Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

A radiação ultravioleta (RUV) causa efeitos deletérios em ecossistemas aquáticos e terrestres. Um dos mecanismos de defesa criados pelos organismos para evitar estes danos é o acúmulo de compostos que absorvem RUV, dentre os quais os aminoácidos tipo micosporina (MAAs, do inglês mycosporine-like amino acids) representam uma classe importante. As MAAs são substâncias solúveis em água caracterizadas pela presença de uma unidade ciclo-hexenona ou ciclo-hexenimina conjugada com nitrogênio substituído por um aminoácido, aminoálcool ou grupo amino, apresentando absorção máxima entre 308 e 362 nm e altos coeficientes de absortividade molar. Dado o importante papel desempenhado pelas MAAs na fisiologia e bioquímica celular de algas, seja atuando como protetoras de RUV ou como antioxidantes, o objetivo desta tese foi expandir o corpo de conhecimentos disponíveis sobre a ocorrência e distribuição destes compostos em macroalgas brasileiras. Para atingir tal meta, foi necessário desenvolver procedimentos analíticos de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (high procedure liquid chromatography, HPLC), de modo a gerar padrões que pudessem ser utilizados para a qualificação e quantificação de MAAs em extratos de algas. Foi necessário também desenvolver dois novos métodos de análise por HPLC acoplada a espectrometria de massas (HPLC-MS) - sendo um utilizado como método diagnóstico, capaz de indicar se há MAAs presentes em determinada amostra, e outro utilizado como método para quantificação. Todos os métodos trouxeram bons resultados, e os métodos por HPLC-MS foram utilizados para o estudo de diversas macroalgas coletadas na região intertidal de praias do litoral Sul do estado do Espírito Santo - Brasil. Apesar da localização restrita, é o maior estudo desta natureza realizado até então com algas do litoral brasileiro. Além disso, 11 dos 32 gêneros e 34 das 45 espécies presentes nesta tese nunca haviam sido alvo de nenhum estudo relacionado a MAAs. Nessas amostras, foi possível encontrar oito MAAs: chinorina, palitina, porphyra-334, asterina-330, palitinol, micosporina-2-glicina, o par cis/trans usujireno/paliteno e uma molécula desconhecida com relação massa-carga de 317 m/z ([M+H]+). Dentre elas, as três primeiras foram quantificadas de forma absoluta, e pôde-se perceber que as rodófitas apresentam níveis de MAAs sensivelmente maiores que as clorófitas e feófitas. Em relação à variedade, foi possível notar que, dentre as amostras que possuem dados do conteúdo de MAAs na literatura (seja para a espécie ou para o gênero), praticamente todas apresentam maior variedade de MAAs do que o anteriormente descrito. Foi encontrada a maior variedade de MAAs já descrita para uma alga parda: seis MAAs diferentes nas espécies Dictyopteris delicatula e Padina gymnospora coletadas na praia de Castelhanos - ES. Pôde-se detectar, pela primeira vez, a presença de MAAs em 32 espécies de macroalgas. Algumas espécies mostram-se fontes muito interessantes de MAAs para diferentes usos pela indústria, seja para a obtenção de compostos puros ou para a utilização de seus extratos como ingredientes de formulações de filtros solares. A molécula desconhecida, cujo íon quasimolecular [M+H]+ apresenta m/z 317, foi tentativamente identificada como sendo a micosporina-glicina-alanina. Este é o primeiro trabalho a descrever a ocorrência desta molécula in natura. / Ultraviolet radiation (UVR) exerts deleterious effects on aquatic and terrestrial ecosystems. One defense mechanism created by organisms to avoid this damage is the accumulation of UV-absorbing compounds, among which the mycosporine-like amino acids (MAAs) represent an important class. MAAs are water-soluble compounds characterized by the presence of a cyclohexenone or cyclohexenimine ring conjugated with amino acids, amino alcohols or other amino groups, presenting absorption maxima ranging from 309 nm to 362 nm and high molar extinction coefficients. Given their important role in algae physiology and cellular biochemistry, as photoprotective compounds or antioxidants, the objective of this thesis is to expand the available knowledge on the occurrence and distribution of MAAs in Brazilian macroalgae. To achieve this goal, it was necessary to develop an isolation methodology by high procedure liquid chromatography (HPLC), so as to generate standards for qualifying and quantifying MAAs in macroalgae extracts. It was also necessary to develop two new analysis methods by HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS) - one utilized as a diagnosis method, capable of indicating if there are MAAs in a given sample; and the other utilized as quantification method. All methods gave good results, and the ones relying on HPLC-MS were used to study several macroalgae collected at the intertidal region of beaches located in the south coast of Espírito Santo State - Brazil. This is the biggest study of this nature ever done with Brazilian macroalgae; besides that, 11 out of 32 genera and 34 out of 45 species herein tested had never had their content of MAA assessed. In these samples, it was possible to find eight MAAs: shinorine, palythine, porphyra- 334, asterina-330, palythinol, mycosporine-2-glycine, the cis/trans pair usujirene/palythene and an unknown molecule with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+). Among them, absolute quantification was performed for the first three ones, and it was possible to notice that red algae have higher MAA levels than green and brown algae. In terms of variety, it could be seen that, amongst the samples that have MAA data available in the literature (either for the species or for the genus), nearly all present a higher MAA variety than the previously described one. The highest variety ever recorded from brown algae is presented in this work: six different MAAs in Dictyopteris delicatula and Padina gymnospora, both collected at Castelhanos Beach - ES. For the first time, it was possible to detect MAAs in 32 species of macroalgae. Some species seem to be very interesting sources of MAAs for industrial purposes, either for obtaining pure compounds or for utilizing their extracts as ingredients of sunscreen formulas. The unknown molecule, with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+), was tentatively identified as mycosporine-glycine-alanine. This is the first work to describe the occurrence of this molecule in natura.

Um metabólito do aminoácido leucina, o HMB, vem sendo utilizado por promover aumento da síntese e/ou redução da degradação protéica. O objetivo do presente estudo avaliou os mecanismos moleculares envolvidos no efeito do HMB sobre o metabolismo proteico na musculatura esquelética frente a um modelo de proteólise, bem como suas consequências funcionais. Ratos Wistar (~250 g) foram tratados com HMB (320 mg/Kg de peso corporal), ou salina (controle), por gavagem, durante 28 dias. Após esse período, uma parcela de ambos os grupos sofreu jejum de 24 horas. Após os tratamentos, parte dos animais foi submetida a ensaios funcionais in vivo. A outra parcela foi sacrificada, os músculos gastrocnêmio (GASTRO) removidos e pesados; sóleo (SOL) e extensor digital longo (EDL), bem como parte do fígado, retirados para avaliação da expressão gênica (real-time PCR) e protéica (Western Blotting) de diversas proteínas envolvidas na síntese e degradação protéica na musculatura esquelética (IGF-I/Akt/mTOR/4E-BP1 e Ub-ligases). Não detectamos alterações na expressão dos atrogenes em ambos os músculos (SOL/EDL) com o tratamento; no entanto observamos um indicativo de atenuação dos animais jejuados com o tratamento no jejum no EDL. Com relação à fosforilação da Akt não houve alteração da mesma com o jejum e nem com o tratamento com HMB no músculo SOL. Já no EDL, encontramos elevação da pAkt no grupo jejuado tratado comparado ao jejuado controle. Contudo, surpreendentemente não detectamos alteração nas demais vias de síntese. Os dados funcionais revelaram apenas uma melhora no tempo de sustentação de isometria e na taxa de resistência à fadiga no EDL dos animais jejuados tratados, sem qualquer alteração na AST. Esta, no entanto, apresentou-se reduzida no SOL. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento crônico com HMB não resultou em alterações nas vias de síntese e degradação protéica nos animais submetidos ao jejum. Contudo, eles apontam respostas músculo-específicas direcionadas ao EDL, com aumento da atividade da Akt e uma melhora funcional, sugerindo que o HMB atue protegendo esse músculo do efeito deletério do jejum, sem adicional ganho de massa muscular. / The HMB, a leucine metabolite, has been used for provide muscle mass gain by increasing protein synthesis and / or diminishing its degradations. The aims of this study is to explore the molecular mechanisms involved of the HMB effects over the protein metabolic on skeletal muscle compared to a proteolysis model, as well as their further functional consequences on muscle. Wistar rats (250 g) were treated with HMB (320 mg/kg body weight/mL of saline-0, 9%), or only saline (control) daily by gavage for 28 days along. After it, a group of animals were subjected to 24-hour fast. After the specified treatments, another portion of these animals were submitted to performances test in vivo. Another portion of animals were sacrificed, and their gastrocnemius (GASTRO) removed and weighed; furthermore, the soleus (SOL), extensor digitorum longus (EDL) and a piece of the liver were removed for evaluation of several genes expression (real-time PCR) and their proteins expression (Western Blotting). Those proteins were involved on protein synthesis and degradation of skeletal muscle (IGF-I/Akt/mTOR/4E-BP1 and Ub ligases). After treatment, no changes were detected on the atrogenes expression in both muscles (SOL / EDL); however it can be observed an indicative attenuation of fasted control animals compared HMB treatment fasted on EDL. In relation of Akt phosphorylation, on soleus muscle, it was not altered by fasting, neither by HMB treatment. We found the pAkt elevated on the EDLs muscle of the HMB group fasted compared to the control fasted. However, surprisingly we detected no changes in the other synthesis pathway, as well on IGF-I expressions and its proteins content. Functional data revealed an improvement on sustained time of the isometric force and the fatigue resistance rate on EDL of animals fasted and HMB treated, without any change on cross-sectional area (CSA). On the other hand, it appeared to be reduced in SOL. Those data suggesting that chronic HMB treatment have no change in the synthesis pathways and protein degradations in animals subjected to fasting. Nevertheless, they indicated responses of muscle-specific, mainly the EDL, in which was observed an increase of Akt activity, followed by a functional improvement, suggesting that this metabolite acts as a muscle protector of the deleterious fasting effects, without any additional muscle mass gain.

Rotas sintéticas foram empregadas no grupo funcional ligado ao carbono 4 da trans-hidroxi-L-prolina para a obtenção de quatro análogos de prolina com amino e guanido grupos nesta posição e isomeria espacial cis e trans. Adicionalmente, o aminoácido guanidino fenilalanina foi comparado com os análogos de prolina em todos os ensaios realizados. Entre os análogos de prolina sintetizados, o peptídeo contendo o aminoácido não natural com o grupo funcional guanido e isomeria trans apresentou a melhor atividade inibitória contra trombina. Entretanto, o peptídeo sintetizado com o aminoácido guanidino fenilalanina ainda demonstra ter uma melhor atividade inibitória em comparação com os análogos de prolina. / Synthetic routes were employed in the functional group attached to the carbon 4 of trans-4-hydroxy-L-proline to obtain four proline analogues with amino and guanido groups in this position and cis and trans spatial isomerism. Additionally, the amino acid guanidino phenylalanine was compared with the analogues of proline in all tests. Among the proline analogues synthesized, the peptide containing the unnatural amino acid functional group with guanido and trans isomerism showed the best inhibitory activity against thrombin. However, the peptide synthesized with the amino acid guanidino phenylalanine exhibits an even better inhibitory activity in comparison to proline analogues.

O refluxo vésico-ureteral (RVU) é uma das condições urológicas comumente diagnosticada entre crianças. Altos graus dessa condição podem causar cicatrização renal, insuficiência renal e hipertensão arterial. A uretrocistografia miccional é o método mais comumente utilizado para o diagnóstico, no entanto, esse procedimento envolve sedação, cateterismo vesical e expõe a criança a uma quantidade significativa de radiação. A investigação metabolômica pode fornecer novos entendimentos sobre a doença e visa a descoberta de metabólitos específicos associados a ela. Assim, existe um potencial considerável para a implementação de perfil metabólico em análises clínicas. Dessa forma, buscou-se estabelecer uma alternativa não invasiva para identificar crianças com o RVU através da metabolômica. Para a investigação metabolômica alvo um método por eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas (CE-MS) com analisador to tipo ion trap foi desenvolvido e validado para a determinação de 27 aminoácidos em urina. Os parâmetros experimentais relacionados às configurações da interface CE-MS, eletrólito (BGE) e espectrômetro de de massas (MS) foram otimizados, proporcionando uma boa separação dos 27 aminoácidos, incluindo os isômeros L-leucina, L-isoleucina e L-alloisoleucina, em menos de 30 min. O líquido auxiliar (SHL) foi composto de 0,5% (v/v) ácido fórmico em 60% (v/v) água/metanol à uma vazão de 5 µL min-1. O BGE consistiu de 0,80 mol L-1 de ácido fórmico e 15% (v/v) de metanol. Um procedimento de stacking por pH foi implementado para aumentar a detectabilidade (uma solução de NH4OH a 12,5% (v/v) foi injetada a 0,5 psi/9 s antes das amostras). O método foi validado de acordo com os protocolos FDA e ICH, exibindo parâmetros aceitáveis. A quantificação bem sucedida dos aminoácidos em amostras de urina de um estudo piloto do RVU foi alcançada. A avaliação estatística dos resultados mostrou que alguns dos aminoácidos avaliados podem carregar informações que possibilitam discriminar as amostras de urina entre os grupos teste e controle. Para a análise metabolômica global urinária, métodos por RPLC-MS e HILIC-MS foram otimizados. Cinco colunas com diferentes propriedades foram investigadas para RPLC e quatro colunas para HILIC; adicionalmente, foram investigados a influência dos aditivos e pH da fase móvel. As condições ótimas foram determinadas avaliando o formato de pico, a relação sinal-ruído, o tempo de retenção, o número de molecular features detectados e sua distribuição durante o gradiente de eluição. A melhor condição obtida para RPLC utiliza a coluna CSH C18 e fase móvel composta por 0,1% (v/v) ácido fórmico em água (A) e 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila (B). Para HILIC, o melhor desempenho foi obtido com a coluna zwitteriônica ZIC-HILIC e fase móvel composta por 10 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (B) e 95% (v/v) acetonitrila e 5% 200 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (A). As amostras de urina dos grupos controle e teste foram submetidas à análise metabolômica global por RPLC-MS usando o método otimizado e por CESI-MS. Os resultados indicaram que diversas rotas metabólicas podem ter sido alteradas pelo RVU. Alteração dos níveis de carnitinas e acilcarnitinas, aminoácidos e derivados, purinas e outros foi observada. Ainda, a presença de acilcarnitinas na urina podem indicar danos mitocondriais e a diminuição de triptofano e aumento do ácido quinurênico indicam uma alteração no metabolismo do triptofano. / Vesicoureteral reflux (VUR) is one of the most commonly urologic conditions diagnosed among children. A high degree of this condition can cause kidney scarring, kidney failure and high blood pressure. Voiding cystourethrography is the standard method for diagnosis; however, this procedure involves sedation, bladder catheterization and exposes the child to a significant amount of radiation. Metabolomics has provided new insights about the disease and aims to discover specific metabolites associated with it. Thus, there is a considerable potential for the implementation of metabolic profile in clinical analyses. Thus, we attempted to establish a noninvasive alternative to identify children with VUR through metabolomics approach. For target metabolomics, a CE-MS method was developed and validated for the separation and quantitative analysis of 27 amino acids in urine. Experimental parameters related to the CE-MS interface (based on co-axial sheath liquid, SHL), background electrolyte (BGE) and mass spectrometer (MS) settings were optimized providing a good separation of 27 amino acids, including the isomers L-leucine, L-isoleucine and L-alloisoleucine, in less than 30 min. The SHL was composed of 0.50% (v/v) formic acid in 60% (v/v) methanol-water delivered at a flow rate of 5 µL min-1. The BGE consisted of 0.80 mol L-1 formic acid and 15% (v/v) methanol. A pH stacking procedure was implemented to enhance sensitivity (a 12.5% (v/v) NH4OH solution was injected at 0.5 psi/9 s prior to samples). The proposed method was thoroughly validated according to FDA and ICH protocols exhibiting acceptable parameters. A successful quantification of amino acids in urine samples from the VUR cohort was achieved. The statistical evaluation of the results showed that some of the amino acids may carry information for the discrimination of the urine samples between the test and control groups. For untargeted metabolomics analysis, methods by RPLC-MS and HILIC-MS were optimized. Five columns with different properties were investigated for RPLC and four columns for HILIC; additionally, the influence of additives and pH of the mobile phase were investigated. The optimum conditions were determined assessing the peak shape, signal-to-noise ratio, retention time, number of molecular features detected and their distribution during the elution gradient. The best condition obtained for RPLC uses CSH C18 column and mobile phase composed by 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile (B). For HILIC, the best performance was obtained with the zwitterionic ZIC-HILIC column and mobile phase composed by 10 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (B) and 95% (v/v) acetonitrile and 5% (v/v) 200 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (A). Urine samples from the control and test groups were submitted to global metabolomics analysis by RPLC-MS using the optimized method and by CESI-MS. The results indicated that several metabolic pathways may have been altered by VUR. Changes of carnitine and acylcarnitine levels, amino acids and derivatives, purines and others was observed. Furthermore, the presence of acylcarnitines in the urine may indicate mitochondrial damage and the decrease of tryptophan and increase of the kynurenic acid indicate a change in the metabolism of tryptophan.

Os elevados custos atribuídos à nutrição na piscicultura ligam a eficiência alimentar ao sucesso da atividade e à redução do impacto ao meio ambiente. Estudos sobre a nutrição e determinação de exigências nutricionais em aminoácidos são, portanto, ferramentas importantes para a consolidação da piscicultura comercial racional e com viabilidade econômica. A determinação da exigência em lisina para o "black bass" Micropterus salmoides foi feita em ensaio de dose-resposta e os dados coletados foram analisados por meio de três modelos estatísticos: regressão polinomial, regressão segmentada e modelagem matemática específica, para estimar a utilização e exigência dos aminoácidos. Foi utilizada a relação A/E = [(aminoácido essencial ÷ total de aminoácidos essenciais + cistina + tirosina) x 1.000], para estimar as exigências nutricionais dos demais aminoácidos essenciais em relação à lisina determinada no experimento dose-resposta. As unidades experimentais foram constituídas por lotes de 25 alevinos de black bass (1,29 ± 0,03 g; 4,35 ± 0,17 cm) condicionados a aceitar ração seca, alojados em gaiolas de PVC atóxico (abertura de malha 5 mm) com capacidade de 60 L e instaladas em caixas de polipropileno com capacidade de 1.000 L, com troca parcial de água num sistema fechado de recirculação e aeração. Os tratamentos correspondiam aos níveis crescentes de lisina: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 e 3,5% na dieta n=4), num delineamento inteiramente aleatorizado (DIA). O modelo estatístico da regressão segmentada foi o modelo mais apropriado para determinação da exigência dietética de lisina para os alevinos de black bass em experimento dose-resposta. A exigência dietética em lisina para peso final, ganho de peso e taxa de crescimento específico foi de 2,1% da dieta ou 4,9% da proteína dietética. A exigência dietética de 1,69% de lisina na dieta ou 3,9% de lisina na proteína condicionou o melhor índice de conversão alimentar. O uso do perfil de aminoácidos corporais do black bass foi adequado como referência para estimar as exigências nutricionais de aminoácidos. / Adequate nutrition of fish stocks interconnects fish feeding efficiency, profitability and mitigation of environmental impact of fish farming. Knowledge on amino acids requirement of farmed fish boosts rationalization and profitability of fish farming systems. This study compares estimation of amino acids requirements of largemouth bass Micropterus salmoides from data of lysine dose-response trials, analyzed through different statistical models: polynomial regression, broken-line analysis and specific mathematical modeling. Amino acids requirements were estimated through the A/E relationship [A/E = (essential amino acid ÷ total essential amino acids + cystine + tyrosine) x 1.000]. Groups of 25, feed-conditioned largemouth bass fingerlings (1.29 ± 0.03 g; 4.35 ± 0.17 cm), were stocked in 60-L cages (5 mm mesh) placed in 1,000-L plastic, indoor tanks, closed circulation system, and fed diets containing 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, or 3.5% lysine, in a totally randomized experimental design trial (n = 4). The broken-line analysis method yielded more reliable and precise estimations of lysine requirements - 2.1% of diet or 4.9% dietetic protein - for final weight, weight gain and specific growth rate. Best feed conversion ratio was attained with 1.69% lysine in the diet or 4.9% lysine in dietetic protein. Body amino acids profile was an adequate reference for estimation of largemouth bass amino acids requirements.

Trypanosoma cruzi é dependente de prolina para diversos processos tal como metabolismo energético, invasão celular, diferenciação e resistência a estresse osmótico, metabólico e oxidativo. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C), um análogo estrutural da prolina, inibe competitivamente o transporte deste aminoácido em T. cruzi, e interage sinergicamente com fatores de estresse que ocorrem ao longo do seu ciclo de vida. Aqui nós avaliamos o efeito de T4C na infecção de camundongos pelo T. cruzi. Foi observada uma redução de 49% do pico parasitêmico de animais infectados e tratados com dose única de T4C (100 mg/Kg). A análise histológica e por PCR quantitativa de diferentes tecidos revelou uma redução significativa da carga parasitária apenas no intestino de animais tratados com T4C (100 ou 150 mg/Kg). Por outro lado, a dose única de 200 mg/Kg diminuiu o peso corporal e sobrevida de animais não infectados. O tratamento prolongado (10 mg/Kg dia) não reduziu a parasitemia, mas aumentou a sobrevida e diminuiu a carga parasitária no intestino. T4C não afetou a expressão gênica de IFN-g e IL-10 em qualquer um dos tecidos analisados (coração, baço, intestino). Em conclusão, T4C contribui em reduzir a virulência da infecção, mas é tóxico em doses que superem 150 mg/kg. / Trypanosoma cruzi is dependent on proline for a variety of processes such as energy metabolism, host cell invasion, differentiation and resistance to osmotic, metabolic and oxidative stress. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C), a proline structural analogue, inhibits the proline uptake and interacts with several stress factors that the parasite undergoes throughout its life cycle. Herein, we evaluated the T4C effects on mice infection by T. cruzi. It was observed a reduction of 49% of the parasitemia peak in infected mice that were treated with a unique dose of T4C (100 mg/Kg). Histological and quantitative PCR analysis of several tissues revealed a significant reduction of parasite load in the intestine (100 or 150 mg/kg). In the other hand, the unique dose of 200 mg/Kg reduced the body weight and survival of non-infected mice. A T4C prolonged treatment (10 mg/Kg day), did not diminish the parasitemia, but increased survival and reduced the parasite load in the intestine. T4C did not affect the gene expression of g-IFN and IL-10 in any of the organs analyzed (heart, spleen, intestine). In conclusion, T4C-treatment contributes to reduce the virulence of T. cruzi infection, but it was toxic in doses over 150 mg/kg.

Orientador: Fernando Gomes Romeiro / Resumo: Aminoácidos de cadeia ramificada aumentam a perfusão cerebral de pacientes com encefalopatia hepática (EH), mas o aminoácido responsável por esse aumento e os mecanismos envolvidos ainda não são conhecidos. Este estudo comparou a perfusão cerebral e a melhora clínica durante a suplementação de leucina ou isoleucina. Após a randomização, 27 indivíduos com cirrose e EH receberam suplementos de leucina ou isoleucina por um ano. Exames de tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) e cintilografia cerebral dinâmica (DBS) foram realizados antes do estudo e após 1, 8 e 12 meses de suplementação. Apenas o grupo que recebeu isoleucina teve aumento da perfusão cerebral aos 8 meses de tratamento pelo exame de SPECT e pela cintilografia (p<0,001 e p = 0,05, respectivamente), também observado pelo SPECT aos 12 meses de suplementação (p < 0,05). O aumento do fluxo cerebral foi associado a melhora da EH aos 8 e 12 meses de suplementação (p=0,008 e 0,004, respectivamente), porém essa melhora não foi observada no grupo que recebeu leucina (p=0,313 e 0,055, respectivamente). A suplementação com isoleucina obteve melhor impacto na restauração da perfusão cerebral em pacientes com EH. / Abstract: Branched-chain amino acids increase the brain perfusion of patients with hepatic encephalopathy (HE), but the amino acid and the mechanisms involved are still unknown. This study compared brain perfusion and clinical improvement during leucine or isoleucine supplementation. After randomization, 27 subjects with cirrhosis and HE received leucine or isoleucine supplements for one year. Brain single photon emission computed tomography (SPECT) and dynamic brain scintigraphy (DBS) were performed pretreatment and at 1, 8 and 12 months of supplementation. Brain perfusion was increased only in the isoleucine group at 8 months of treatment by both SPECT and DBS (p<0.001 and p = 0.05, respectively) and by SPECT at the 12th month (p < 0.05). This was associated with hepatic encephalopathy improvement at 8 and 12 months (p=0.008 and 0.004, respectively), which was not observed in the leucine group (p=0.313 and 0.055, respectively). Isoleucine supplementation achieved a better impact on brain perfusion restoration in HE. / Doutor

O objetivo deste estudo foi determinar a exigência de lisina digestível para dieta de frangos de corte machos por meio das características de desempenho, composição corporal e rendimento de carcaça dos animais. Foram realizados dois ensaios, avaliando as fases de 1 a 21 e 1 a 42 dias de idade (ensaio 1), e de 22 a 42 dias de idade (ensaio 2). As dietas diferiram quanto aos níveis de lisina digestível, mantendo-se a relação dos demais aminoácidos com a lisina seguindo o conceito de proteína ideal. Foram utilizados seis tratamentos de lisina digestível na dieta dos animais até 21 dias de idade foram de: 1,026; 1,125; 1,225; 1,324; 1,423; e 1,523%; e após os 21 dias de idade: 0,877; 0,961; 1,046; 1,131; 1,216; e 1,301%. Em cada um dos ensaios, foram utilizados 1296 animais da linhagem Cobb -500®, distribuídos em 36 unidades experimentais de 36 aves cada. As características de desempenho avaliadas foram consumo de ração, peso corporal, ganho de peso, conversão alimentar, viabilidade criatória e índice de eficiência produtiva. Aos 21 dias de idade (ensaio 1) e aos 42 dias de idade (ensaios 1 e 2) foram selecionadas ao acaso sete aves por parcela experimental, cinco para avaliação do rendimento e peso de carcaça total e de cortes comerciais, e duas para avaliação da composição corporal. Os cortes comerciais avaliados foram peito, coxa, sobrecoxa e asa. Na composição corporal, avaliou-se o teor de matéria seca, extrato etéreo, matéria mineral e proteína bruta. Os dados foram submetidos à análise de variância, e havendo diferenças significativas as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. A estimativa da exigência de lisina digestível foi realizada utilizando-se modelos de regressão linear ou quadrática. A conversão alimentar foi influenciada em todas as fases, sendo sua exigência maior que para ganho de peso. A exigência para conversão alimentar foi de 1,374; 1,243; e 1,301% para as fases de 1 a 21, 1 a 42 e 22 a 42 dias de idade, respectivamente. A lisina digestível influenciou o rendimento de peito dos animais apenas nas idades de 1 a 42 e 22 a 42 dias de idade, com exigências de 1,200 e 1,301%, respectivamente. Nas idades de 1 a 21 dias e 1 a 42 dias de idade apresentou-se diferenças na deposição proteica na carcaça, com melhores níveis à 1,305 e 1,262%, respectivamente. Níveis maiores que as recomendações conhecidas em âmbito nacional de lisina digestível trouxeram benefícios aos animais sobre conversão alimentar, rendimento de peito, deposição de proteína e gordura corporal. / The objective of the present study was to evaluate the optimal levels of digestible lysine in the diet of male broilers, evaluating performance characteristics, body composition, and carcass yield of the animals. Two trials were carried out to assess the stages from 1 to 21 and 1 to 42 days of age (assay 1), and from 22 to 42 days of age (assay 2). The diets differed in digestible lysine content, maintaining the relation among the other amino acids and lysine in accordance with the ideal protein concept. The six levels of digestible lysine in the diet of animals up to 21 days of age were: 1.026%; 1.125%; 1.225%; 1.324%; 1.423%, and 1.523%; and after 21 days of age: 0.877%; 0.961%; 1.046%; 1.131%; 1.216%, and 1.301%. A total of 1296 animals were employed in each of, distributed in 36 experimental units of 36 birds each. The determined performance characteristics corresponded to feed intake, body weight, weight gain, feed conversion, viability, and productive efficiency index (except for animals from 1 to 21 days of age). At 21 days of age (assay 1) and 42 days of age (assay 1 and 2), seven birds per experimental unit were selected at random, five for the estimation of yield and total carcass and commercial cut weight, and two for the evaluation of body composition. The commercial cuts consisted of breast, thigh, drumsticks and wing. Regarding body composition, dry matter, ethereal extract, ash, and crude protein content were calculated. The data were submitted to variance analysis, and when significant differences were observed, the means were compared using the Tukey test. The estimation of digestible lysine requirements was performed applying linear or quadratic regression models. Feed conversion was influenced in every phase, and its requirement was greater than for weight gain. The requirements for feed conversion were 1.374%; 1.243%, and 1.301% for phases from 1 to 21, 1 to 42, and 22 to 42 days of age, respectively. Digestible lysine only affected animal breast yield during the ages from 1 to 42 and 22 to 42 days of age, with requirements of 1.200% and 1.301%, respectively. At ages ranging from 1 to 21 days and 1 to 42 days of age, differences in protein deposition in the carcass were observed, displaying superior levels at 1.305% and 1.262%, respectively. With respect to nationally known recommendations regarding digestible lysine, higher levels of the amino acid in the diet have brought benefits regarding animal feed conversion, breast yield, protein deposition, and body fat.

O sorgo é uma planta monocotiledônea diplóide com ciclo de vida de aproximadamente quatro meses. Apresenta grande relevância na agricultura pela sua utilização tanto para a alimentação humana e de animais quanto para a produção de biocombustíveis. Recentemente, o sorgo também surge como um forte candidato como planta modelo em estudos genômicos e fisiológicos relacionados com parede celular de gramíneas C4. Porém, para a análise da função de genes nesta espécie é essencial o estabelecimento da tecnologia de transformação genética que por sua vez depende de um eficiente método de regeneração de plantas. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo de cultura de tecidos utilizando discos de folhas e embriões imaturos como explantes, de modo a avaliar a redução do nível de oxidação na cultura in vitro pelo uso de antioxidantes e determinar as concentrações de reguladores vegetais para indução de embriogênese somática e regeneração de plantas. Em discos de folhas, os antioxidantes, PVP, ácido ascórbico e ác. cítrico foram testados na manipulação dos explantes até a inoculação em meio de cultura, porém não houve redução no nível de oxidação. Foram testados diferentes concentrações de 2,4-D para indução de calos e o uso de 1 mg L-1 e 2 mg L-1 apresentaram melhores respostas em embriogênese somática. Diferentes meios de cultura foram testados para obtenção de regeneração de plantas, mas a eficiência chegou somente a 1% de plantas a partir de discos de folhas. Em embriões imaturos, além dos antioxidantes PVP e ácido ascórbico, foram testados também os aminoácidos asparagina e prolina em meio de indução de calos. O uso de 2 g L-1 de asparagina e 3 g L-1 de prolina no meio de indução de calos e 3 mg L-1 de TDZ no meio de regeneração de plantas aumentou a eficiência de obtenção de plantas para até 15%. Assim, o uso de embriões imaturos foi considerado o explante mais promissor para a cultura de tecidos de sorgo. Devido aos altos níveis de oxidação e a baixa eficiência de regeneração de plantas em cultura de tecidos, foi testado o método de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens conhecido como \"Floral dip\". Esta técnica não necessita da etapa de regeneração de plantas in vitro. Inicialmente, resultados promissores foram obtidos, porém há a necessidade do aprimoramento da metodologia. / Sorghum is a diploid monocot plant with a short life cycle of about 4 months. This crop is important in agriculture because it can be used for animal and human feed, and as well as source of raw material for biofuel production. Recently, sorghum also emerges as a strong candidate being a model plant on genomic and physiological studies related to cell wall in C4 grasses. Nevertheless, an efficient plant regeneration method is required for the establishment of genetic transformation technique to conduct the characterization of functional genes. In this context, the objective of this work was to establish a tissue culture protocol to evaluate the oxidation level of in vitro culture using leaf discs and immature embryos as explants, and testing different antioxidants and hormones concentrations for somatic embryogenesis and plant regeneration. In leaf discs, PVP, ascorbic acid and citric acid antioxidants were tested when manipulating the explants until their inoculation in culture media, but these factors failed to show any reduction in oxidation. In order to obtain somatic embryogenesis different concentrations of 2,4-D were tested for callus induction, 1,0 and 2,0 mg L-1 showed the best results. Several plant regeneration medium were tested however, only up to 1% of regeneration was achieved using leaf discs. In immature embryos, besides PVP and ascorbic acid antioxidants also asparagine and proline amino acids were tested in the callus induction media. The use of 2 g L-1 asparagine and 3 g L-1 proline in callus induction media and 3 mg L-1 TDZ in the regeneration media improved shoot regeneration efficiency up to 15%. Thus, the use of immature embryos was considered as a better option as explant for tissue culture of sorghum. Due to high production of oxidation and low frequency of plant regeneration in tissue culture, the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens known as \"Floral Dip\" method was tested. This technique does not require in vitro plant regeneration. Preliminary results were obtained, but the methodology needs to be improved.