR), utilizando os genes E. canis-dsb e msp1β, respectivamente. Propagações de células de carrapatos infectadas para as novas culturas de R. sanguineus (origem tropical) e R. (B) microplus, foram bem sucedidas. Por outro lado, as células de R. sanguineus (origem temperada) não se tornaram infectadas no presente estudo. / In Brazil, ticks of the genus Rhipicephalus are represented by the species Rhipicephalus sanguineus s.l. (Latreille) and Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), being that the first one has specificity with domestic dogs and the second with cattle. For dogs, R. sanguineus s.l. is the main vector of causative agents of canine babesiosis and ehrlichiosis, whereas in cattle, R. microplus is responsible, mainly, for the transmission of agents that cause babesiosis and anaplasmosis. Some of the pathogens that cause these diseases are difficult to grow in vitro, and do not grow on artificial media, especially Anaplasma spp. Therefore, many tick cell lines were developed in the last 40 years and have been used for the isolation and propagation of pathogenic microorganisms. Cell cultures obtained from embryonic tick cells offer an in vitro vector system, which is mainly useful for studies of intracellular agents. The aim of the present study was to obtain cultures of R. sanguineus (tropical and temperate lineages) and R. microplus embryonic cells and their infection with Ehrlichia canis and Anaplasma marginale. Cell cultures from the tick species were prepared with egg masses of different ages and kept at 30 ° C in L15-B culture medium supplemented with 10% Tryptose Broth and 20% Fetal Bovine Serum. Subcultures were done after confluent cell monolayer formation. Cellular identities were confirmed by PCR and sequencing using a 16S rDNA mitochondrial gene fragment. Sequences of R. sanguineus (tropical and temperate) and R. microplus cell cultures were deposited on GenBank. These cell cultures were infected with E. canis and A. marginale (Jaboticabal strains), respectively, and maintained in L-15B medium and Fetal Bovine Serum with iron (Hyclone) supplemented at 2% and 5% concentrations. The infected cells were maintained in successive propagations until the third passage, to new cultures of uninfected cells, and then were cryopreserved. DNA extracted from infected and uninfected R. sanguineus (both origin) and R. microplus cells was analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR) using the E. canis-dsb and msp1β genes, respectively. Propagations of infected tick cells to the new cultures of R. sanguineus (tropical origin) and R. microplus, were successful. On the other hand, the R. sanguineus cells (temperate origin) did become infected in the present study.