Neste estudo analisamos o envolvimento de E3 ligases sob três aspectos da plasticidade muscular esquelética: a perda de massa decorrente do desuso, a manutenção de fibras tipo I e II e a regeneração do tecido muscular. O primeiro objetivo foi determinar se leucina atenuaria a perda de massa provocada pela atrofia. Nossos dados mostraram que este aminoácido evitou a perda de massa, sobretudo através da inibição da expressão de E3 ligases. A seguir, analisamos se a ausência de duas E3 ligases, MuRF1 e MuRF2, poderia alterar a proporção de miofibras tipo I e tipo II. Detectamos que na ausência destas E3 ligases, a identidade de fibras tipo II era perdida, além destas fibras estarem protegidas da atrofia sem MuRF1. Por fim, analisamos o papel de MuRF1 e MuRF2 durante a regeneração. Os resultados mostraram que estas E3 ligases em conjunto são cruciais para a fisiologia das células-satélites e portanto para a regeneração do tecido. Esta tese mostrou que determinadas E3 ligases exercem um papel crucial para a plasticidade muscular. / In the present thesis we analyzed the involvement of E3 ligases under three aspects of skeletal muscle plasticity: mass loss resulting from disuse, maintenance of fiber type I and II and regeneration of muscle tissue. Our first aim was to determine whether leucine, was able to attenuate the mass loss caused by wasting. Our results showed that this amino acid prevented the mass loss, mainly by inhibiting the expression of E3 ligases. The second aim was to determine whether the absence of two E3 ligases, MuRF1 and MuRF2, could alter the proportion of type I and type II fibers. We found that in the absence of these E3 ligases, the identity of type II fibers was lost, and these fibers were protected against atrophy in the absence of MuRF1. Lastly, we analyze the role of MuRF1 and MuRF2 in muscle tissue regeneration. The results showed that these E3 ligases together are crucial to satellite-cells physiology and consequently an adequate tissue regeneration. This thesis show that certain E3 ligases can play a crucial role in muscle plasticity.

Triptofano (TRP), um amino ácido essencial, é metabolizado por duas vias principais, a via das quinureninas e a via serotonérgica. Em ambas as vias há a possibilidade de formação de compostos ativos no sistema imune que se caracterizam pelas ações imunossupressoras e indutoras de tolerância. Na via serotonérgica há a formação de serotonina (5-HT) e em alguns tecidos de melatonina (MEL). Este composto pode ainda ser oxidado por ação de peroxidases aos seus produtos de abertura de anel indólico o AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-metoxiquinuramina) e AMK (N1-acetil-5-metoxiquinuramina). Já na via das quinureninas, o TRP é diretamente metabolizado à N-formilquinurenina (NFK) e este é rapidamente deformilado a quinurenina (QUIN). Neste projeto avaliamos qual o efeito do choque endotóxico induzido por injeção endovenosa de LPS (1 mg/kg) sobre a biodisponibilidade de TRP e formação de seu metabólito QUIN. Este estudo foi realizado em condições controle e na vigência de sobrecarga de TRP (administração subcutânea de 0,8 mg/kg). Utilizamos ratos machos Wistar com 30 dias separados em quatro grupos: GI (controle), GII (LPS), GIII (TRP) e GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/Kg) foi injetado por via subcutânea nos tempos 0 e 2 horas. Quando injetado, LPS (1 mg/kg) foi administrado por via intravenosa no tempo 2 horas. Após 1 hora da última administração, sangue e cérebro foram coletados. O cérebro foi seccionado em três regiões: cerebelo, córtex e mesencéfalo, os quais foram processados para obtenção de homogenatos. Tanto os homogenatos quanto o soro foram tratados com acetona para extração de TRP e seus metabólitos. A análise destes compostos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A administração de TRP elevou significativamente a sua concentração no soro e no SNC. Quando da administração de LPS no grupo que já havia recebido sobrecarga de TRP (GIV) houve uma marcada elevação de TRP e de QUIN séricos e das regiões do SNC, especialmente na região do córtex. Concluímos que na vigência de choque endotóxico há um aumento da biodisponibilidade de TRP, tanto no soro como no SNC e que há um aumento da metabolização deste pela rota das quinureninas, possivelmente via IDO. Estes resultados contribuem para a compreensão da toxicidade de TRP, especialmente relevante no caso em que haja um choque endotóxico concomitante e evidencia o córtex como uma região mais susceptível para os efeitos tóxicos do TRP. / Tryptophan (TRP) is an essential amino acid, metabolized by two main paths; the kynurenine and the serotonergic pathways. In both, there is the possibility of generation of biologic active compounds, especially on the immune system leading to immunosuppression and tolerance. In the serotonergic path there is the formation of serotonine (5-HT) and in some tissues of melatonine (MEL). The latter can be oxidized by the action of peroxidases to its indole ring opening product AFMK (N1-acetil-n2-formil-5-methoxikynuramine) and AMK (N1-acethyl-5-methoxykynuramine). In the kynurenine path, TRP is metabolized to N-formylkynurenine (NFK) that is deformilated to kynurenine (KYN). In this study we evaluated the effect of a endotoxic skock induced by an intravenous injection of LPS (1 mg/kg) on the bioavailability of TRP and formation of KYN. This study was carried out in control conditions and on TRP overload (subcutaneous administration of 0,8 mg/Kg). One month old male Wistar rats were divide in four groups: GI(control), GII(LPS), GIII(TRP) and GIV (TRP+LPS). TRP (0,8 mg/kg) was subcutaneously injected at zero and 2h times. When injected, LPS (1mg/kg) was intravenously administered at 2 h. After one hour from the last administration, blood and brain were collected. Brain is separated in cerebellum, midbrain and cortex and was lysed for the preparation of homogenates. Both, serum and homogenates were extracted in acetone; TRP and KYN were analyzed by HPLC. TRP overload caused a significant increase in its concentration in serum and brain. When LPS was administered in conjunction with TRP overload (GIV) there was a remarkable increase in TRP and KYN in serum and brain, especially in cortex. Our conclusion is that in the bioavailability of TRP, in serum and in brain, and its metabolization to kynurenine is increased by inflammation. IDO is probably involved in this condition. Our results contribute to the knowledge of TRP toxicity, particularly with a concomitant inflammation and demonstrate the cortex as a region of more susceptibility to TRP toxicity.

Nesse trabalho os 20 aminoácidos foram classificados, a fim de investigar possíveis aplicações em dispositivos. Como critério de classificação foi utilizada uma propriedade molecular denominada softness químico. A classificação foi feita por uma rede neural artificial denominada Mapa Auto-Organizável. Esse estudo permitiu identificar similaridades entre diferentes grupos químicos presentes em aminoácidos. Os aminoácidos que apresentam grupos hidroxílicos (OH) foram classificados como similares aos aminoácidos alifáticos, que apresentam apenas carbono e hidrogênio em suas cadeias laterais. O aminoácido histidina, que apresenta uma estrutura cíclica do tipo imidazol (C3H4N2), foi classificado como similar aos aminoácidos aromáticos fenilalanina, triptofano e tirosina, que apresentam um anel do tipo fenil (C6H5) em suas estruturas. Por esse motivo foi investigada a relação entre softness e aromaticidade. Este conceito ainda não possui uma definição formal, pois ele se relaciona com diversas propriedades físicas e químicas, por esse fato não pode ser medido experimentalmente ou calculado teoricamente. Nesse trabalho mostra-se o softness como candidato para explicar este conceito, pois se relaciona com diferentes critérios de aromaticidade.

Este trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar atividade da redutase do nitrato (RN), sintetase da glutamina (GS) e conteúdo de proteína total solúvel (PTS) em folhas de cafeeiro durante o desenvolvimento dos frutos em condições de campo. O experimento foi instalado em blocos ao acaso em esquema fatorial 3x6, constituído pela combinação de 3 doses de N (0, 150 e 350 kg ha-1) e avaliado em seis diferentes fases fenológicas (janeiro, fevereiro, março, abril, maio e junho), com sete repetições. No experimento foi utilizada a cultivar Catuaí Vermelho IAC 44 com seis anos implantada num Nitossolo Vermelho Eutroférrico, no município de Piracicaba-SP. Com relação à atividade da RN, GS e PTS em função das doses de N verificou incremento nos valores da atividade destas enzimas e do teor de proteína total solúvel em função da dose de N. As maiores atividades da RN foram obtidas no mês de janeiro (0,834, 1,370 e 1,781 µmol NO2 - g-1 MF h-1), bem como para a GS (82,47, 95,31 e 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS). O teor de proteína solúvel total (PTS) apresentou a mesma tendência (0,62, 5,66 e 6,52 mg mL-1). Estes valores foram obtidos em frutos na fase chumbinho. Durante o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro a atividade das enzimas estudadas e o conteúdo de PTS foliar diminuíram, ao longo do tempo de janeiro a junho (maturação frutos). / The aim of this work was to evaluate the nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) activity, total soluble protein content (PTS) in coffee leaves during the fruits development in field conditions. The study was carried out in ESALQ/USP (University of São Paulo), Piracicaba, São Paulo, Brazil in a Red Nitosol eutrofic. The experimental design was a complete randomized, in a factorial outline 3 x 6, constituted by combination of 3 levels (0, 150 and 350 kg ha-1) of nitrogen in six different periods (January, February, March, April, May and June) in plants (Cultivar Catuaí Vermelho IAC 44). The RN, GS activity and leaves PTS content was linear increased in relation of levels of N applied. In accordance with the present study, the enzymes had presented greater activity during the January than other months (0,834, 1,370 and 1,781 µmol NO2 - g-1 DF h-1) of RN; (82,47, 95,31 and 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS) of GS and (0,62, 5,66 and 6,52 mg mL-1) of total soluble protein (PTS), in the treatments T0, T1 and T2, respectively. In January, the fruits were young grains and this period the coffee plant has high enzymatic activity. However, the capacity of nitrate assimilation during the annual cycle of coffee plants can be change through the environment and climatic variations and this phase (January) was verified a great precipitation. During the coffee fruits development, the RN and GS activity and the foliar PTS content had decreased, this occur due to the process of senescence of leaves, promote it the remobilization to other plant organs, as seed filling.

trans-Sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) pertence à família de glicoproteínas de superfície do parasita e constitui um dos poucos exemplos naturais de glicosiltransferases superficiais encontradas em eucariotes. T. cruzi é incapaz de sintetizar ácido siálico e utiliza esta enzima para retirar este monossacarídeo de glicoconjugados do hospedeiro para sialilar moléculas aceptoras, como mucina-GPI, presentes na sua membrana plasmática. Esta enzima é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações -2,3 com moléculas de galactose aceptoras na superfície do parasita. As moléculas de mucina sialiladas estão envolvidas no processo de aderência e subseqüente penetração do parasita nas células do hospedeiro. Considerando a heterogeneidade das moléculas de mucina de T. cruzi, não existem compostos disponíveis que atuem como substratos glicopeptídicos sintéticos. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de métodos químicos e químico-enzimáticos de síntese de glicopeptídeos de mucina de T.cruzi para investigação da natureza das interações moleculares críticas envolvidas no reconhecimento e processamento de glicosídeos contendo ácido siálico, na presença de trans-sialidase. O melhor entendimento destas interações conduziu ao planejamento racional de potenciais inibidores seletivos de trans-sialidase de T. cruzi. Alguns dos principais glicopeptídeos, obtidos por metodologias de síntese em fase sólida e síntese químico-enzimática com a enzima 1,4-galactosiltransferase (1,4-GalT) foram: NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 e NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. Como precursores destes glicopeptídeos os blocos de construção GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 e LacNAc-FmocThrOH 75 foram sintetizados por meio de reações de glicosilação do aminoácido treonina 18, contendo os grupos protetores N-Fmoc e O-Bn, com os correspondentes açúcares GlcNAcCl 12, GalBr 13 e LacN3Cl 33, seguidas de reações de hidrogenólise (10% Pd-C/ H2) para desproteção do grupo O-Bn e posterior acoplamento em cadeia peptídica rica em seqüência de treonina. Os aminoácidos glicosilados GlcNAc-ThrOH 22 e GlcNAc-ThrOH 23, totalmente desprotegidos, foram empregados em reações enzimáticas com a enzima 1,4-GalT, sendo obtidos os dissacarídeos glicosídicos LacNAc-ThrOH 53 e LacNAc-ThrOH 41 (também sintetizado quimicamente). Os dissacarídeos glicosídicos 41 e 53, os glicopeptídeos 2 e 4 e o aminoácido glicosilado Gal- ThrOH 28 foram submetidos aos ensaios enzimáticos com a enzima TcTS, sendo verificada a sialilação de todos os aceptores testados em rendimentos elevados, o que confirmou que estes compostos podem atuar como potenciais substratos da enzima TcTS. / Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) belongs to the family of glycoproteins expressed on the surface of the parasite and constitutes one of the few examples of natural surface glycosyltransferases found in eucariotes. T. cruzi can not synthesize sialic acid itself and uses a trans-sialidase enzyme to scavenge this monosaccharide from host glycoconjugates to sialylate acceptors molecules, such as GPI (glycosylphosphatidylinositol)-anchored mucins, that are present in parasite plasma membrane. This enzyme is specific to catalise, preferentially, the transference of sialic acid to mucin glycoproteins, originating -2,3- linkages with acceptor galactose molecules in the parasite surface. The sialylated mucin molecules are involved in the attachment and subsequent penetration of the parasite into host cells. Given the heterogeneity of T. cruzi mucin molecules, there are no suitable synthetic occurring sources of TcTS glycopeptide substrates. Thus, the objective of this work was the development of chemical and chemoenzymatic methods of synthesis of T. cruzi mucin glycopeptides in order to investigate the nature of the molecular interactions involved in recognition and processing of containing sialic acid glycosides, in the presence of trans-sialidase. A better understanding of these interactions led to drug design of selective potential inhibitors for T. cruzi trans-sialidase. Some of the main glycopeptides obtained by methods of solid phase and chemoenzymatic synthesis with 1,4-galactosyltransferase (1,4-GalT) enzyme were: NH2(Thr)2-(LacNAc)- (Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 and NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3- (LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. As precursors of these glycopeptides, the building blocks GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 and LacNAc- FmocThrOH 75 were synthesized by glycosylation reactions of the threonine amino acid 18, containing the protecting groups N-Fmoc and O-Bn, with the correspondent sugars GlcNAcCl 12, GalBr 13 and LacN3Cl 33, followed by hydrogenolysis reactions (10% Pd- C/ H2) for deprotection of O-Bn group and later coupling into the peptide chain rich in threonine sequence. The glycosylated amino acids GlcNAc-ThrOH 22 and GlcNAc-ThrOH 23, totally deprotected, were employed in enzymatic reactions with 1,4-GalT, being obtained the disaccharide glycosides LacNAc-ThrOH 53 and LacNAc-ThrOH 41 (also chemically synthesized). The disaccharide glycosides 41 and 53, the glycopeptides 2 and 4 and the glycosylated amino acid Gal-ThrOH 28 were submitted to enzymatic assays with TcTS enzyme, being verified the sialylation of all tested acceptors in high yields, which confirmed that these compounds can act as potential acceptors substrates for TcTS enzyme.

A principal fonte de proteínas para alimentação humana e animal é fornecida pelas sementes de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis em endospermas de milho normal e mutantes opaco-2 e floury foram determinadas por HPLC. A análise indicou que a concentração total de aminoácidos solúveis variou entre os mutantes e seus tipos selvagens. Nos mutantes o10, o11 e o13, as concentrações foram aumentadas significativamente quando comparadas ao tipo selvagem W22, enquanto os mutantes o1, o2, o13, fl1 e fl2 exibiram baixas concentrações em relação ao seu respectivo tipo selvagem Oh43. Resultados similares foram obtidos para os mutantes o5, o7 e fl3 em relação aos seus tipos selvagens (B79, B37 e WT3, respectivamente). Para metionina, o mutante o2 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Diferenças significativas não foram observadas para os outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. Os resultados sugerem que as altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel. / For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperms of wildtype and maize opaque and floury mutants have been determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants and their wild-type counterparts varied depending on the mutant. In the o10, o11 and o13 mutants the concentrations were significantly increased when compared to their wild-type counterpart W22, whereas the mutants o1, o2, o13, fl1 and fl2 exhibited lower concentrations when compared to the wild-type Oh43, Similar results were observed for o5, o7 and fl3 in relation to their specific wild-type counterparts (B79, B37 and WT3, respectively). For soluble methionine content, o2 and Oh43 exhibited the highest concentrations. Significant differences were not observed for other amino acids such as lysine and threonine. The results suggest that the high-lysine concentrations indicated originally for these mutants must be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not in the soluble form.

O refluxo vésico-ureteral (RVU) é uma das condições urológicas comumente diagnosticada entre crianças. Altos graus dessa condição podem causar cicatrização renal, insuficiência renal e hipertensão arterial. A uretrocistografia miccional é o método mais comumente utilizado para o diagnóstico, no entanto, esse procedimento envolve sedação, cateterismo vesical e expõe a criança a uma quantidade significativa de radiação. A investigação metabolômica pode fornecer novos entendimentos sobre a doença e visa a descoberta de metabólitos específicos associados a ela. Assim, existe um potencial considerável para a implementação de perfil metabólico em análises clínicas. Dessa forma, buscou-se estabelecer uma alternativa não invasiva para identificar crianças com o RVU através da metabolômica. Para a investigação metabolômica alvo um método por eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas (CE-MS) com analisador to tipo ion trap foi desenvolvido e validado para a determinação de 27 aminoácidos em urina. Os parâmetros experimentais relacionados às configurações da interface CE-MS, eletrólito (BGE) e espectrômetro de de massas (MS) foram otimizados, proporcionando uma boa separação dos 27 aminoácidos, incluindo os isômeros L-leucina, L-isoleucina e L-alloisoleucina, em menos de 30 min. O líquido auxiliar (SHL) foi composto de 0,5% (v/v) ácido fórmico em 60% (v/v) água/metanol à uma vazão de 5 µL min-1. O BGE consistiu de 0,80 mol L-1 de ácido fórmico e 15% (v/v) de metanol. Um procedimento de stacking por pH foi implementado para aumentar a detectabilidade (uma solução de NH4OH a 12,5% (v/v) foi injetada a 0,5 psi/9 s antes das amostras). O método foi validado de acordo com os protocolos FDA e ICH, exibindo parâmetros aceitáveis. A quantificação bem sucedida dos aminoácidos em amostras de urina de um estudo piloto do RVU foi alcançada. A avaliação estatística dos resultados mostrou que alguns dos aminoácidos avaliados podem carregar informações que possibilitam discriminar as amostras de urina entre os grupos teste e controle. Para a análise metabolômica global urinária, métodos por RPLC-MS e HILIC-MS foram otimizados. Cinco colunas com diferentes propriedades foram investigadas para RPLC e quatro colunas para HILIC; adicionalmente, foram investigados a influência dos aditivos e pH da fase móvel. As condições ótimas foram determinadas avaliando o formato de pico, a relação sinal-ruído, o tempo de retenção, o número de molecular features detectados e sua distribuição durante o gradiente de eluição. A melhor condição obtida para RPLC utiliza a coluna CSH C18 e fase móvel composta por 0,1% (v/v) ácido fórmico em água (A) e 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila (B). Para HILIC, o melhor desempenho foi obtido com a coluna zwitteriônica ZIC-HILIC e fase móvel composta por 10 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (B) e 95% (v/v) acetonitrila e 5% 200 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (A). As amostras de urina dos grupos controle e teste foram submetidas à análise metabolômica global por RPLC-MS usando o método otimizado e por CESI-MS. Os resultados indicaram que diversas rotas metabólicas podem ter sido alteradas pelo RVU. Alteração dos níveis de carnitinas e acilcarnitinas, aminoácidos e derivados, purinas e outros foi observada. Ainda, a presença de acilcarnitinas na urina podem indicar danos mitocondriais e a diminuição de triptofano e aumento do ácido quinurênico indicam uma alteração no metabolismo do triptofano. / Vesicoureteral reflux (VUR) is one of the most commonly urologic conditions diagnosed among children. A high degree of this condition can cause kidney scarring, kidney failure and high blood pressure. Voiding cystourethrography is the standard method for diagnosis; however, this procedure involves sedation, bladder catheterization and exposes the child to a significant amount of radiation. Metabolomics has provided new insights about the disease and aims to discover specific metabolites associated with it. Thus, there is a considerable potential for the implementation of metabolic profile in clinical analyses. Thus, we attempted to establish a noninvasive alternative to identify children with VUR through metabolomics approach. For target metabolomics, a CE-MS method was developed and validated for the separation and quantitative analysis of 27 amino acids in urine. Experimental parameters related to the CE-MS interface (based on co-axial sheath liquid, SHL), background electrolyte (BGE) and mass spectrometer (MS) settings were optimized providing a good separation of 27 amino acids, including the isomers L-leucine, L-isoleucine and L-alloisoleucine, in less than 30 min. The SHL was composed of 0.50% (v/v) formic acid in 60% (v/v) methanol-water delivered at a flow rate of 5 µL min-1. The BGE consisted of 0.80 mol L-1 formic acid and 15% (v/v) methanol. A pH stacking procedure was implemented to enhance sensitivity (a 12.5% (v/v) NH4OH solution was injected at 0.5 psi/9 s prior to samples). The proposed method was thoroughly validated according to FDA and ICH protocols exhibiting acceptable parameters. A successful quantification of amino acids in urine samples from the VUR cohort was achieved. The statistical evaluation of the results showed that some of the amino acids may carry information for the discrimination of the urine samples between the test and control groups. For untargeted metabolomics analysis, methods by RPLC-MS and HILIC-MS were optimized. Five columns with different properties were investigated for RPLC and four columns for HILIC; additionally, the influence of additives and pH of the mobile phase were investigated. The optimum conditions were determined assessing the peak shape, signal-to-noise ratio, retention time, number of molecular features detected and their distribution during the elution gradient. The best condition obtained for RPLC uses CSH C18 column and mobile phase composed by 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile (B). For HILIC, the best performance was obtained with the zwitterionic ZIC-HILIC column and mobile phase composed by 10 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (B) and 95% (v/v) acetonitrile and 5% (v/v) 200 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (A). Urine samples from the control and test groups were submitted to global metabolomics analysis by RPLC-MS using the optimized method and by CESI-MS. The results indicated that several metabolic pathways may have been altered by VUR. Changes of carnitine and acylcarnitine levels, amino acids and derivatives, purines and others was observed. Furthermore, the presence of acylcarnitines in the urine may indicate mitochondrial damage and the decrease of tryptophan and increase of the kynurenic acid indicate a change in the metabolism of tryptophan.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-12-04T18:56:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Alberto Brandes.pdf: 1218593 bytes, checksum: 1b589ffb360fcb04e97f57d945af5132 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-04T18:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Alberto Brandes.pdf: 1218593 bytes, checksum: 1b589ffb360fcb04e97f57d945af5132 (MD5) Previous issue date: 2018-09-28 / O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos de Allzyme SSF®, um complexo multienzimático contendo pectinase, protease, fitase, β-glucanase, xilanase, celulase e amilase nos coeficientes de digestibilidade aparente de tilápias do Nilo, Oreochromis niloticus. Um total de 90 peixes sadios, machos com 100 dias de idade (150 ± 20 g) foram distribuídos aleatoriamente em seis aquários de digestibilidade de 200 litros, com 15 peixes por aquário. Foi utilizada como dieta basal uma formulação comercial para tilápias contendo 33,27% de proteína bruta (21,11% de origem animal + 12,17% de origem vegetal) e 20,18 MJ/kg de energia bruta. Os tratamentos utilizados foram: dieta controle (D1) sem complexo multienzimático, D2 e D3 suplementadas com 0,0225% e 0,045% de Allzyme SSF®, respectivamente. Óxido de cromo (0,1%) foi utilizado como marcador interno. Foi observado um maior coeficiente de digestibilidade aparente de matéria seca e energia bruta nos peixes alimentados com a dieta D3 comparado com aqueles que receberam a dieta controle (P = 0,05). Peixes alimentados com D3 apresentaram maior coeficiente de digestibilidade aparente de amido, cinza e zinco comparado com aqueles alimentados com a dieta controle e D2 (P < 0,05). Peixes alimentados com as dietas D2 e D3 demonstraram coeficientes de digestibilidade aparente maiores para cálcio e fósforo em relação aos que receberam a dieta controle (P < 0,05). Não foi observado efeito do complexo multienzimático nos coeficientes de digestibilidade aparente de lipídeos (P = 0,811). A suplementação com complexo multienzimático na dieta D3 melhorou os coeficientes de digestibilidade aparente de lisina, (P = 0,022), histidina (P = 0,001) comparado com os peixes alimentados com a dieta controle. Coeficientes de digestibilidade aparente maiores para leucina, treonina, triptofano e valina foram observados em peixes alimentados com dietas D2 e D3, comparado com aqueles que receberam a dieta controle (P = 0,05). Excreção menor de nitrogênio e fósforo foi observada nos peixes alimentados com dietas suplementadas com complexo multienzimático comparado com os que receberam a dieta controle. Como conclusão, a suplementação com 0,045% de Allzyme SSF® pode ser uma ferramenta útil para melhorar os valores nutricionais dos alimentos e dar suporte a uma criação mais sustentável de tilápia do Nilo. / The present study was aimed to evaluate the effects of Allzyme SSF®, a multienzyme complex with pectinase, protease, phytase, β-glucanase, xylanase, cellulase, and amylase, on the apparent digestibility coefficients for Nile tilapia, Oreochromis niloticus. A total of 90 healthy, 100-day-old, all-male fish (150 ± 20 g) were randomly allotted into six-200-L digestibility aquaria at stocking density of 15 fish per aquarium. A typical commercial tilapia feed formulation containing 33.27% of crude protein (21.11% from animal protein source + 12.16% from plant protein source), and 20.18 MJ/kg of gross energy was used as basal diet. The dietary treatments assigned were: control diet (D1) without multienzyme supplementation, D2 and D3 supplemented with 0.0225% and with 0.045% of Allzyme SSF®, respectively. Chromic oxide at 0.1% was used as inert marker. Higher apparent digestibility coefficients of dry matter and gross energy were observed in fish fed diet D3 compared to those fed the control diet (P < 0.05). Fish fed diet D3 showed higher apparent digestibility coefficients of starch, ash and zinc compared to those observed in fish fed control and diet D2 (P < 0.05). Fish fed diet D2 and D3 demonstrated higher apparent digestibility coefficients of calcium and phosphorus than fish fed the control diet (P < 0.05). No effect of multienzyme complex supplementation on apparent digestibility coefficients of lipids was observed (P = 0.811). Dietary multienzyme complex supplementation in diet D3 improved apparent digestibility coefficients of lysine (P = 0.022), histidine (P = 0.001) compared to fish fed D1. Higher apparent digestibility coefficients of leucine, threonine, tryptophan and valine were observed in fish fed diet D2 and D3, compared to those fed the control diet (P < 0.05). Lower nitrogen and phosphorus excretions were observed in fish fed diets supplemented with the multienzyme complex compared to the control diet. In conclusion, a dietary supplementation of 0.045% of Allzyme SSF® may be used as useful tool to improve nutritive value of feeds and support the sustainability of Nile tilapia culture.

Responsáveis pela produção dos gametas masculinos e pela biossíntese de hormônios essenciais à função reprodutiva masculina, os testículos requerem uma ação hormonal orquestrada para regular seu desenvolvimento e metabolismo, a fim de desenvolver testículos adultos férteis. Três hormônios vêm sendo descritos como indispensáveis para a regulação da fisiologia testicular: FSH, insulina e IGF-1. A sinalização hormonal mediada por receptores de membrana é essencial para a regulação de diversas funções celulares. A maneira como cada interação entre ligante e receptor produz o seu próprio padrão específico de regulação da função celular é uma questão fundamental na biologia. A grande maioria das ações hormonais se dá através da ativação de vias de sinalização intracelular, as quais direcionam a fisiologia celular de acordo com as necessidades dos tecidos e órgãos. O presente trabalho tem como objetivo investigar o envolvimento da via da PI3K/PKB nas ações da insulina e do IGF-1 sobre o potencial de membrana e os transportes de cálcio, aminoácidos e glicose em células de Sertoli de ratos imaturos. Buscamos ainda, identificar os efeitos do FSH e do IGF-1 sobre o metabolismo de células de Sertoli humanas cultivadas in vitro, através da análise do consumo e produção de metabólitos, da atividade da lactato desidrogenase (LDH) e da expressão de proteínas relacionadas ao metabolismo dessas células. Os efeitos estimulantes da insulina e do IGF-1 sobre a captação de cálcio e sobre o transporte de aminoácidos e glicose foram completamente inibidos pela ação do wortmannin, bloqueador da PI3K. O que indica que ambos os hormônios se valem dessa via de sinalização para regular o metabolismo das células de Sertoli de ratos imaturos. Em células de Sertoli humanas, o IGF-1 foi capaz de estimular a produção de lactato por essas células através do aumento da atividade da LDH, enquanto o FSH não apresentou qualquer efeito. Concluímos, que a via de sinalização PI3K/PKB é um importante meio de regulação hormonal do metabolismo das células de Sertoli de ratos imaturos utilizado por FSH, insulina e IGF-1, gerando despolarização da membrana pelo influxo de cálcio e consequente aumento no transporte de aminoácidos e glicose. Entretanto, em células de Sertoli humanas adultas, o IGF-1 parece ser um importante regulador do metabolismo celular, embora o FSH, a exemplo do que acontece em testículos de ratos adultos, tem pouco ou nenhum efeito sobre o metabolismo dessas células. Mais estudos são necessários para identificar as vias de sinalização pelas quais o IGF-1 regula o metabolismo das células de Sertoli.

Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei são os agentes etiológicos da doença de Chagas e da doença do sono, respectivamente. Ambos são tripanossomatídeos, apresentam um ciclo de vida que alterna entre os hospedeiros mamíferos e os hospedeiros invertebrados e apresentam o metabolismo baseado no consumo de aminoácidos e/ou glicose, dependendo da disponibilidade de nutrientes no ambiente. Neste trabalho foi demonstrado a importância da glutamina (Gln) em diferentes aspectos da biologia do T. cruzi e a relevância da Gln e da enzima glutamina sintetase (GS) para formas sanguícolas de T. brucei. A Gln é transportada pelo T. cruzi e pelo T. brucei a partir do meio externo. Em T. cruzi foi demonstrado que esse transporte é realizado por um único sistema, saturável, específico, dependente de ATP e do gradiente de H+ na menbrana do parasita. Também foi demonstrado que a Gln é importante para replicação das formas amastigotas e epimastigotas, além de promover o processo de metaciclogênese. Tratamento com análogos estruturais da Gln dimuiu a proliferação do estágio epimastigota e também a diferenciação para tripomastigota metacíclico. Além do mais células infectadas e tratadas com os análogos apresentaram redução do número de tripomastigotas que eclodiram das células, demonstrando que a Gln também é importante para os estágios intracelulares. Em formas sanguícolas de T. brucei, a enzima GS é ativa, mas é incapaz de suprir a necessidade de Gln do parasita, fazendo com que seja completamente dependente do transporte a partir do meio externo. A Gln é importante para a proliferação formas sanguícolas e correta progressão do ciclo celular. Em meio sem Gln os parasitas são incapazes de manter a proliferação normalmente, sendo que este processo é dependente da concentração de Gln no meio externo. Também foi demonstrado que a Gln participa do processo de modificação pós-traducional de glutamilação da tubulina. Conclui-se portanto que a Gln é um aminoácido fundamental para sobrevivência do T. cruzi e do T. brucei. / Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei are the etiologic agent of Chagas disease and sleeping sickness, respectively. Both parasites are trypanosomatids that have a complex life cycle, which alternates between a mammalian host and insect vector. T. cruzi and T. brucei are able to use carbohydrates and amino acids as energy source, depending on availability of nutrients in the different environments that parasites go through in the life cycle. In this work we demonstrate that glutamine (Gln) is an important metabolite that participates in many biological processes in T. cruzi, and the relevance of the enzyme glutamine synthetase and Gln in bloodstream forms of T. brucei. T. cruzi and T. brucei are able to uptake Gln from the medium. T. cruzi incorporate Gln through a single and saturable transport system. Gln uptake system is dependent on ATP intracellular levels and H+ gradient and is a highly specific system. Also was demonstrated that Gln is important to replicative stages amastigote and epimastigote, and promotes the metacyclogenesis process. The treatment with Gln analogs impared the epimastigote replication and the differentiation from epimastigote to trypomastigote metacyclic. Moreover, analogs treatment in the infected cells decrease the number of trypomastigotes released from the cells, suggesting that Gln is important to intracellular development of T. cruzi. This work also demonstrates that the enzyme glutamine synthetase is active in bloodstream forms from T. brucei, but is not enough to produce the amount of Gln required by the parasite. T. brucei, bloodstream forms are completely dependent of Gln uptake from the medium. The proper proliferation rate and correct cell cycle progress are dependent of Gln concentration in the medium. Moreover Gln participates in the tubulin glutamylation process in bloodstream forms; this is a post translational modification that is important to microtubules dynamics and cytokinesis process. We concluded that Gln is a fundamental amino acid to maintenance of T. cruzi and T. brucei.