A semente de milho, base da alimentação em muitos países na África, Ásia e América Latina, possui ~10% de proteína na semente. Por ser um cereal a proteína da semente de milho apresenta uma baixa concentração de aminoácidos essenciais como: lisina e triptofano. Com a descoberta do milho opaco-2, o qual apresenta um maior teor de lisina e triptofano em suas sementes, surgiu a oportunidade de se desenvolver milhos com qualidade protéica, aumentando o conteúdo de aminoácidos e a qualidade nutricional dos grãos. Assim, surgiu o milho QPM (quality protein maize), milho de alta qualidade protéica, melhorado pelo CIMMYT (México). O QPM possui duas vezes mais lisina que o milho normal mantendo a sua produtividade equivalente. A EMBRAPA, Milho e Sorgo, desenvolveu duas variedades QPM comercializadas: BR451 e BR473. A linhagem QPM 161 (EMBRAPA Milho e Sorgo) teve suas proteínas de reserva analisadas bioquimicamente neste trabalho, concluindo que o QPM 161, possui uma concentração maior de lisina em suas sementes, chegando a superar o BR 451 e a manter a mesma concentração de lisina que o BR 473. Em outra parte do trabalho, sementes imaturas (14, 20 e 14 DAP) das linhagens 161, assim como as do selvagem W22+ e de seus mutantes W22o10, W22o11 e W22o13, foram utilizadas para caracterizar a enzima homoserina quinase (HK). A HK faz parte da via de biossíntese do aminoácido essencial treonina. Constatou-se que uma alta atividade desta enzima está relacionada ao aumento de treonina na semente, porém, a alta atividade de HK foi observada nos menores estágios de maturação. Assim os resultados mostram que mais estudos sobre a regulação desta enzima devem ser realizados para que se possam desenvolver sementes ricas em lisina e também em treonina. / Maize which is the staple food in many countries in Africa, Asia and Latin America, has ~10% of protein in the seeds. Maize seeds protein presents low contents of essential amino acids, such as lysine and tryptophan. Since the discovery of the opaque-2 maize, a recessive mutation that results in high concentrations of lysine and tryptophan, the major challenge has been to develop better quality protein maize to increase the rate of amino acids consumed by population. The QPM (quality protein maize), originally produced and breeded at CIMMYT in Mexico, came to solve the issue. The QPM protein has twice as much lysine and tryptophan, with the same yield of normal maize. The EMBRAPA, Maize and Sorghum, has bred two QPM varieties that are already commercialized (BR 451 and BR 473), but to increase the quality of the Brazilian QPM, EMBRAPA developed a new QPM line, the 161, whose storage proteins were biochemically analyzed in this study. Line 161 exhibited a higher lysine concentration than BR 451, but about the same concentration of that exhibited by BR 473. Further analyses conducted in this research involved the study of immature seeds (14, 20 and 24 DAP) of line 161, and the wild-type W22+ and its counterpart mutants W22o10, W22o11 and W22o13, and the characterization of the enzyme homoserine kinase (HK). HK is a key enzyme of the threonine biosynthetic pathway. The high HK activity was shown to be related to the increased threonine concentration in the maize seeds. HK activity was shown to reach the highest level in the first developmental stage, whereas in the last developmental stage the activity is lower and so is the rate of threonine. Therefore, it is necessary more studies on HK regulation to improve the mature maize seeds with the best rate of lysine and threonine.

A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido feitas utilizando o melhoramento genético. Com o advento das técnicas de engenharia genética é possível, atualmente, utilizar a biotecnologia para aprofundar estes estudos, a fim de desvendar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos nos grãos. O presente trabalho tem como objetivo principal testar uma nova estratégia que se baseia na expressão de uma proteína quimérica, a zeolina, sob controle de um promotor endosperma específico. A zeolina é uma combinação de 421 aminoácidos da faseolina do feijão com 89 aminoácidos da y- zeína, inserida no genoma do milho sob controle de um promotor isolado da -kafirina de sorgo. Para que o objetivo do projeto fosse alcançado, o trabalho foi dividido nas seguintes etapas: i) Síntese da construção e clonagem nos vetores; ii) Transformação de embriões e calos de milho utilizando biobalística e Agrobacterium tumefaciens; iii) Cultura de tecidos para seleção e regeneração das plantas transformadas; iv) Verificação dos eventos de transformação através da análise do DNA, RNA e da proteína do transgene; v) Análises preliminares das plantas transformadas para o padrão das proteínas de reserva e perfil de aminoácidos dos grãos. A construção da zeolina foi amplificada por PCR com primers específicos e clonada nos vetores pCambia3301 e pTF102 sob controle do promotor da -kafirina. Os embriões e calos do milho híbrido HiII foram utilizados na transformação empregando-se a biobalística e Agrobacterium tumefaciens. No final do processo foram produzidas e multiplicadas oito plantas de milho transformadas com a zeolina, confirmadas por testes biológicos, PCR, sequenciamento e testes imunocromatográficos, representando seis eventos de transformação. A expressão gênica, verificada pela detecção do mRNA por PCR, foi constatada em seis eventos de transformação. Para detecção da proteína expressa pelo transgene foi utilizado anticorpo específico para faseolina, através do Western Blot. A banda relativa ao transgene foi detectada em três eventos de transformação. Nas análises preliminares não houve alteração no padrão das frações zeína, globulina, glutelina ou albumina nas plantas transformadas quando comparados com os controles. Também não houve diferenças significantes no teor de aminoácidos solúveis totais entre as plantas transformadas e os controles. Na determinação do perfil de aminoácidos no HPLC, o evento ZEO-3(3) apresentou as maiores concentrações para todos os aminoácidos analisados. Neste evento de transformação o teor de lisina foi de 25,76 mg/g de proteína, enquanto os controles apresentaram valores de 9,77 e 15,89mg/g de proteína. O evento ZEO-3(3) apresenta-se, portanto, como um candidato para estudos posteriores a fim de revelar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos e o acúmulo das proteínas de reserva nos grãos de milho. / Lysine is an essential amino acid and a major factor limiting the use of cereals such as maize for food and feed as, without supplementation, does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made using the conventional breeding. With the advent of genetic engineering techniques it is now possible to use biotechnology to develop further studies and to unravel the complex mechanisms that control the flow of amino acids in grains. The present work aimed at testing a new strategy based on the expression of a chimeric protein, the zeolin, under the control of an endosperm specific promoter. The zeolin is a combination of 421 amino acids of bean phaseolin with 89 amino acids of the maize - zein inserted into the maize genome under the control of a promoter isolated from the protein -kafirin from sorghum. For the goal of the project to be reached, the work was divided into the following steps: i) Synthesis of the construction and the cloning vectors; ii) Transformation of embryos and callus of maize using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens methods; iii) Tissue culture for selection and regeneration of transformed plants iv) Verification of transformation events through the analysis of the DNA, RNA and protein from the transgene; v) Preliminary analysis of transformed plants for the storage proteins pattern and amino acid profile of the grains. The zeolin construction was amplified by PCR with specific primers and cloned into the vectors pCambia3301 and pTF102 under the control of the promoter -kafirin. Embryos and callus of HiII hybrid were used in the transformation using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens. At the end of the process of transformatio, eight maize plants transformed with zeolin were produced and multiplied, confirmed by biological tests, PCR, sequencing and immunochromatographic tests, representing six transformation events. The gene expression, verified by detection of mRNA by PCR, was found in six events of transformation. The protein translation, verified by Western Blot using an antibody specific for phaseolin, was found in three transformation events. In the preliminary analysis, the pattern of zein, globulin, glutelin or albumin fractions did not change comparing transformed plants with the controls. There were also no significant differences in the content of soluble amino acids among the Western positive transformed plants and the controls. In the HPLC amino acid profile, the event ZEO-3(3) showed the higher concentrations for all amino acids analyzed. In this transformation event the content of lysine was 25,76mg/g protein, while the controls exhibited values of 9,77 and 15,89mg/g protein. Therefore, ZEO-3(3) event presents itself as a candidate for further studies to reveal the complex mechanisms that control the flow of amino acids and accumulation of storage proteins in maize kernels.

Os cereais representam importantes fontes de proteína para alimentação humana e animal. Entretanto, são caracterizados pela baixa qualidade nutricional de suas proteínas devido à composição desbalanceada de aminoácidos, causada pelo excesso dos aminoácidos prolina e glutamina e deficiência de lisina, treonina e triptofano. As proteínas de reserva prolaminas constituem 50% do conteúdo total de proteínas no endosperma e são as principais responsáveis por tais características nos cereais. As informações sobre o metabolismo de lisina e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma vêm sendo utilizadas para desenvolver e aplicar estratégias em programas de melhoramento de plantas que visam suprir a deficiência de lisina encontrada nos cereais. Lange e colaboradores (2007) relataram a produção de linhagens transgênicas de cevada com padrão de proteínas de reserva alterado e que apresentaram incremento no teor de lisina e outros aminoácidos essenciais. O presente trabalho teve como objetivo identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Para tanto, avaliou-se a atividade das enzimas envolvidas na síntese e degradação de lisina, além da caracterização das proteínas de reserva e sua composição de aminoácidos. Observou-se redução na fração protéica das prolaminas (5,91 a 18,34%) e incrementos compensatórios na fração protéica das glutelinas (2,16 a 6,52%). As demais frações apresentaram respostas variáveis dependendo do evento avaliado. Além disso, a composição de aminoácidos foi alterada nas diferentes frações protéicas. As prolaminas exibiram incrementos nos teores de lisina (1,79 a 49,13%), treonina (5,04 a 22,60%) e metionina (13,57 a 45,38%), enquanto que as globulinas aumentaram principalmente o conteúdo de metionina (32,30 a 142,56%). Para os aminoácidos solúveis, foram observados incrementos na ordem de duas a três vezes de histidina, lisina, fenilalanina e metionina. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações nas três principais enzimas da via do ácido aspártico. A enzima aspartato quinase (AK) apresentou aumentos na atividade (4,44 a 47,27%), entretanto, foi mais sensível a inibição causada por lisina. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) também apresentou incremento na atividade (1,50 a 66,32%), mas diferente da AK, foi menos sensível à inibição causada por lisina. A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), a qual compete o substrato ASA com a enzima DHDPS, exibiu redução na atividade (3,36% a 28,80%) (exceto um evento de transformação) e foi menos sensível a inibição causada por treonina. Embora as enzimas envolvidas na degradação de lisina também foram alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Para aqueles que foram observados redução na atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase (LOR), foi também verificado para enzima sacaropina desidrogenase (SDH), mas na ordem de duas vezes, sendo válido para aqueles que apresentaram incremento. Este trabalho mostrou que a alteração no padrão de proteínas de reserva ocasionou mudanças no metabolismo de aminoácidos, neste caso a lisina, para suprir a demanda necessária para incorporação em proteínas de reserva / Cereals represent an important source of protein to human food and animal feed. However, they are characterized by low nutritional quality of proteins due to the unbalanced composition of amino acids, caused by the excess of the amino acids proline and glutamine and deficiency of lysine, threonine and tryptophan. The prolamin storage proteins constitute 50% of the total protein content in the endosperm and is primarily responsible for these characteristics in cereals. Information on the metabolism of lysine and accumulation of storage proteins in endosperm have been used to develop and implement strategies in plant breeding programs that aim to address the deficiencies found in cereals. Lange and coworkers (2007) reported the production of transgenic lines of barley with a pattern of storage proteins that showed altered and increase in the levels of lysine and other amino acids. This study aimed to identify what were the mechanisms responsible for observed changes. For this, we evaluated the activity of enzymes involved in synthesis and degradation of lysine, besides the characterization of storage proteins and their amino acid composition. There was a reduction in the prolamin protein fraction (5.91 to 18.34%) and compensatory increases in the glutelin fractions (2.16 to 6.52%). The other fractions had variable responses depending on the event evaluated. Moreover, the amino acid composition was changed in the different protein fractions. Prolamins exhibited increases in levels of lysine (1.79 to 49.13%), threonine (5.04 to 22.60%) and methionine (13.57 to 45.38%), whereas increases were mainly globulins content of methionine (32.30 to 142.56%). With respect to soluble amino acids, increases were observed in the order of 2-3 fold of histidine, lysine, phenylalanine and methionine. Analysis of enzymes involved in lysine metabolism showed that changes in three key enzymes of the pathway of aspartic acid. The enzyme aspartate kinase (AK) showed increase in activity (4.44 to 47.27%), however, was more sensitive to inhibition by lysine. The enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) also showed increased activity (from 1.50 to 66.32%), but unlike the AK, was less sensitive to inhibition by lysine. The enzyme homoserine dehydrogenase (HSDH) that competes for the substrate ASA with the DHDPS, exhibited reduced activity (3.36% to 28.80%) (an exception one transgenic line) and was less sensitive to inhibition by threonine. The enzymes involved in degradation of lysine were also changed, though the results varied for different events. Those who observed decreased activity of the enzyme lysine ketoglutarate reductase (LOR) was also found for enzyme saccharopine dehydrogenase (SDH), but the order of twice, which was valid for those who had increased. This study showed that the change in the pattern of storage proteins produced changes in amino acid metabolism, in this case lysine, to supply the demand needed for incorporation into storage proteins.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-26T20:14:18Z No. of bitstreams: 1 mathiaspradopereira.pdf: 3201643 bytes, checksum: 447b3a998af30816092d9c7938c30602 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-13T13:00:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mathiaspradopereira.pdf: 3201643 bytes, checksum: 447b3a998af30816092d9c7938c30602 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-13T13:00:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mathiaspradopereira.pdf: 3201643 bytes, checksum: 447b3a998af30816092d9c7938c30602 (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neste trabalho descrevemos a preparação de líquidos iônicos constituídos de sais de amônio quaternário derivados do glicerol como cátions e de aminoácidos como ânions. Três tipos diferentes de cátions foram preparados, sendo o cátion do tipo um, o 3(trietilamônio)propan-1,2-diol, o cátion do tipo dois, o N-((1,3-dioxolan-4-il)metil)N,N,N-trietilamônio e o cátion do tipo três, o 1,3-bis(trietilamônio)propan-2-ol. Foram preparados dez compostos com características de líquido iônico, sendo cinco deles utilizando o cátion do tipo um e os outros cinco utilizando o cátion do tipo dois. Como ânions foram utilizados carboxilatos dos respectivos aminoácidos: L-Valina, L-Leucina, L-Prolina, L-Tirosina e L-Cisteína. O cátion do tipo três foi preparado, no entanto, seus respectivos líquidos iônicos não. Os líquidos iônicos preparados foram caracterizados pelos métodos usuais de elucidação estrutural (RMN-1H, RMN-13C e IV) e as caracterizações físico-químicas como a determinação da quantidade de água, densidade, condutividade em solução, temperatura de decomposição, temperatura de transição vítrea, ponto de fusão e testes qualitativos de solubilidade também foram realizadas. O líquido iônico [3-(tri-etilamônio)propan-1,2-diol][L-Prolinato] foi utilizado como amino catalisador na reação de adição de Michael entre a cicloexanona e o trans βnitroestireno em acetonitrila. O aduto de Michael foi obtido em 49% de rendimento, na proporção distereoisomérica de 10:1 dos estereoisômeros syn:anti. A enantiosseletividade dos adutos formados aproximou-se de uma mistura racêmica, o que sugere a dissociação do líquido iônico no solvente utilizado. / In this work, we describe the synthesis of ionic liquids composed of quaternary ammonium salts derived from glycerol as a cation and amino acids as anions. Three different types of cations were synthetized: The cation type one the 3-(triethylammonium)propan-1.2-diol, the cation type two N-((1.3-dioxolan-4-yl) methyl)N,N,N-tri-ethylammonium and the cation type three 1,3-bis (tri-ethylammonium)propan2-ol. Ten compounds with characteristics of ionic liquid have been synthetized, five of them using the cation of type one and the others five using cation of type two. As anions have been used carboxylates of the respective amino acids: L-Valine, L-Leucine, LProline, L-tyrosine and L-cysteine. The three type of cation was prepared their respective ionic liquids do not however. The ionic liquids prepared were characterized by unusual structural determination methods (1H-NMR, 13C-NMR and IR) and the physicochemical characterizations like water contends, density, solution conductivity, melting point, glass transition, decomposition temperatures and qualitative solubility have been investigated. The ionic liquid [3-(tri-ethylammonium)propan-1,2-diol] [(S)-2-pyrrolidinecarboxylic acid salt] was used as amino catalyst on the Michael addition reaction between cyclohexanone and the trans β-nitrostyrene in acetonitrile. The Michael adduct was obtained in 49% yield with high stereoselectivity 10:1 ratio syn: anti. The enantioselectivity of the adducts formed approached a racemic mixture, which suggests the dissociation of ionic liquid in the solvent used.

Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_SarahCarolineRibeiro_D.pdf: 2548021 bytes, checksum: 61437f1032c9e4fcc9ee2131a8f6dabe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A soja é uma leguminosa amplamente utilizada para estudos envolvendo a fixação biológica de Nitrogênio (N), seja por sua grande importância econômica, seja por sua elaborada e bem sucedida relação simbiótica com rizóbios do gênero Bradyrhizobium, sendo capaz de obter todo N necessário para seu desenvolvimento através da fixação do N2 atmosférico. Todavia, o metabolismo de N em plantas de soja noduladas é sensível à hipóxia provocada pelo alagamento do sistema radicular. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo, avaliar os efeitos do alagamento sobre o metabolismo de N em nódulos de soja em diferentes períodos de inundação e recuperação após a drenagem. Para isto, plantas de soja noduladas com o B. elkanii foram submetidas aos experimentos de inundação e recuperação, sendo os períodos de inundação/recuperação variáveis de acordo com o experimento. As alterações no metabolismo foram avaliadas através da análise da composição de aminoácidos por HPLC e avaliação da incorporação de 15N2 nos aminoácidos dos nódulos. Também foi avaliada a atividade da nitrogenase e a expressão dos genes nifH e nifD (nitrogenase), e dos genes que codificam as enzimas glutamato descarboxilase (GAD) e asparagina sintetase (AS) em soja. Verificamos que asparagina (ASN) é o aminoácido mais abundante em nódulos de soja (50%), seguido por glutamato (GLU), serina (SER) e ácido gama-aminobutírico (GABA). Com a inundação observou-se principalmente, uma redução acentuada de ASN, e aumento de GABA, após 4 dias (quando ASN reduziu a quase 1%), além de pequenas alterações na composição de outros aminoácidos. Com os tratamentos de recuperação ASN recuperou-se lentamente e quanto maior o período de exposição ao estresse mais lento o período de recuperação. Aparentemente a redução de ASN nos nódulos foi compensada pelo aumento de GABA. A atividade da nitrogenase foi fortemente inibida pela inundação, mas se recuperou totalmente. Quanto à incorporação de 15N2, verificamos que GLN foi o aminoácido marcado em grau mais elevado, seguido respectivamente por GLU, ASP, ALA e SER. A marcação dos aminoácidos ASN e GABA foi baixa, e isso pode ser devido ao grande "pool" destes aminoácidos no nódulo, ou pela entrada destes aminoácidos a partir de uma fonte não-marcada como o floema. Com relação à inundação, observou-se uma redução na incorporação de 15N2 em ASN, e a recuperação também foi lenta, também houve redução na incorporação em outros aminoácidos como ASP e GLN. A hipóxia afetou a expressão dos genes avaliados nos nódulos. Houve uma redução na expressão dos genes AS1 e AS2, o que condiz com a redução nos teores de ASN. O gene que codifica a GAD também foi menos expresso em nódulos submetidos à inundação o que não explica o aumento de GABA no nódulo durante o estresse. A expressão dos genes nifH e nifD também diminuiram com a inundação, mas se recuperam, e condizem com o observado para atividade da nitrogenase. Dessa forma, verificamos que a inundação afeta o metabolismo de N nos nódulos de soja, em diversos aspectos, como a composição de aminoácidos, atividade da nitrogenase e na expressão de genes envolvidos na assimilação do N em aminoácidos nos nódulos / Abstract: Soybean has been widely used in studies of biological nitrogen fixation, not only because of its economic importance, but in view of its highly efficient symbiotic relationship with rhizobia of the genus Bradyrhizobium, which can supply all the N needed for full development of the plant. However, the process is highly sensitive to oxygen deficiency provoked by waterlogging of the root system, resulting in a rapid and strong inhibition of nitrogen fixation since the availability of oxygen for nitrogenase activity is tightly controlled in the nodule and close to limiting under normal conditions. Thus, this study aimed to evaluate the effects of flooding on the N metabolism in nodules of soybean in different periods of flooding and recovery after drainage. For this, soybean plants nodulated with B. elkanii were subjected to flooding and recovery experiments at stages V7/V8 The flooding/recovery duration was where the flooding/recovery periods were variable according to the experiment. Changes in metabolism were evaluated by analyzing the amino acid composition by HPLC and by assessing the amino acid incorporation of 15N2 of the nodules. Nitrogenase activity and expression of nifH and nifD (nitrogenase) genes, and genes encoding GAD and AS in soybean were also evaluated. The most abundant amino acid in soybean nodules was asparagine (ASN) (50%), followed by glutamate (GLU), serine (SER) and gama-aminobutyric acid (GABA). On flooding, there was a marked decrease of ASN, and increased GABA, mainly after 4 days when ASN dropped to near 1%, as well as smaller alterations in the composition of other amino acids. With the recovery treatments, ASN recovered slowly and the longer the period of exposure to the stress the longer the recovery period. It appears that the reduction of the ASN in nodules is compensated by the increase of GABA. The nitrogenase activity was strongly inhibited by flooding, but full recovery was possible. Regarding the incorporation of 15N2, it was found that GLN is the amino acid labelled to the highest degree, followed respectively by GLU, ASP, ALA and SER. The labelling of the amino acids GABA and ASN was low, which may be due either to the large pool of these amino acids in the nodule, or to the entry of these amino acids from a non-labelled source such as the phloem. Flooding resulted in a reduction of the incorporation of 15N2 in ASN, and recovery was also slow. There was also reduction in the incorporation of 15N2 in other amino acids, such as Asp and GLN. Hypoxia affected the expression of all genes evaluated in nodules. There was a reduction in the expression of the AS1 and AS2 genes, which is consistent with the fall in levels of ASN. Recovery of expression was slow and gradual. Expression of the gene encoding the enzyme GAD was also strongly suppressed in nodules under flooding which does not therefore explain the increase of GABA in the nodule during stress. The expression of nifH and nifD genes were also strongly decreased on flooding, but recovered fully, consistent with the observed data for nitrogenase activity. In conclusion, it was found that flooding affects the metabolism of N in soybean nodules, in diverse ways, such as the amino acid composition, nitrogenase activity, and the expression of genes involved in N assimilation of nodule amino acids / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal

Orientador: Fernando Antonio Santos Coelho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T02:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ullah_Hamid_D.pdf: 4284540 bytes, checksum: 3371acfc6c696bf069405b0e69378616 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Esse trabalho de doutorado visou explorar o potencial sintetico da reacao de Morita-Baylis- Hillman (MBH) na preparacao de intermediarios sinteticos, que possam ser utilizados na sintese total de produtos naturais. Na primeira parte deste trabalho, realizamos estudos para a sintese total do alcaloide (})-Plicamina e de outros alcaloides, isolados de plantas da familia das Amaryllidaceae, estruturalmente semelhantes. Desenvolvemos uma nova abordagem sintetica para esse trabalho, que culminou com o estabelecimento de uma nova metodologia para a preparacao de ¿À-hidroxi-¿¿-amino esteres. A ozonolise, oximacao e subsequente reducao do aduto de Morita-Baylis-Hillman sililado, proveniente do bromopiperonal, forneceu um ¿À-hidroxi-¿¿-aminoester, com estereoquimica relativa anti, e elevada diastereosseletividade. Esse foi transformado em um intermediario avancado (¿À-hidroxi-¿¿-aminoester N-alquilado) para a sintese do alcaloide, ja que possui todos os grupos funcionais necessarios para atingir o alvo final. Na segunda parte desse trabalho, avaliamos o escopo da nova metodologia de sintese de ¿À-hidroxi-¿¿-aminoesteres. Essa metodologia, simples e direta, permitiu a preparacao de diferentes ¿À-hidroxi-¿¿-aminoesteres, com elevada diastereosseletividade em 4 etapas e bons rendimento globais. Esse e o primeiro exemplo de sintese ¿À-hidroxi-¿¿-aminoesteres, a partir de adutos de Morita-Baylis- Hillman (MBH) / Abstract: This work of doctorate explored the synthetic potential of Morita-Baylis-Hillman (MBH) reaction in the preparation of synthetic intermediates that could be utilized in the synthesis of natural products. In the first part of this work we performed studies towards the total synthesis of (±)-Plicamin and the other structurally related alkaloids, isolated from the plants of the Amaryllidaceae family. We developed a new synthetic approach, which culminated with the establishment of the new methodology for the preparation of â-hydroxy-á-amino esters. The ozonolysis, oxymation and subsequent reduction of the silylated Morita-Baylis-Hillman adduct, obtained from bromopiperonal, furnished a â-hydroxy-á-aminoester, with a relative stereochemistry anti, in high diastereoselectivity. This was transformed further to an intermediate (N-alkylated â-hydroxy-á-aminoester), which has almost all the necessary functional groups to allow the synthesis of the target alkaloid. In the second part of this work we evaluated the scope of the new methodology of the synthesis of â-hydroxy-á-aminoester. This simple and direct methodology allowed us the preparation of different â-hydroxy-á-aminoesters, with high diastereoselectivities, in four steps with good global yield. Additionally, this work demonstrates a first example the synthesis of â-hydroxy-á-aminoesters from the Morita-Baylis- Hillman (MBH) adducts / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viana_LaisRosa_M.pdf: 2263212 bytes, checksum: 98db6fdccbbe9b7c57c880aa72c62a0f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A gravidez envolve várias etapas de ajustes fisiológicos, sendo que algumas complicações clínicas podem surgir ao longo deste processo. Dentre as complicações durante a gestação, o câncer destaca-se mais pela sua coexistência com essa complexa condição metabólica, do que pela sua incidência. Na mãe portadora de doença neoplásica, pode haver competição nutricional entre feto e tumor, resultando em alterações no crescimento e metabolismo de ambos. A manipulação da dieta e suplementação nutricional podem minimizar os danos causados pelo tumor. A leucina é um aminoácido que participa do processo de síntese protéica tecidual de forma estrutural e também atua diretamente na sinalização celular; considerando organismos portadores de câncer, a leucina age inibindo o processo de proteólise estimulando o processo de proteogênese. O objetivo desse trabalho foi avaliar o crescimento fetal em associação ao desenvolvimento de câncer em camundongas prenhes submetidas à dieta rica em leucina. Os resultados obtidos referem-se a avaliação de fêmeas adultas (60-90 dias) da linhagem NMRI, prenhes, submetidas a suplementação nutricional com leucina portadoras ou não do adenocarcinoma de colon MAC16 e inoculadas ou não com líquido ascítico ativo ou inativado . Foram avaliados, nessas fêmeas, dados morfométricos como peso relativo de coração, fígado, baço, adrenal, músculo e placenta, sendo observado discreta diminuição do peso relativo da carcaça, coração, músculo e placenta nos grupos portadores de tumor e inoculados com líquido ascítico ativo, quando comparados aos seus grupos controles. Essa diminuição, provavelmente foi induzida pelo crescimento tumoral ou por seus fatores presentes no líquido ascítico. Em contrapartida, houve aumento no peso relativo do fígado e baço nos grupos portadores de tumor, inoculados com líquido ascítico ativo bem como inativo. Também foi possível observar que, nos grupos suplementados com leucina, o peso relativo de alguns órgãos como, músculo e placenta, foi superior ao dos grupos que receberam a dieta controle, mostrando possível efeito protetor da leucina contra a espoliação desses tecidos. Foram analisados também dados bioquímicos nos soros materno e fetal, além da composição corpórea fetal. No soro materno observamos que houve diminuição discreta na concentração de albumina e glicose nos grupos portadores de tumor. Houve aumento da reabsorção de fetos por fêmea nos grupos portadores de tumor e inoculados com líquido ascítico, e ainda nesses mesmos grupos houve modulação desse efeito quando houve suplementação nutricional com leucina. No soro fetal, houve diminuição na concentração de proteínas totais, albumina e glicose, alem do aumento dos aminoácidos gliconeogênicos, como alanina e glutamina, nos grupos implantados com o tumor submetidos a dieta controle. Em contrapartida, os grupos com leucina mostraram discreto efeito protetor da suplementação com esse aminoácido. Concluímos, que os efeitos do crescimento tumoral são para alguns parâmetros mimetizados com a inoculação de líquido ascítico, porém podem ser modulados, na maioria dos parâmetros, com a suplementação nutricional de leucina. A suplementação nutricional com a leucina promoveu efeito benéfico, contribuindo para a manutenção e modulação dos efeitos deletérios causados pela presença da neoplasia, como manutenção da glicemia e proteína totais séricas, além de diminuir reabsorções fetais e também contribuiu para melhorar a atividade placentária nas mães, independente da inoculação ou não do líquido ascítico / Abstract: Pregnancy is a complex process involving several physiological steps and some clinical complications can alter the homeostasis adjustments during this process. Among the complications during pregnancy, cancer is very important for its coexistence than the incidence with this complex metabolic condition. In tumour-bearing mother, there is possible nutritional competition between foetal and tumour, resulting impaired growth and metabolic changes in both mother and foetus. The nutritional supplementation can minimize the damage caused by the tumour. Leucine acts as a cell signalling improving protein synthesis process and tissue structure. Considering cancer patients, leucine inhibits the process of proteolysis. The aim of this study was to evaluate foetal growth in association with cancer development in pregnant mice subjected to leucine-rich diet. We evaluated NMRI pregnant mice (60-90 days-old) feeding control or leucine-rich diet, bearing or not MAC16 colon adenocarcinoma and inoculated or not with active- or inactivated-ascitic fluid. Morphometric data showed decrease in the relative weight of carcass, heart, muscle and placenta in tumour-bearing groups and active-ascitic fluid injected groups. These results may be induced by tumour growth or its factors presented in ascitic fluid. In contrast, we observed increase in relative liver and spleen in tumour-bearing and both active or inactivated ascitic-fluid-inoculated groups. In groups supplemented with leucine, the muscle and placenta relative weight increased in comparison to control diet group, suggesting a possible protective effect of leucine against these tissues wasting. Biochemical data were also analyzed in maternal and foetal serum, and foetal body composition. Maternal serum showed slight decrease in serum albumin and glucose in tumour-bearing groups and also increase in gluconeogenic amino acids, such as glutamine and alanine. The foetuses resorption per female increased in all tumour-bearing groups and ascitic-fluid-inoculated dams. The foetal body water was increased in tumour-bearing animals, and also enhanced the serum pro-inflammatory cytokines and glucagon. We conclude that some effects produced by tumour growth can be similar by the ascitic fluid injection, and can be partially modulated by leucine-rich diet. Nutritional supplementation with leucine promoted beneficial effect, contributing to the maintenance and modulation of the deleterious effects caused by the presence of cancer. These effects can be related to maintenance of blood glucose and serum total protein, and reduction of fetal resorption and also improved the signalling proteins activity in placenta tissue, independent of the inoculation of the ascitic fluid / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Apesar da rápida expansão das aplicações da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em química clínica, a análise de metabólitos de baixo peso molecular e alta polaridade em matrizes biológicas ainda permanece como um grande desafio analítico. Dentre os compostos de grande importância no diagnóstico de doenças metabólicas que ainda carecem de melhores alternativas bioanalíticas destacam-se os aminoácidos. O presente estudo descreve o desenvolvimento e a validação de um novo método para a quantificação de 24 aminoácidos em plasma explorando a cromatografia líquida acoplada a espectrômetros de massas em tandem. Foi construído um método de detecção baseado em SRM (múltiplas reações selecionadas) com duas transições de massas para cada um dos 24 aminoácidos e os 19 padrões internos marcados com isótopos estáveis. Foram avaliadas três estratégias de separação cromatográfica e o melhor desempenho foi obtido com fase reversa com octadecilsilano (C18) com pareamento iônico com o ácido perfluoropentanoico. O método cromatográfico final permitiu a separação dos 24 aminoácidos, com resolução completa dos isômeros: leucina, isoleucina e allo-isoleucina, em 11 minutos incluindo o tempo de re-estabilização da coluna cromatográfica. Os limites de quantificação variaram em 113 fmol a 6 pmol injetados na coluna cromatográfica. A imprecisão obtida nos níveis testados para todos os aminoácidos foi inferior a 14%. O método apresentou linearidade para os intervalos testados chegando a 1,5 mmol.L-1 para vários compostos. Os ensaios de arraste mostraram que os limites máximos obtidos na linearidade não geram nenhuma interferência subsequente. A exatidão do método foi avaliada com amostras provenientes do programa de referência interlaboratorial European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) e com o material de referência certificado do National Institute of Standards and Technology (NIST). Todos os analitos mostraram equivalência estatística com o método desenvolvido. / Despite the widespread use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry applications in clinical chemistry, the analysis of low molecular weight and high polar metabolites in biological matrices remains as a major analytical challenge. Notwithstanding the key role played by amino acids in the diagnosis of metabolic diseases, there is still need for improvements in bioanalytical process of these analytes. The present study describes the development and validation of a new method for quantification of 24 amino acids in plasma based on liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Detection and quantification were achieved building a selected reaction monitoring method two mass transitions for each 24 amino acids and 19 stable isotope internal standards. Three chromatographic strategies for separation were evaluated, and best performance was achieved using reversed-phase octadecylsilane with perfluropentanoic acid as ion pairing agent. The separation method allowed separation of 24 amino acids with full resolution for isomers leucine, isoleucine and alloisoleucine in 11 minutes, including column equilibration time. The limits of quantification ranged from 113 fmol to 6 pmol (on column injection). Imprecisions for all evaluated levels and amino acids were less than 14%. The method is linear in all clinical intervals and extending up to 1.5 mmol.L-1. Carryover evaluation demonstrated absence of interference in the following injection throughout the analytical interval. Method accuracy was evaluated analyzing reference samples from European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) and National Institute of Standards and Technology (NIST). Statistical equivalence was demonstrated for all analytes using the present method.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:15:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9198_1.pdf: 1867776 bytes, checksum: dc46604e584110b96021a3b3099da17b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O uso de complexos de lantanídeos quirais como novos catalisadores em síntese assimétrica tem sido extensivamente estudado na última década. Neste contexto, a busca por novos ligantes quirais e novos compostos de lantanídeos tem despertado grande interesse. Neste trabalho, ligantes quirais contendo grupamento sulfóxidos e aminoácidos N-protegidos foram sintetizados e aplicados juntamente com íons lantanídeos em catálise assimétrica. Os melhores resultados foram obtidos com complexos ditiocarbamatos de lantanídeos e ligantes aminoácidos N-protegidos para reações de adições assimétricas de cianeto a aldeídos e de hidreto a cetonas pró-quirais. Os álcoois e as cianidrinas formados apresentaram elevados rendimentos e excessos enantioméricos. A formação do catalisador quiral in situ foi evidenciada pela mudança de coloração da mistura reacional de laranja para incolor e uma forte luminescência vermelha, característica do íon Eu+3 quando exposto à radiação ultravioleta. Este catalisador quiral foi caracterizado em solução através de dois experimentos: métodos de diluição estequiométrica e variação contínua (método de Job), obtendo-se um complexo com uma razão estequiométrica de 3:1 de N-p-tosila-L-fenialanina(21b): 1,10-fenantrolina dietilditiocarbamato de európio [Eu(Et2NCS2)3fen)]. Os complexos ditiocarbamatos de lantanídeos ainda foram aplicados como ácidos de Lewis na reação de adição simétrica de cianeto a vários aldeídos, sendo o complexo dietilditiocarbamato de Itérbio [Yb(Et2NCS2)3fen)] o que proporcionou os melhores resultados. Usando quantidade catalítica do complexo, foi possível obter cianidrinas em bons rendimentos com elevada velocidade de reação. A adição de cianeto a benzaldeído foi acompanhada por espectroscopia de emissão, onde foi possível detectar a formação dos intermediários envolvidos na reação catalítica e estabelecer o estudo cinético da reação

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this thesis was to analyze the responses of pigs when subjected to a nutritional program established for each individual in real time based on the concepts proposed by the system POMAR et al., (2009) and HAUSCHILD et al., (2012). This study was divided into two experimental phases. In the first phase performance data and production costs between two nutritional programs were evaluated, during 28 days. The experimental design was completely randomized with two treatments (Individual and Daily Nutrition Program - PID and by Program Group by Phases - PGP) and 10 replications, with the animal as the experimental unit. In the second experimental stage, an assay was performed to assess the balance of nitrogen (N) for the two nutritional programs. The experimental design was completely randomized with two treatments PID and PGP, six replicates, and the animal as the experimental unit. The animals were housed in metabolic cages for a period of seven days for adaptation and five days for total collection of feces and urine. There was no difference (P > 0.05) between nutritional programs for feed intake daily (ID), body weight (BW), average daily gain (ADG), feed conversion (FC) and feed efficiency (FE). Due to the adjustment of the diet requirements of animals at the levels provided in PID: Crude Protein (CP), Lysine (Lys), Methionine (Met), Threonine (Thr) and Phosphorus (Pho), were respectively 14.50%, 12.23%, 28.26%, 12.98% and 14.29% lower on average compared to the values provided by the PGP. The production cost per kilogram for the period was: PID R$ 2.01 and PGP R$ 2.19. The gross profit margin for nutritional programs PID and PGP were R$ 0.99 and R$ 0.81, respectively. Nitrogen retention did not differ (P > 0.05) between the feeding programs, with average values of 27.86 g/day for the PGP and 27.31 g/day for the PID. The animals showed an average nitrogen intake of 48 g/day PID and 56 g/day PGP. The average nitrogen excretion increased from 26.89 g/day in the PGP to 19.71 g/day in the PID. It is concluded that reducing the supply of nutrients due to the adjustment of supply to the animal does not affect pig performance and further reduces the cost of production, increasing gross margin profitability. The model is able to reduce the levels of N excreted by pigs. / O objetivo desta dissertação foi analisar as respostas de suínos quando submetidos a um programa nutricional estabelecido para cada individuo em tempo real com base nos conceitos do sistema proposto por POMAR et al., (2009) e no modelo de HAUSCHILD et al., (2012). Este estudo foi dividido em duas fases experimentais. Na primeira fase foram avaliados dados de desempenho e custos de produção entre dois programas nutricionais. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com dois tratamentos (Programa Nutricional Individual e Diário - PID e Programa em Grupo por Fases - PGF) e 10 repetições, sendo o animal a unidade experimental. Período experimental de 28 dias. Na segunda fase experimental foi realizado um ensaio metabólico para avaliar o balanço de Nitrogênio (N) para os dois programas nutricionais. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com dois tratamentos PID e PGF, seis repetições, sendo o animal a unidade experimental. Os animais foram alojados em gaiolas metabólicas por um período de sete dias para adaptação e cinco dias para coletas totais de fezes e urina. Não houve diferença (P > 0,05) entre os programas nutricionais para consumo médio diário (CMD), peso vivo (PV), ganho médio diário (GMD), conversão alimentar (CA) e eficiência alimentar (EF). Devido ao ajuste da dieta às exigências dos animais no PID os níveis fornecidos de: Proteína Bruta (PB), Lisina (Lis), Metionina (Met), Treonina (Tre) e Fósforo (Fós), foram respectivamente 14,50%, 12,23%, 28,26%, 12,98% e 14,29% menores na média em relação aos valores fornecidos pelo PGF. O custo de produção por quilograma para o período foi: PID R$ 2,01 e PGF R$ 2,19. A margem bruta de lucro para os programas nutricionais PID e PGF foram de R$ 0,99 e R$ 0,81, respectivamente. A retenção de nitrogênio não diferiu (P > 0,05) entre os programas de alimentação, com valores médios de 27,86 g/dia para o PGF e 27,31 g/dia para o PID. Os animais apresentaram um consumo médio de nitrogênio de 48 g/dia PID e 56 g/dia PGF. A excreção média de nitrogênio passou de 26,89 g/dia no PGF para 19,71 g/dia no PID. Conclui-se que a redução no fornecimento de nutrientes devido ao ajuste da oferta às exigências do animal não afeta o desempenho dos suínos e ainda reduz o custo de produção, aumentando a margem bruta de lucratividade. O modelo consegue reduzir os níveis de N excretados pelos suínos.