O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1156387 bytes, checksum: 78ed9fe351974511a2d1393bbd68273a (MD5) Previous issue date: 2003-02-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The immune response against the pathogen Anaplasma marginale was evaluated after the inoculation, in calves, with the strain AUFV1 2nd passage. For this, routine coloration techniques and immunohistochemistry techniques were performed in slides of superficial limph nodes. In the first week post inoculation, a proliferative response was observed in the paracortical areas and, in the third week, a great number of germinal centers. With the TUNEL technique, many cells in apoptosis were observed, in a number statistically significant six and 13 days post inoculation. Antigens of A. marginale presented by dendritic cells were detected with the Indirect Immunoperoxidase technique six days post inoculation, and these were not observed in the limph node of the negative control animal. The same technique was also performed with the purpose of identifying the surface antigens CD4, CD8 and WC1, and a little augment was observed only on the population of lymphocytes CD4+. Another experiment evolved the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), wich were isolated in the same days the limph nodes were coleted, for studies of proliferation and production of cytokines after reestimulation ex vivo. The mitogen Con A and initial bodies of A. marginale were utilized as positive controls. The PBMCs were estimulated wiht two synthetic peptides based on the structure of the surface protein of A. marginale MSP-2, named 13590 and 13591. A negative control was also utilized, were was added incomplete medium only. On the proliferative tests, only six days post inoculation the peptides were better than the negative control, with numbers statistically significants (p<0,05). On this way, we could conclude that the inoculated animals developed an adaptative immune response against A. marginale, probably evolving T helper cells. In relation to the synthetic peptides tested, we can only afirm that they are good candidates for the development of a vaccine against bovine anaplasmosis, but more studies have to be performed in this area. / Foi avaliada a resposta imune contra o patógeno Anaplasma marginale através da inoculação, em bezerros, da amostra AUFV1 2a passagem. Para tanto, foram realizadas técnicas de coloração de rotina e técnicas imunohistoquímicas em cortes de linfonodos superficiais. Inicialmente, foi observada uma resposta proliferativa na área paracortical e, a partir da terceira semana pós-inoculação, grande reatividade de centros germinais. Através da técnica de TUNEL, foram observadas inúmeras células em apoptose, em número estatisticamente significativo aos seis e 13 dias pós-inoculação. Antígenos de A. marginale apresentados por células dendríticas foram detectados pela técnica da Imunoperoxidase Indireta já aos seis dias pós-inoculação, não sendo observados no linfonodo do animal controle negativo. A técnica da Imunoperoxidase Indireta também foi utilizada para a detecção de antígenos CD4, CD8 e WC1, sendo observado um pequeno aumento apenas de linfócitos CD4+. Paralelamente a estes estudos, foram isoladas células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), nos mesmos dias em que eram feitas as coletas de linfonodos, para estudos de proliferação e de produção de citocinas após reestimulação ex vivo. Como controle positivo, foi utilizado o mitógeno celular Concanavalina A, além de corpúsculos iniciais de A. marginale. As PBMCs foram estimuladas com dois peptídeos sintéticos baseados na estrutura da proteína de superfície de A. marginale MSP-2, os peptídeos 13590 e 13591. Também foi feito um controle negativo, onde era adicionado apenas meio de cultivo incompleto. Nos testes proliferativos, apenas aos seis dias pós-inoculação os peptídeos tiveram desempenho melhor, estatisticamente significativo (p<0,05), com relação ao controle negativo. Dessa forma, pode-se concluir que os animais inoculados desenvolveram uma resposta imune adaptativa contra o A. marginale, provavelmente envolvendo células T auxiliares. Quanto aos peptídeos sintéticos testados, serão necessários mais estudos, podendo-se afirmar apenas que eles são candidatos ao desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o A. marginale.

Anaplasma phagocytophilum and A. marginale are the etiologic agents of human granulocytic anaplasmosis and bovine anaplasmosis, respectively. Both diseases can be severe, even fatal, and protective vaccines for each are lacking. We recently identified A. phagocytophilum outer membrane protein A (ApOmpA) as being critical for cellular invasion and is expressed during infection of mammalian but not tick cells. Disrupting ApOmpA-host cell interactions significantly inhibits A. phagocytophilum entry into host cells. ApOmpA and its A. marginale ortholog, AM854 (A. marginale OmpA; AmOmpA) exhibit 44% amino acid identity. The ApOmpA invasin domain is highly conserved between both proteins. In this study, we investigated the differential expression of AmOmpA in mammalian versus tick cell lines; the serological cross-reactivity between AmOmpA and ApOmpA; the potential role of AmOmpA in mediating interactions with mammalian host cells; and if inhibiting the AmOmpA-host cell interaction impairs A. marginale cellular invasion. AmOmpA is expressed throughout infection of mammalian, but not tick cells. Sera from A. marginale infected cows recognized both AmOmpA and ApOmpA. Sera from cows immunized with an A. marginale OM complex that conferred protection also recognized both proteins. Thus, ApOmpA and AmOmpA share cross-reactive B-cell epitopes. To determine if AmOmpA plays a role in promoting A. marginale infection, we assessed the abilities of recombinant AmOmpA to competitively inhibit infection of mammalian host cells. To examine the cross-reactive properties of OmpA, we showed that preincubation of host cells with GST-ApOmpA and pretreatment of A. marginale with anti-GST-ApOmpA significantly inhibit A. marginale infection of host cells; and that pretreatment of A. phagocytophilum with serum from cows immunized with an A. marginale OM complex reduces its infection of host cells. These studies advance understanding of conservation of OmpA-mediated cellular invasion between Anaplasma species and highlight the potential of OmpA as a vaccinogen that could offer protection against human and veterinary anaplasmoses.

La banquise, qui couvre de larges étendues de l’océan près des pôles, est une composante majeure du climat. Le réchauffement de la planète entraîne sa fonte massive, en particulier en Arctique.Là où l’extension de la banquise diminue, l’augmentation du fetch est associée à une élévation de la hauteur des vagues, laissant penser que les effets liés aux interactions vagues-glace pourraient s’accroître dans le futur. L’évolution rapide de la banquise associée à l’intensification des activités humaines dans les régions polaires pressent à améliorer notre connaissance de ces interactions.La banquise atténue les vagues. Elles peuvent néanmoins s’y propager et briser la glace sur de longues distances. L’atténuation dépend des propriétés de la glace comme l’épaisseur, la taille des plaques... Les plaques de glace une fois cassées sont plus susceptibles de dériver et de fondre. En outre, lors de l’atténuation, les plaques sont poussées dans la direction de propagation des vagues.Une représentation simple de la banquise dans un modèle de vagues intégrant une distribution de la taille des plaques nous a permis de montrer l’importance des mécanismes dissipatifs dans l’atténuation, notamment ceux induits par la flexion de la glace.Après avoir été validé, ce modèle a été couplé à un modèle de glace. La taille des plaques est échangée et utilisée dans le calcul de la fonte latérale. La force exercée par les vagues sur la banquise est également envoyée depuis le modèle de vagues. En été, cette force compacte la glace et tend à diminuer la fonte, augmentant significativement la température et la salinité des eaux de surface au bord de la banquise. / Sea ice, which covers most of the ocean near the poles, is a key component of the climate system. Global warming is driving its massive melting, especially in the Arctic. Where sea ice cover decreases, fetch increases leading to more energetic sea states. This means potentially enhanced wavesice interactions effects in the future. The quick evolution of sea ice extent and volume combined with the intensification of human activities in polar regions urge us to improve our understanding of waves-ice interactions.Sea ice attenuates waves. They can however propagate through it and break it far into the ice cover. Attenuation depends on ice properties such as floe size, thickness, etc. Once broken, resulting floes are more likely to drift and melt. In addition, wave attenuation yields a force which pushes the floes in the direction of wave propagation.A simplified representation of sea ice, including a floe size distribution, has been incorporated in a wave model.It allows us to show the important contribution of dissipative mechanisms in the wave attenuation, especially those induced by the bending of the ice plates. After validation, the modified wave model is coupled to an ice model. The floe size distribution is exchanged in the coupled framework and used in ice lateral melt computation. The force exerted by the waves on the ice floes is sent from the wave model and is shown to compact sea ice in summer. This reduces the melting and significantly increases the temperature and salinity in the surface ocean close to the ice edge.

Submitted by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-04-13T19:13:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Hermann Eduardo Gonzáles Grau.pdf: 650172 bytes, checksum: 32cc0d96230e42711032018d51a55f04 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-04-13T19:42:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Hermann Eduardo Gonzáles Grau.pdf: 650172 bytes, checksum: 32cc0d96230e42711032018d51a55f04 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-13T19:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Hermann Eduardo Gonzáles Grau.pdf: 650172 bytes, checksum: 32cc0d96230e42711032018d51a55f04 (MD5) Previous issue date: 2006-02-18 / Sem bolsa / Foi estudada a transmissão transplacentária do Anaplasma marginale em terneiros ao nascimento, produtos de vacas cronicamente infectadas, sem histórico de anaplasmose aguda durante a gestação. O estudo foi realizado em 30 terneiros e suas matrizes, no Município de Capão do Leão, região sul do Rio Grande do Sul, área de instabilidade enzoótica para A. marginale, onde as condições climáticas são desfavoráveis ao desenvolvimento dos vetores durante o período de inverno, quando as temperaturas médias são inferiores a 15ºC. Foram colhidas amostras de sangue dos terneiros antes da ingestão do colostro, aos 3 a 5 dias de vida, e das matrizes logo após o parto. Os testes sorológicos usados foram Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Ensaio de Imunoadsorção Enzimática Indireto (ELISA I), e o exame direto foi através de Reação da Polimerase em Cadeia (PCR). Em 63,3% das matrizes, foi diagnosticada a infecção por A. marginale no PCR, enquanto que 100% das mesmas foram sorologicamente positivas na RIFI e 97% no ELISA. A transmissão transplacentária do agente foi constatada através da presença de anticorpos (IgG) em 10 % dos terneiros nascidos de mães positivas, e do DNA do agente em 10,5 % dos mesmos. Foi constatada uma concordância de 93,3% entre os resultados das técnicas sorológicas usadas, sendo que a precisão em relação ao PCR, foi de 80% para RIFI e de 76,7% para ELISA. São discutidos os resultados dos testes e a importância epidemiológica da transmissão transplacentária do A. marginale. / The transplacentary transmission of Anaplasma marginale was study in calves at the birth, from mothers cronically infected, without medical history of acute anaplamosis during the pregnancy. The study was carried out using 30 calves and their mothers, from Capão do Leão county, in the southern region of Rio Grande do Sul state, Brazil, which represents an area of enzootic instability to A.marginale infection, where during the winter season, the climatic conditions are hostile to the development of the vectors. The blood samples of the calves were collected before the colostrum ingest, from 3 to 5 days of live, and the mothers were also collected. The serological tests used were Indirect Fluorescent Antibody Technique (IFAT) and Indirect ELISA; the direct examination was carried out by Polymerase Chain Reaction (PCR). The results presented in the mothers were 63,3% in the direct examination by PCR test and in the indirect serological tests, IFAT and Indirect ELISA the percentile of positive, were respectively, 100% and 97%, to the infection by A.marginale. The transplacentary transmission of the agent was determined by the presence of antibodies (IgG) in 10% of the calves born of positive mothers, and by the agent DNA in 10,5% of them. An agreement of 93,3% was observed between the results of the serological techniques used, the precision in relation to the PCR test was 80% to IFAT and 76,7% to Indirect ELISA. The results of the tests and epidemiological importance of the transplacentary transmission of the A.marginale, are discussed.

L'objet de cette thèse est la convergence structure-fonction dans les systèmes complexes et ses applications aux systèmes vivants et aux systèmes technico-économiques. Après avoir défini la modularité et identifié les difficultés associées à sa définition, cette thèse formalise le concept de convergence structure-fonction dans les systèmes évolutifs et fonctionnels et montre son intérêt pour l'évolutivité et la robustesse de ces systèmes. Ensuite, elle applique ce concept à des problématiques réelles de systèmes évolutifs et fonctionnels en biologie et en économie afin d'illustrer son utilité. Ainsi, dans le cadre de la génomique, cette thèse montre que la longueur des opérons bactériens, qui sont à la fois des modules structurels et fonctionnels, est limitée du fait de contraintes dues à l'interaction des mécanismes de transcription et de réplication. Ensuite, elle fait l'hypothèse que la modularité structurelle des points chauds de recombinaison correspond au moins partiellement à la modularité fonctionnelle des gènes. Ceci permet de développer une nouvelle méthode d'analyse des études d'association génétique basée sur un découpage en régions géniques du génome dans le but de faciliter la compréhension du mécanisme fonctionnel de leur action sur le caractère étudié en analysant directement l'association de gènes ou de groupe de gènes avec ce caractère. Sur le plan structurel, les résultats sont d'une qualité comparable à ceux des méthodes classiques. En revanche, le découpage en régions devra encore être affiné afin d'obtenir une analyse fonctionnelle pleinement utile. Enfin, dans le cadre de la libéralisation du marché européen de l'électricité, la correspondance effective entre structure et fonction de chaque acteur issu de la restructuration fait supposer que le principe de convergence structure-fonction y est bien appliqué. Cependant, des difficultés subsistent avant de parvenir à mettre en place des relations structurelles permettant d'atteindre l'optimum souhaité. Celui-ci inclut des échanges d'énergie à l'origine des contraintes couplantes entre les acteurs. A partir de la théorie de la décomposition par les prix, nous proposons un cadre permettant de définir des tarifs propres à les faciliter, en particulier celles liant producteurs et transporteurs. En conclusion, cette thèse montre (a) la limite à la convergence structure-fonction que constitue la limite de la longueur des opérons bactériens, (b) la faisabilité de l'utilisation d'un découpage basé sur les limites de gènes afin d'analyser des études d'association génétique à grande échelle et (c) l'importance d'améliorer « la grande boucle » des relations entre producteurs et transporteurs d'électricité afin d'assurer l'optimisation conjointe des investissements en capacité de production et de transport. Elle synthétise l'ensemble de ces résultats dans le cadre conceptuel de la convergence structure-fonction qui postule que la modularité structurelle des systèmes évolutifs et fonctionnels tend à se superposer à leur modularité fonctionnelle afin de leur apporter robustesse et évolutivité.

Bovine anaplasmosis is caused by Anaplasma marginale and A. centrale. The most pathogenic and important species for cattle production is A. marginale, and is widely distributed in tropical, subtropical and temperate regions of the world. A. marginale is an intra-erythrocyte rickettsia of susceptible ruminants, biological and mechanically transmitted by ticks and hematophagous insects. The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of A. marginale in Brazil. The congenital form of transmission in cattle may occur, causing the neonatal anaplasmosis. The outer membrane of A. marginale includes six well characterized major surface proteins, MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 and MSP5, which play important role in the development of the immune response of infected animals. In this study, we have used the Phage Display technology to identify specific peptides that were immunoreactive to monoclonal antibodies anti-A. marginale proteins. Peptide selection was performed using a subtractive selection of a peptide library with 12 random amino acids, Ph.D.-12, expressed on the surface of the M13 filamentous phage concurrently against the anti-MSP1a and anti-MSP2. After four rounds of selection and validation by ELISA, the selected peptides have recognized only the anti-MSP1. Analysis of bioinformatics identified 45 peptides, which showed the protein consensus sequence STxS that was represented in 78% of selected phages. Due to the multiple motif repeats found in MSP1 protein, the STSSxL motif may become an important biological target, with potential use in diagnostic tests and vaccine for the control of Anaplasma marginale. / Anaplasmose bovina é uma infecção causada por Anaplasma marginale e A. centrale. A espécie mais patogênica e de maior importância para bovinos é a A. marginale e está amplamente distribuída nas regiões tropicais, subtropicais e temperada do mundo. A. marginale é uma rickettsia intraeritrocitária de ruminantes susceptíveis, transmitido biológica e mecanicamente por carrapatos e insetos hematófagos. O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal transmissor de A. marginale no Brasil. A forma congênita de transmissão em bovinos pode ocorrer, ocasionando a anaplasmose neonatal. A membrana externa do A. marginale inclui seis proteínas principais de superfície (MSPs) bem caracterizadas, designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5 e desempenham papel importante no desenvolvimento da resposta imune de animais infectados. Para o desenvolvimento deste estudo, foi utilizada a técnica de Phage Display para identificar peptídeos ligantes a anticorpos monoclonais reativos a proteínas de Anaplasma marginale a partir de bibliotecas de peptídeos recombinantes por meio da tecnologia Phage Display. Para seleção dos peptídeos foi realizado uma seleção subtrativa utilizando uma biblioteca de peptídeos com 12 aminoácidos randômicos, Ph.D.-12, expressa na superfície do fago filamentoso M13 concomitantemente contra os anticorpos anti-MSP1a e anti-MSP2. Após quatro ciclos de seleção e validação por ELISA, o conjunto de peptídeos selecionados apresentou ser unicamente reconhecido pelo anticorpo anti- MSP1. Análises de bioinformática identificaram 45 peptídeos, que apresentaram o motivo proteico consenso STxS, representado em 78% dos fagos seqüenciados. Devido aos múltiplos sítios repetidos encontrados na proteína MSP1, o motivo proteíco STSSxL pode ser um importante alvo biológico, com potencial utilização em ensaios diagnósticos e vacinais para o controle de Anaplasma marginale. / Mestre em Genética e Bioquímica

Orientador: Raimundo Souza Lopes / Coorientador: Pedro Paulo Pires / Banca: Regina Kiomi Takahira / Banca: Cecília Braga Laposy / Resumo: O estudo teve como objetivo verificar possíveis alterações hematológicas e bioquímicas que ocorrem no sangue bovino de animais hígidos e parasitados com Anaplasma marginale, conservado por 21 dias em bolsas plásticas contendo Citrato-Fosfato-Dextrose-Adenina (CPDA-1) e avaliar a ação da Riboflavina associada à radiação ultravioleta (UV) na inativação do hemoparasita. Na primeira etapa foram determinados o número de Hemácias (He) e Leucócitos, Hemoglobina (Hb), Volume Globular (VG), Volume Corpuscular Médio (VCM), Proteína Plasmática Total (PPT), Fibrinogênio, Sódio (Na+), Potássio (K+) e Lactato, a cada três dias, durante 21 dias, do grupo I formado por bolsas contendo sangue de bovinos saudáveis e do grupo II, por bolsas com sangue parasitado por A. marginale. Na segunda, foram realizados os exames do Esfregaço Sanguíneo Corado (ESC), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR) antes e após o tratamento com Riboflavina associada à radiação UV, além da inoculação em bezerros para verificar se o parasita mantinha sua infectividade. Estes exames foram repetidos in vivo nos dias sete, 14 e 21 após a inoculação. Na primeira etapa, para ambos os grupos, ocorreu redução dos valores de He, Hb, VG, PPT, Leucócitos e Na+; e aumento no VCM, K+ e Lactato. Na segunda etapa, ocorreu redução da carga parasitária de 30,60% no momento zero (M0) para 15,26% após o tratamento; RIFI de 100% positivo no M0, para 100% negativo após o tratamento. A qPCR demonstrou que o tratamento não promoveu completa eliminação do parasita, mas houve uma inativação parcial, já que os bezerros receptores não adoeceram / Abstract: The objective of this study was to evaluate hematological and biochemical changes in bovine blood from healthy and Anaplasma marginale infected animals after a 21day storage period in plastic bags with Citrate- Phosphate-Dextrose-Adenine (CPDA-1) and also to evaluate the effect of Riboflavin associated with ultraviolet radiation (UV) on the inactivation of the hemoparasite. In the first experimental phase, the number of Erythrocytes (RBC) and Leukocytes, Hemoglobin (Hb), Globular Volume (GV), Mean Corpuscular Volume (MCV), Total Plasma Protein (TPP), Fibrinogen, Sodium (Na+), Potassium (K+) and Lactate was determined every 3 days for 21 days in blood stored in plastic bags from clinically healthy animals (Group I) and in blood stored in plastic bags containing blood from infected animals by Anaplasma marginale (Group II). In the second experimental phase, stained blood smears, indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were performed before and after the treatment with riboflavin associated with UV radiation. Also, calves were inoculated to evaluate the infectivity of the parasite. These exams were repeated at day 7, 14 and 21 after inoculation. In the first phase a reduction in RBC, Hb, GV, TPP, Leukocytes and Na+ and an increase in MCV, K+ and Lactate were observed in both groups. In the second phase, the parasite load of 30.60% at time zero (T0) was reduced to 15.26% after the treatment; IFA of 100% positive at T0 was reduced to 100% negative after the treatment. qPCR revealed that total elimination of the parasite by the treatment was not observed but there was a partial inactivation was observed since the recipient calves did not get sick / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-28Bitstream added on 2014-06-13T18:06:40Z : No. of bitstreams: 1 lopes_lg_me_botfmvz.pdf: 686515 bytes, checksum: 3ad48498b96d5ac5f9774f231d0a6ff9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estudo teve como objetivo verificar possíveis alterações hematológicas e bioquímicas que ocorrem no sangue bovino de animais hígidos e parasitados com Anaplasma marginale, conservado por 21 dias em bolsas plásticas contendo Citrato-Fosfato-Dextrose-Adenina (CPDA-1) e avaliar a ação da Riboflavina associada à radiação ultravioleta (UV) na inativação do hemoparasita. Na primeira etapa foram determinados o número de Hemácias (He) e Leucócitos, Hemoglobina (Hb), Volume Globular (VG), Volume Corpuscular Médio (VCM), Proteína Plasmática Total (PPT), Fibrinogênio, Sódio (Na+), Potássio (K+) e Lactato, a cada três dias, durante 21 dias, do grupo I formado por bolsas contendo sangue de bovinos saudáveis e do grupo II, por bolsas com sangue parasitado por A. marginale. Na segunda, foram realizados os exames do Esfregaço Sanguíneo Corado (ESC), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR) antes e após o tratamento com Riboflavina associada à radiação UV, além da inoculação em bezerros para verificar se o parasita mantinha sua infectividade. Estes exames foram repetidos in vivo nos dias sete, 14 e 21 após a inoculação. Na primeira etapa, para ambos os grupos, ocorreu redução dos valores de He, Hb, VG, PPT, Leucócitos e Na+; e aumento no VCM, K+ e Lactato. Na segunda etapa, ocorreu redução da carga parasitária de 30,60% no momento zero (M0) para 15,26% após o tratamento; RIFI de 100% positivo no M0, para 100% negativo após o tratamento. A qPCR demonstrou que o tratamento não promoveu completa eliminação do parasita, mas houve uma inativação parcial, já que os bezerros receptores não adoeceram / The objective of this study was to evaluate hematological and biochemical changes in bovine blood from healthy and Anaplasma marginale infected animals after a 21day storage period in plastic bags with Citrate- Phosphate-Dextrose-Adenine (CPDA-1) and also to evaluate the effect of Riboflavin associated with ultraviolet radiation (UV) on the inactivation of the hemoparasite. In the first experimental phase, the number of Erythrocytes (RBC) and Leukocytes, Hemoglobin (Hb), Globular Volume (GV), Mean Corpuscular Volume (MCV), Total Plasma Protein (TPP), Fibrinogen, Sodium (Na+), Potassium (K+) and Lactate was determined every 3 days for 21 days in blood stored in plastic bags from clinically healthy animals (Group I) and in blood stored in plastic bags containing blood from infected animals by Anaplasma marginale (Group II). In the second experimental phase, stained blood smears, indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were performed before and after the treatment with riboflavin associated with UV radiation. Also, calves were inoculated to evaluate the infectivity of the parasite. These exams were repeated at day 7, 14 and 21 after inoculation. In the first phase a reduction in RBC, Hb, GV, TPP, Leukocytes and Na+ and an increase in MCV, K+ and Lactate were observed in both groups. In the second phase, the parasite load of 30.60% at time zero (T0) was reduced to 15.26% after the treatment; IFA of 100% positive at T0 was reduced to 100% negative after the treatment. qPCR revealed that total elimination of the parasite by the treatment was not observed but there was a partial inactivation was observed since the recipient calves did not get sick

Anaplasmosis, a persistent intraerythrocytic infection of cattle by Anaplasma marginale, causes severe anemia and a higher rate of abortion, resulting in significant loss to both dairy and beef industries. Clinical diagnosis is based on symptoms and confirmatory laboratory tests are required. Currently, all the diagnostic assays have been developed with whole antigens with indirect ELISA based on multiple epitopes. In a pioneer investigation we demonstrated the use of critical motifs of an epitope as biomarkers for immunosensor applications. Mimotopes of the MSP1a protein functional epitope were obtained through Phage Display after three cycles of selection of a 12-mer random peptide library against the neutralizing monoclonal antibody 15D2. Thirty-nine clones were randomly selected, sequenced, translated and aligned with the native sequence. The consensus sequences SxSSQSEASTSSQLGA was obtained, which is located in C-terminal end of the 28-aa repetitive motif of the MSP1a protein, but the alignment and sequences variation among mimotopes allowed us to map the critical motif STSSxL within the consensus sequence. Based on these results, two peptides were chemically synthesized; one based on the critical motif (STSSQL, Am1) and the other based on the consensus sequence aligned with the native epitope (SEASTSSQLGA, Am2). Sera from 24 infected and 52 healthy animals were tested by ELISA for reactivity against Am1 and Am2, which presented sensitivities of 96% and 100%, respectively. The Am1 peptide was incorporated onto a biolectrode (graphite modified with poly-3-hydroxyphenylacetic acid) and direct serum detection was demonstrated by impedance, differential pulse voltammetry, and atomic force microscopy. The electrochemical sensor system proved to be highly effective in discriminating sera from positive and negative animals. These immunosensors were highly sensitive and selective for positive IgG, contaminants did not affect measurements, and were based on a simple, fast and reproducible electrochemical system. / Anaplasmose, uma infecção intraeritrocitária obrigatória de bovinos, causada pela Anaplasma marginale, causa severa anemia e alta taxa de aborto, resultando em perda significativa para a indústria de laticínios e carne. O diagnóstico clínico é baseado nos sintomas e exames laboratorias confirmatórios são necessários. Atualmente, todos os ensaios de diagnósticos têm sido desenvolvidos com ELISA indireto de antígenos totais baseado em epítopos múltiplos. Em uma investigação pioneira demonstramos o uso de motivos críticos de um epítopo como biomarcador para a aplicação em imunossensores. Mimotopos do epítopo funcional da proteína MSP1a foram obtidos por meio de Phage Display, após três ciclos de seleção, de uma biblioteca randômica de peptídeos 12-mer contra o anticorpo monoclonal 15D2. Trinta e nove clones foram selecionados aleatoriamente, sequenciados, traduzidos e alinhados com a sequência nativa. Foi obtida a sequência consenso SxSSQSEASTSSQLGA, que está localizada na extremidade C-terminal do motivo repetitivo de 28-aa da proteína MSP1a, mas o alinhamento e a variação das sequências entre os mimotopos nos permitiu mapear o motivo crítico STSSxL dentro da sequência consenso. Com base nesses resultados, dois peptídeos foram quimicamente sintetizados; um baseado no motivo crítico (STSSQL, Am1) e o outro baseado na sequência consenso alinhada com o epítopo nativo (SEASTSSQLGA, Am2). Soro de 24 animais infectados e 52 animais saudáveis foram testados por ELISA quanto à reatividade contra Am1 e Am2, que apresentou sensibilidades de 96% e 100%, respectivamente. O peptide Am1 foi incorporado a um bioeletrodo (grafite modificado com ácido poli-3-hidroxyfenilacético) e a detecção direta de soro foi demonstrada por impedância, voltametria de pulso diferencial e microscopia de força atômica. O sistema de sensor eletroquímico provou ser altamente eficaz em soro de animais positivos de negativos. Este imunossensor foi altamente sensível e seletivo para IgG positiva, contaminantes não afetaram as medições, e foram baseados e um sistema simples, rápido e reprodutível. / Doutor em Genética e Bioquímica