Resumo não disponível

O repertório de linfócitos T de um dado indivíduo reflete uma amostra selecionada de receptores do linfócito T (TCR) composta por todas variáveis que existem numa linhagem de DNA. Durante o desenvolvimento da célula T, as variáveis do TCR se combinam para formar cadeias alfa e beta que são responsáveis pela interação com o peptídeo e o complexo de histocompatibilidade principal, e desta forma, modelar respostas imunes específicas. Considerando o envolvimento do TCR no desenvolvimento de respostas imunes, vários estudos foram direcionados para analisar polimorfismos de certos genes do TCR e suas associações com condições patológicas. Neste estudo foram descritas as freqüências alélicas e genotípicas de dois segmentos variantes do TRCBV (TCRBV3S1 e TCRBV20) num grupo de 138 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Os resultados foram comparados com o grupo controle (indivíduos de diferentes grupos étnicos e previamente hígidos). Já foi sugerido que alguns genes do TCRBV são preferencialmente expressados por celulas T infiltrando os rins em pacientes com nefrite lúpica, e polimorfismos genéticos de citocinas e, provavelmente, do TCR, podem contribuir para desregular a atividade do linfócito T. Ambos polimorfismos analisados estão relacionados com a expressão de segmentos na superfície do linfócito T. A variante TCRBV3S1 se correlaciona com o número de linfócitos T usando este segmento gênico no sangue periférico, e um dos alelos do TCRBV20 determina um segmento não funcional do TCRBV; provocando, em indivíduos homozigotos, uma falha no repertório dos linfócitos T periféricos. Desta forma, modificaria a capacidade de um certo individuo desenvolver uma resposta imune. Embora a freqüência alélica destes dois segmentos gênicos difira de acordo com o grupo étnico analisado, não houve correlação das variantes estudadas com o desenvolvimento de lúpus ou nefrite lúpica. Não está claro se a ausência de certos segmentos gênicos do TCR tem significado funcional. A hipótese que polimorfismos genéticos do TCR possam determinar se os linfócitos T vão provocar uma doença auto-imune ainda é discutida. / The peripheral T cell repertoire present in a given individual reflects a selected sample of the potential repertoire, composed from all TCR variable segments that exist in germline configuration at the DNA. During T cell development, the TCR variable segments rearrange to form alpha and beta chains that, as an heterodimer, are responsible by the interaction with the peptide-MHC complex and can, consequently, shape specific immune responses. Considering the TCR involvement in the development of immune responses, several studies are directed to the analysis of TCR gene segment polymorphisms and association of allelic variants with pathological conditions. Here we describe the allelic and genotypic frequencies of biallelic variants of two TCRBV gene segments (TCRBV3S1 and TCRBV20) in a sample of 138 systemic lupus erythematosus patients comparing with data from control samples obtained from human populations with different ethnic backgrounds. It was already suggested that some TCRBV gene segments are preferentially expressed by T cells infiltrating the kidneys of patients with lupus nephritis, and that genetic polymorphisms of cytokines and, perhaps, of the TCR may contribute to deregulate lymphocyte activity. Both analysed polymorphisms are related to the expression of the segment at the T cell surface (the TCRBV3S1 variants correlates with the number of T cells using the relevant gene segment at the peripheral pool, and one of the TCRBV20 alleles codes a non-functional TCRBV segment, leading in homozygous individuals to the presence of a “gap” in the peripheral T cell repertoire) thus modifying the capacity of a given individual to develop an immune response. Although allelic frequencies of these both TCRBV gene segments differs according to the ethnic group analysed, there were no correlation of the variants studied and development of lúpus and lupus nephrites. It is not yet well established whether the absence of certain TCRBV gene segments has functional significance. The suggestion that genomic polymorphisms of TCR genes (along with the correct HLA alleles) determine whether T cells can direct a pathogenic autoimmune response is discussed.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-12T16:14:53Z No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / A primeira microepidemia pelo Trypanosoma cruzi na Amazônia brasileira foi publicada em 1969 e, desde então, outras têm sido observadas em famílias residentes em vários municípios dos Estados daquela região. Em 2007 e 2009 foram identificados casos clínicos de doença de Chagas aguda (DCA) em famílias dos municípios de Barcarena e Breves, Estado do Pará. Este estudo mostrou anticorpos da classe IgG contra antígenos do T. cruzi em 35,7% (39/109) das pessoas, sendo 29,5% (13/44), 26,6% (4/15), 20,6% (6/29), respectivamente, das famílias A, B, e C residentes no município de Barcarena, e em 76,1% (16/21) da família D do município de Breves; em 66,6% (14/21) dos casos dessa família foram identificados anticorpos IgM anti-T. cruzi. Os resultados de PCR com iniciadores de nDNA do parasito foram positivos em 76,1% (83/109) dos casos: Família A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8% e D, 57,1%. De grande interesse, em 21 casos de DCA o exame parasitológico positivo foi convalidado pela PCR com iniciadores de nDNA de T. cruzi. Ademais, nas células germinativas do sêmen foi confirmada infecção ativa pelo T. cruzi, também presente nas células somáticas do sangue, pela PCR com iniciadores específicos de nDNA e kDNA. Adicionalmente, 16,5% (18/109) casos positivos apenas para kDNA, sem a infecção ativa, retiveram seqüências de minicírculos integradas no genoma. Nesses 18 casos as mutações de kDNA foram transferidas para as progênies pela reprodução sexuada. Com esse respeito, a diferença de 53% (44/83) entre os resultados obtidos pela PCR para nDNA e aqueles dos testes imunológicos contra antígenos de T. cruzi tem importância epidemiólogica ainda não apreciada em outra investigação. Pois, a presença de nDNA e kDNA foi encontrada na ausência de anticorpos contra antígenos de T. cruzi nos hospedeiros tolerantes aos antígenos do parasito. Ademais, em todos esses casos de infecção ativa também ocorreu transferência vertical de seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada e as mutações foram prontamente identificadas no genoma humano. Então, a larga diferença entre os resultados de testes imunológicos e de PCR pode ser explicada pela aquisição da infecção via sexual ou transplacentária, durante a fecundação ou na fase inicial da gestação, antes do desenvolvimento do sistema imune do embrião, e o indivíduo nasce tolerante aos antígenos de T. cruzi. As mutações de kDNA foram identificadas nos cromossomos, e o principal sítio de integração foi retrotransposon LINE-1 em 70% (301/430) das quimeras identificadas. Em 83,3% (50/60) dos casos as mutações ocorreram no gene do receptor olfatório OR1-17, e em apenas 16,6% (10/60) foram encontradas em genes com outras funções reconhecidas. O achado mais relevante neste estudo foi a documentação de transmissão do kDNA e do nDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / By 1969, a microepidemic of Trypanosoma cruzi was recognized in the Brazilian Amazonia, and lately they have been constantly reported in families from several counties in the region. By 2007 and 2009, clinical cases of acute Chagas disease were identified in families living in counties of Barcarena and Breves, Estado do Pará. The exams revealed IgG antibodyes against T. cruzi antígens in 35,7% (39/109) cases of the study population: Family A, 29,5% (13/44); B, 26,6% (4/15); C, 20,6% (6/29) of Barcarena county, and Family D, 76,1% (16/21) of Breves; Anti-T. cruzi IgM antibody was identified in 66,6% (14/21) of family D cases. The PCR assays with specific nDNA primer sets yielded positive results in 76,1% (83/109) cases: Family A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8%; and D, 57,1%. Of interest, 21 cases showing symptoms of acute Chagas disease had parasitologic demonstration of T. cruzi and these were convalidated by the PCR assays with nDNA primer sets. Moreover, germline cells from male gametes showed T. cruzi nDNA and kDNA as well as somatic mononuclear cells from blood. Additionally, 16,5% (18/109) of kDNA positive cases in absence of active infection retained the minicircle sequences in the genome. In these cases the kDNA mutations were vertically transfered to progenie by sexual reproduction. With this respect, the reported differences 53% (44/83) between results of antibody assays and those obtained by PCR with primer sets to T. cruzi nDNA have broad epidemiologic importance not yet reported by previous investigation. The presence of nDNA and kDNA was documented in the absence of antibody against T. cruzi antigens in hosts’ immue tolerant to the parasite antigens. Furthermore, vertical transfer of T. cruzi minicircle occurs by sexual reproduction in every case nDNA and kDNA are present in the course of an active infection. Insofar, the reported differences herein can be explained by the acquisition of the infection during fecundation or in the early gestational period, via sexual transmissão or transplacenta from mother to offspring before embryo immune system development; and the newborn becomes tolerant to T. cruzi antigens. The kDNA mutations were identified in several chromosomes, and the main integration hotspot was LINE-1 in 70% (301/430) cases. The mutations entered at the olfactory ORI-17 gene in (50/60) cases (83,3%) and in (10/60) cases (16,6%) they were found in genes with annotated functions. A highly relevant finding in this study was the documentation of transmission of kDNA, and of nDNA from T. cruzi active infection by sexual reproduction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-28T15:56:09Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.

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O repertório de linfócitos T de um dado indivíduo reflete uma amostra selecionada de receptores do linfócito T (TCR) composta por todas variáveis que existem numa linhagem de DNA. Durante o desenvolvimento da célula T, as variáveis do TCR se combinam para formar cadeias alfa e beta que são responsáveis pela interação com o peptídeo e o complexo de histocompatibilidade principal, e desta forma, modelar respostas imunes específicas. Considerando o envolvimento do TCR no desenvolvimento de respostas imunes, vários estudos foram direcionados para analisar polimorfismos de certos genes do TCR e suas associações com condições patológicas. Neste estudo foram descritas as freqüências alélicas e genotípicas de dois segmentos variantes do TRCBV (TCRBV3S1 e TCRBV20) num grupo de 138 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Os resultados foram comparados com o grupo controle (indivíduos de diferentes grupos étnicos e previamente hígidos). Já foi sugerido que alguns genes do TCRBV são preferencialmente expressados por celulas T infiltrando os rins em pacientes com nefrite lúpica, e polimorfismos genéticos de citocinas e, provavelmente, do TCR, podem contribuir para desregular a atividade do linfócito T. Ambos polimorfismos analisados estão relacionados com a expressão de segmentos na superfície do linfócito T. A variante TCRBV3S1 se correlaciona com o número de linfócitos T usando este segmento gênico no sangue periférico, e um dos alelos do TCRBV20 determina um segmento não funcional do TCRBV; provocando, em indivíduos homozigotos, uma falha no repertório dos linfócitos T periféricos. Desta forma, modificaria a capacidade de um certo individuo desenvolver uma resposta imune. Embora a freqüência alélica destes dois segmentos gênicos difira de acordo com o grupo étnico analisado, não houve correlação das variantes estudadas com o desenvolvimento de lúpus ou nefrite lúpica. Não está claro se a ausência de certos segmentos gênicos do TCR tem significado funcional. A hipótese que polimorfismos genéticos do TCR possam determinar se os linfócitos T vão provocar uma doença auto-imune ainda é discutida. / The peripheral T cell repertoire present in a given individual reflects a selected sample of the potential repertoire, composed from all TCR variable segments that exist in germline configuration at the DNA. During T cell development, the TCR variable segments rearrange to form alpha and beta chains that, as an heterodimer, are responsible by the interaction with the peptide-MHC complex and can, consequently, shape specific immune responses. Considering the TCR involvement in the development of immune responses, several studies are directed to the analysis of TCR gene segment polymorphisms and association of allelic variants with pathological conditions. Here we describe the allelic and genotypic frequencies of biallelic variants of two TCRBV gene segments (TCRBV3S1 and TCRBV20) in a sample of 138 systemic lupus erythematosus patients comparing with data from control samples obtained from human populations with different ethnic backgrounds. It was already suggested that some TCRBV gene segments are preferentially expressed by T cells infiltrating the kidneys of patients with lupus nephritis, and that genetic polymorphisms of cytokines and, perhaps, of the TCR may contribute to deregulate lymphocyte activity. Both analysed polymorphisms are related to the expression of the segment at the T cell surface (the TCRBV3S1 variants correlates with the number of T cells using the relevant gene segment at the peripheral pool, and one of the TCRBV20 alleles codes a non-functional TCRBV segment, leading in homozygous individuals to the presence of a “gap” in the peripheral T cell repertoire) thus modifying the capacity of a given individual to develop an immune response. Although allelic frequencies of these both TCRBV gene segments differs according to the ethnic group analysed, there were no correlation of the variants studied and development of lúpus and lupus nephrites. It is not yet well established whether the absence of certain TCRBV gene segments has functional significance. The suggestion that genomic polymorphisms of TCR genes (along with the correct HLA alleles) determine whether T cells can direct a pathogenic autoimmune response is discussed.

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Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-10T17:14:52Z No. of bitstreams: 2 Tese Doutorado - Patrícia d`Emery Alves Santos.pdf: 5623506 bytes, checksum: 6d2b44603aad51ee424936237aa73e8b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T17:14:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Doutorado - Patrícia d`Emery Alves Santos.pdf: 5623506 bytes, checksum: 6d2b44603aad51ee424936237aa73e8b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-01-30 / Camundongos descendentes de mães esquistossomóticas apresentam, na vida adulta, alterações na resposta imune para o antígeno heterólogo, ovalbumina (OVA). A prévia amamentação em mães esquistossomóticas induziu aumento na produção de anticorpos anti-OVA, enquanto a gestação levou à diminuição. Aqui analisamos nos descendentes de mães esquistossomóticas: a influência da IL-10 na supressão dos anticorpos e a expressão de moléculas co-estimulatórias em resposta à OVA nas células apresentadoras de antígenos (APCs). Além disso, analisamos nestes descendentes após a infecção ou administração i.p. de antígeno solúvel de ovos de S. mansoni (SEA), a presença de células T regulatórias (Tregs) e a intensidade da supressão ou potencialização anti-OVA. Camundongos machos formaram quatro grupos: animais nascidos de mães infectadas e amamentados em mães não-infectadas (MI), animais de mães não-infectadas e amamentados em mães infectadas (AI), animais nascidos/amamentados em mães infectadas (MIAI) e nascidos/amamentados em mães não-infectadas (Controle). Parte destes animais foi depletada da ação da IL-10. Em outra parte, após a imunização com OVA+adjuvante realizou-se a dupla marcação para APCs (CD45R/B220 ou CD11c e CD80/CD86/CD40/HLA-DR), e nas infecções pós-natais, para Tregs (Foxp3). Foi observado que a IL-10 esteve comprometida com a supressão de anticorpos nos camundongos do grupo MI (p<0,05) e a frequência de células CD11c+/CD86+ (p<0,05) e células B CD40+/CD80+/CD86+ (p<0,01/p<0,01/p<0,05) foi drasticamente reduzida. Enquanto no grupo AI, ocorreu um aumento na frequência de células B CD40+/CD80+ (p<0,001/p<0,05) tão logo a imunização com OVA, sem nenhuma alteração nas células CD11c+. Após infecção dos descendentes ou contato com SEA, todos os grupos infectados apresentaram supressão nas reações de hipersensibilidade imediatas anti-OVA (p<0,05), sendo mais intensa no grupo AI. Neste último, observou-se alta frequência de Tregs (p<0,05). Foi observada alta produção de IL-4 e IL-10 e baixos níveis de IFN- nos grupos infectados em comparação ao controle sem infecção (p<0,05). Não foram observadas diferenças na produção de IgG1 e IgG2a anti-OVA entre os grupos. Então, a prévia amamentação em mães esquistossomóticas resulta em melhor apresentação antigênica pelas células B nos descendentes adultos, enquanto a gestação prejudica. As infecções pós-natais restauram a imunidade humoral anti-OVA, em descendentes nascidos ou amamentados em mães infectadas, e induzem um potencial imunossupressor nos camundongos previamente amamentados em mães infectadas.