O repertório de linfócitos T de um dado indivíduo reflete uma amostra selecionada de receptores do linfócito T (TCR) composta por todas variáveis que existem numa linhagem de DNA. Durante o desenvolvimento da célula T, as variáveis do TCR se combinam para formar cadeias alfa e beta que são responsáveis pela interação com o peptídeo e o complexo de histocompatibilidade principal, e desta forma, modelar respostas imunes específicas. Considerando o envolvimento do TCR no desenvolvimento de respostas imunes, vários estudos foram direcionados para analisar polimorfismos de certos genes do TCR e suas associações com condições patológicas. Neste estudo foram descritas as freqüências alélicas e genotípicas de dois segmentos variantes do TRCBV (TCRBV3S1 e TCRBV20) num grupo de 138 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Os resultados foram comparados com o grupo controle (indivíduos de diferentes grupos étnicos e previamente hígidos). Já foi sugerido que alguns genes do TCRBV são preferencialmente expressados por celulas T infiltrando os rins em pacientes com nefrite lúpica, e polimorfismos genéticos de citocinas e, provavelmente, do TCR, podem contribuir para desregular a atividade do linfócito T. Ambos polimorfismos analisados estão relacionados com a expressão de segmentos na superfície do linfócito T. A variante TCRBV3S1 se correlaciona com o número de linfócitos T usando este segmento gênico no sangue periférico, e um dos alelos do TCRBV20 determina um segmento não funcional do TCRBV; provocando, em indivíduos homozigotos, uma falha no repertório dos linfócitos T periféricos. Desta forma, modificaria a capacidade de um certo individuo desenvolver uma resposta imune. Embora a freqüência alélica destes dois segmentos gênicos difira de acordo com o grupo étnico analisado, não houve correlação das variantes estudadas com o desenvolvimento de lúpus ou nefrite lúpica. Não está claro se a ausência de certos segmentos gênicos do TCR tem significado funcional. A hipótese que polimorfismos genéticos do TCR possam determinar se os linfócitos T vão provocar uma doença auto-imune ainda é discutida. / The peripheral T cell repertoire present in a given individual reflects a selected sample of the potential repertoire, composed from all TCR variable segments that exist in germline configuration at the DNA. During T cell development, the TCR variable segments rearrange to form alpha and beta chains that, as an heterodimer, are responsible by the interaction with the peptide-MHC complex and can, consequently, shape specific immune responses. Considering the TCR involvement in the development of immune responses, several studies are directed to the analysis of TCR gene segment polymorphisms and association of allelic variants with pathological conditions. Here we describe the allelic and genotypic frequencies of biallelic variants of two TCRBV gene segments (TCRBV3S1 and TCRBV20) in a sample of 138 systemic lupus erythematosus patients comparing with data from control samples obtained from human populations with different ethnic backgrounds. It was already suggested that some TCRBV gene segments are preferentially expressed by T cells infiltrating the kidneys of patients with lupus nephritis, and that genetic polymorphisms of cytokines and, perhaps, of the TCR may contribute to deregulate lymphocyte activity. Both analysed polymorphisms are related to the expression of the segment at the T cell surface (the TCRBV3S1 variants correlates with the number of T cells using the relevant gene segment at the peripheral pool, and one of the TCRBV20 alleles codes a non-functional TCRBV segment, leading in homozygous individuals to the presence of a “gap” in the peripheral T cell repertoire) thus modifying the capacity of a given individual to develop an immune response. Although allelic frequencies of these both TCRBV gene segments differs according to the ethnic group analysed, there were no correlation of the variants studied and development of lúpus and lupus nephrites. It is not yet well established whether the absence of certain TCRBV gene segments has functional significance. The suggestion that genomic polymorphisms of TCR genes (along with the correct HLA alleles) determine whether T cells can direct a pathogenic autoimmune response is discussed.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-14T15:24:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / CAPES / Com o aumento da prevalência de doenças inflamatórias, em especial as alérgicas, a busca por estratégias terapêuticas visando à melhoria de vida dos indivíduos doentes tornou-se um vasto campo de pesquisa. Neste âmbito, o uso de helmintos e derivados que possuem potencial imunomodulatório tem se mostrado eficiente na inibição da inflamação em modelos experimentais dessas doenças. Objetivo: Produzir e analisar, in silico, o antígeno recombinante do Trichuris trichiura homólogo ao fator inibidor de migração de macrófagos (rTt-MIF) e avaliar seu efeito em cultura de células monomorfonucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos atópicos e não atópicos. Métodos: A análise in silico da proteína foi realizada utilizando diversas ferramentas de bioinformática. A sequência codificadora do antígeno recombinante foi sintetizada e clonada em um plasmídeo de expressão, a partir do qual foi realizada a expressão heteróloga da proteína em sistema procarioto, com posterior purificação por cromatografia de afinidade e determinação do conteúdo proteico e de endotoxina. Após teste cutâneo e dosagem de IgE por ImunoCAP, foram selecionados 12 indivíduos não atópicos e 14 indivíduos atópicos cujo sangue periférico foi coletado para realizar o cultivo de células monomorfonucleares. As células foram cultivadas sob três condições: estímulo do rTt-MIF, meio de cultivo sem estímulo e estimuladas por Pokeweed ou LPS. Após o cultivo, os sobrenadantes foram coletados para realização da dosagem das citocinas IL-10, IFN-γ, IL-5 e IL-17A. Resultados: A molécula caracterizada como estável e solúvel foi produzida, obtida na quantidade de 2,4 mg/mL com 1,9 EU/mL. O rTt-MIF induziu o aumento da produção de IL-10 pelas células dos indivíduos atópicos (P=0,0001) e dos não atópicos (P=0,0005). Em relação às citocinas IFN-γ, IL-5 e IL-17, o rTt-MIF não induziu a produção destas pelas células dos indivíduos atópicos e não atópicos. Conclusão: A ação do rTt-MIF sobre o cultivo de células momonucleares do sangue periférico, de aumentar a produção de IL-10 e não induzir a produção de IFN-γ, IL-5 e IL-17A, mostra o potencial imunomodulador dessa molécula, com possível efeito de reduzir a elevação de eosinófilos, neutrófilos e citocinas inflamatórias. / With the increasing prevalence of inflammatory diseases, in particular allergies, the search for therapeutic strategies aiming to improve life quality of sick individuals has become a vast field of research. In this context, the use of helminths and their derivatives that demonstrate potential immunomodulatory effect has been effective in inhibiting inflammation in experimental models of inflammatory diseases. Objective: To produce and analyze in silico the recombinant antigen from Trichuris trichiura homologous to the macrophage migration inhibitory factor (rTt-MIF) and evaluate its effect on peripheral blood mononuclear cells culture (PBMC) of atopic and non-atopic individuals. Methods: Bioinformatics tools made the analysis in silico. The Tt-MIF codifying sequence was synthesized and cloned into a plasmid, allowing the heterologous expression of the protein in a prokaryotic system, with subsequent purification by affinity chromatography and protein and endotoxin quantifications. After prick test and IgE dosage by ImmunoCAP test, 12 non-atopic individuals and 14 atopic individuals were selected, whose peripheral blood were collected to obtain the mononuclear cells (PBMC) for in vitro culture. Cells were stimulated with the rTt-MIF, as negative control cells were cultivated without stimuli and, as positive control, cells were cultivated with Pokeweed or LPS. After the culture, the supernatants were assayed to quantify IL-10, IFN-γ, IL-5 and IL-17A. Results: The protein characterized as soluble and stable was produced and obtained in the amount of 2,4 mg/mL with 1,9 EU/mL. The rTt-MIF induced a stimulatory effect on IL-10 production by cells from atopic individuals (P=0.0001) and by cells from non-atopic individuals (P=0,0005). The rTt-MIF did not induce the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A by cells from atopic and non-atopic individuals. Conclusion: The effects of rTt-MIF increasing IL-10 production and not inducing the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A on human PBMC cultures are indicative of its immunomodulatory potential, with possible effect of decreasing eosinophilic and neutrophilic presence and inducing immune regulation.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / CNPq: 136833/2008-0 / CNPq: 559626/2009-6 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica Aplicada y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta enero de 2018 / Los cánceres del aparato digestivo (CAD) son, en su conjunto, la principal causa de defunciones por cáncer a nivel mundial. Pese al gran desarrollo de diversas terapias, el tratamiento contra este tipo de cáncer continúa siendo poco eficaz y conlleva un amplio número de efectos secundarios que disminuyen la calidad de vida del paciente. Esto hace necesario investigar y desarrollar nuevas terapias que combatan de forma específica y eficaz el desarrollo de tumores. En la actualidad, la inmunoterapia es una de las estrategias terapéuticas más promisorias. El sistema inmune posee el potencial de reconocer y eliminar específicamente a las células tumorales mediante el reconocimiento de proteínas expresadas diferencialmente en estas células, denominadas antígenos tumorales. Sin embargo, el tumor genera un microambiente que inhibe la respuesta inmune antitumoral, por lo que el desarrollo de terapias capaces de interrumpir esta inhibición puede permitir que el sistema inmune elimine eficientemente las células tumorales. Actualmente existen dos tratamientos de este tipo aprobados para su uso en humanos. El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una proteína de superficie altamente expresada en una gran variedad de CADs y por ende, un blanco atractivo para el desarrollo de inmunoterapias específicas contra este conjunto de cánceres. En este trabajo se generó un bacteriófago filamentoso M13 específico contra CEA para ser usado en una futura inmunoterapia como un agente inmunogénico que se una a CEA en la superficie de las células tumorales. Así, el fago, a través de su ADN genómico de hebra simple, activará a las células del sistema inmune innato infiltrantes del tumor y promoverá un microambiente proinflamatorio capaz de revertir la inmunosupresión del tumor y permitir que la respuesta inmune adaptativa elimine a las células tumorales de forma específica. El bacteriófago anti-CEA se generó en cultivos de E. coli transformadas con fagomio e infectadas con un fago auxiliar. El fagomidio pSEX81 permitió expresar un fragmento variable de anticuerpo de cadena simple (scFv) específico contra CEA fusionado a la proteína pIII. El fago auxiliar (denominado hiperfago) permitió expresar las proteínas que conformarán la nueva partícula viral. La presencia de la proteína de fusión scFv-pIII en el bacteriófago M13 anti-CEA se confirmó mediante western blot usando un anticuerpo específico contra la proteína pIII. La especificidad del fago anti-CEA contra el antígeno CEA purificado se confirmó mediante ensayos de ELISA. Por otra parte, se comprobó in vitro que el bacteriófago anti-CEA se une a la proteína CEA expresada en la superficie de líneas celulares tumorales de origen humano y murino mediante citometría de flujo. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que este fago se unirá al antígeno tumoral CEA in vivo, convirtiéndolo en una potencial inmunoterapia contra CADs / Gastrointestinal cancers are the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the great development of cancer therapies, the treatment of this type of cancer remains ineffective and involves a large number of side effects that negatively impact the life quality of patients. In order to solve these problems, development of new therapies able to specifically and effectively eradicate tumors is needed. Currently, immunotherapy is one of the most promising therapeutic strategies. The immune system has the potential to specifically eliminate tumor cells by recognizing tumor antigens, which are proteins differentially up-regulated in these cells. However, tumors create an immunosuppressive microenvironment that inhibits the immune responses against the tumor, therefore development of therapies capable of disrupting this inhibition may allow the immune system to eliminate tumor cells efficiently. Currently, two drugs following this principle have been approved for human use. Carcinoembryonic antigen (CEA) is a surface protein highly expressed in a variety of gastrointestinal cancers, thus it is an attractive target for the development of immunotherapies targeting this type of cancers. In this thesis, a M13 filamentous bacteriophage able to bind CEA at the surface of tumor cells was generated as an immunogenic agent for a future immunotherapy. This CEA-specific M13 filamentous bacteriophage, through its genomic single-stranded DNA, is expected to activate tumor-infiltrating innate immune cells promoting a proinflammatory microenvironment capable of disrupting tumor-induced immunosuppression and allowing adaptive immune responses to efficiently eliminate tumor cells. Furthermore, this strategy will promote the presentation of tumor antigens and the generation of tumor-specific adaptive immune responses The CEA-specific bacteriophage was generated in E. coli cultures transformed with a phagemid and infected with a helper phage. The phagemid vector pSEX81 was used for generating the CEA-specific single chain variable fragment (scFv) fused to the pIII protein on the surface of M13 bacteriophages. The helper phage (or hyperphage) allowed the expression of the other viral proteins needed to form the bacteriophage particles. The presence of scFv-pIII fusion protein in CEA-specific bacteriophage preparations was confirmed by western blot analysis using an M13 pIII-specific antibody. The capability of the bacteriophage to specifically bind purified CEA in vitro was confirmed by ELISA. Moreover, it was demonstrated that the CEA-specific bacteriophage binds CEA expressed on the surface of mouse and human tumor cell lines. The results obtained in this thesis suggest that this CEA-specific bacteriophage will bind to CEA-expressing tumors in vivo, and it represents a potential immunotherapy against gastrointestinal cancer. The in vitro observed specificity of the anti-CEA M13 bacteriophage suggests that this phage will bind to this tumor antigen in vivo, making it a powerful tool for potential gastrointestinal cancer targeted immunotherapies / CORFO Innova

Made available in DSpace on 2014-09-24T12:58:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 154.pdf: 7447537 bytes, checksum: f05caacd8152f680cccd33520b65caea (MD5) Previous issue date: 2004 / O teste intradérmico para o diagnóstico da Leishrnaniose foi preconizado por Montenegro em 1926. Tratava-se de um extrato alcalino de formas promastigotas de Leishmania que se acreditava livre de partículas e de parasitos inteiros. Atualmmte, os antígenos mais utilizados constituem-se ainda de formas promastigotas, algumas íntegras e outras sonicadas, a partir de "pool " cepas de Leishmania ou cepas únicas, diluídas em soluções preservadoras como salinas fenoladas 0,4 por cento ou mertiolatadas 1:10.000. A produção do antígeno, não tem portanto uma padronização definida no Brasil e no Mundo e vários preparações antigênicos em diferentes apresentações são descritas comprometendo a qualidade e a comparabilidade das respostas. Justificou-se assim, a necessidade de padronização da metodologia para a produção do antígeno de Montenegro, em diferentes fases. Este estudo propôs definições de padrões na produção do antígeno para a intradermorreação de Montenegro em relação a melhor inóculo padronizado de promastigotas, métodos de quantificação de concentração de proteínas, prazo de validade e controles de qualidade, universalmente aceitos. / Montenegro’s antigen was advocated publicly by Montenegro in 1926 for leishmaniasis diagnosis through intradermal test. It was an alkaline extract of Leishmania promastigotes forms, which was thought to be particles of and parasites free. However, nowadays the most used antigens are of promastigotes forms, some of which are integral and others are sonicated as from pool of Leishmania strains or single ones diluted in preserving solutions like phenol or merthiolate saline. The production of this antigen has not been standardized in Brazil or worldwide; thus several antigen preparations, in different doses, are described jeopardizing the quality and comparison of answers. Therefore, it was made necessary a standardized methodology to produce Montenegro’s antigen in different phases. This study propose antigen definitions for Montenegro’s intradermal reactions related to the best promastigotes inoculum, protein concentration checking methods, validity and quality controls equivalent to the vaccines ones.

Made available in DSpace on 2016-06-23T12:19:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 3 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf.txt: 114168 bytes, checksum: 0b16d652e923152bc1715e232dfbbe05 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela. Teresina, PI, Brasil / Meningite criptocócica causa aproximadamente 15% da mortalidade relacionada com a AIDS anualmente. A Criptococose é uma enfermidade negligenciada. Contudo, pode ser prevenida pela realização do screening através da pesquisa do Antígeno Criptocócico(CrAg) e de tratamento precoce durante um longo período de detecção ou infecção subclínica. Nosso estudo determinou a prevalência da antigenemia criptocócica levando em consideração níveis de linfócitos CD4 e sintomas clínicos. MÉTODOS: Ao todo, 109 pacientes com HIV/AIDS, consentiram em participar deste estudo. Inicialmente, fez-se um levantamento de dados sócio- demográficos dos mesmos, além dos dados clínicos contidos no prontuário. A pesquisa de antígeno criptocócico utilizando Lateral Flow Assay( CrAg/LFA) no sangue e urina foi realizado em todos os pacientes inclusos no estudo, independente dos níveis de linfócitos CD4. Para os que apresentaram CrAg positivo em sangue e urina, foram submetidos a punção lombar para avaliação de CrAg no líquor RESULTADOS: Dos 109 pacientes, 67% eram do sexo masculino, 92% eram provenientes da área urbana e 76% eram procedentes do estado do Piauí. A média de idade foi de 35 anos, sendo 57% com idade entre 31-45 anos de idade. Cerca de 49,5% faziam uso irregular da terapia antirretroviral (TARV), 18% usavam corretamente a TARV e 32,5% eram virgens de tratamento. A prevalência de antigenemia criptocócica, foi de 8,2%. Daqueles pacientes com CrAg no sangue e urina positivos, em 3,6 % apresentava-se com CD4< 100 cél/mm3, 58,7% com CD4 100-199 cel/mm3 e 37,7% com CD4 \2265 200 cel/mm3. Os sintomas mais comuns nos pacientes com CrAg positivo foram cefaleia, febre e vômitos. CONCLUSÃO: O CrAg/LFA permite um exame simples, rápido e de baixo custo para o diagnóstico da criptococose e é recomendado para uso com soro, plasma, urina ou líquor em pacientes sintomáticos. O uso adequado da terapia antirretroviral contribui para uma redução da morbimortalidade dos pacientes com HIV/AIDS. Além disso, CrAg/LFA tem o potencial para identificar pacientes com infecção assintomática quem devem receber fluconazol profilático / Annually, cryptococcal meningitis causes approximately 15% of deaths related to AIDS. The cryptococcosis is a neglected disease. Nevertheless, it can be prevented by performing the screening by means of investigating the cryptococcal antigen (CrAg) and early treatment for a long period of detection or subclinical infection. Our study determined the prevalence of cryptococcal antigenemia taking into account the levels of CD4 lymphocytes and clinical symptoms. METHODS: All together, 109 patients with HIV / AIDS, agreed to participate in this study. Initially, there was a survey of patients\2019 socio-demographic data, in addition to clinical data from the medical record. The cryptococcal antigen test using Lateral Flow Assay (CrAg / LFA) in blood and urine was carried out in all patients included in the study, regardless of CD4 lymphocyte levels. Those who were CrAg positive for blood and urine underwent a lumbar puncture for CrAg assessment in the fluid RESULTS: From the 109 patients, 67% were male, 92% were from urban areas and 76% were from the state of Piauí. The average age was 35 years, 57% aged between 31-45 years old. About 49.5% made irregular use of antiretroviral therapy (ART), 18% correctly used the ART and 32.5% were treatment-naïve patients. The prevalence of cryptococcal antigenemia was 8.2%. From the patients tested positive for CrAg for blood and urine, 3.6% had CD4 < 100 cells/mm³, 58.7% had CD4 100-199 cells/mm³ and 37.7% had CD4 \2265 200 cells/mm³. The most common symptoms in patients with CrAg positive were headaches, fever and vomiting. CONCLUSION: CrAg / LFA allows a simple, fast and low cost test for the diagnosis of cryptococcosis and is recommended for use with serum, plasma, urine or fluid in symptomatic patients. The correct use of the antiretroviral therapy contributes to a reduction in morbidity and mortality of HIV / AIDS patients. Furthermore, CrAg / LFA have the potential to identify patients with asymptomatic infection who must receive prophylactic fluconazole

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