Immunotoxins (ITs), which consist of antibodies conjugated to toxins, have been proposed as a treatment for cancer and chronic infections. To develop and improve the ITs, different toxins such as ricin, have been used, aiming for higher efficacy against target cells. The toxin pulchellin, isolated from the Abrus pulchellus plant, has similar structure and function as ricin. Here we have compared two plant toxins, recombinant A chains from ricin (RAC) and pulchellin (PAC) toxins, for their ability to kill HIV Env-expressing cells. Briefly, RAC and PAC were produced in E. coli, and chromatographically purified, then chemically conjugated to two different anti-HIV monoclonal antibodies (MAbs), anti-gp120 MAb 924 or anti-gp41 MAb 7B2. These conjugates were characterized biochemically by microcapillary electrophoresis and BCA assay and immunologically by a variety of ELISA tests. We performed a side-by-side comparison of their ability to bind, enter and kill HIV infected cells (H9/NL4-3) or Env-transfected 293T cells, as well as their non-specific toxicity on uninfected or non-transfected parental cells. Cell binding and internalization were studied by flow cytometry and confocal microscopy. Results showed that PAC can function within an effective IT. The ITs demonstrated specific binding against native antigens on persistently HIV-infected cells and recombinant antigens on Env-transfected cells. An irrelevant antibody conjugated to either RAC or PAC had no effect. PAC cytotoxicity appears somewhat less than RAC, the standard for comparison. This is the first report that PAC may have utility for the design and construction of therapeutic ITs, highlighting the potential role for specific cell targeting not only for AIDS also for cancer therapy. / As toxinas imunológicas (TIs), que consistem em anticorpos conjugados com toxinas, foram propostas como tratamento para câncer e infecções crônicas. Para desenvolver e melhorar as TI, diferentes toxinas, como a ricina, foram usadas, visando uma maior eficácia contra células alvo. A toxina pulchellina, isolada da planta de Abrus Pulchellus, tem estrutura e função semelhantes à da ricina. Aqui, comparamos duas toxinas de plantas, cadeias A recombinantes de toxinas de ricina (RAC) e pulchellina (PAC), por sua capacidade de matar células que expressam HIV. Resumidamente, RAC e PAC foram produzidos em E. coli e purificados por cromatografia, depois conjugados quimicamente com dois anticorpos monoclonais anti corpo-HIV diferentes (MAcs), MAc 924 anti-gp120 ou MAc 7B2 anti-gp41. Estes conjugados foram caracterizados bioquimicamente por eletroforese microcapilar e teste BCA e imunologicamente por uma variedade de testes ELISA. Realizamos uma comparação lado-a-lado de sua capacidade de ligar, entrar e matar células infectadas pelo HIV (H9 / NL4-3) ou células 293T transfectadas com Env, bem como a sua toxicidade não específica em parentes não infectados ou não transfectados Células. A ligação celular e a internalização foram estudadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os resultados mostraram que PAC pode funcionar dentro de uma TI efetiva. As TI demonstraram ligação específica contra antígenos nativos em células persistentemente infectadas pelo HIV e antígenos recombinantes em células transfectadas com Env. Um anticorpo irrelevante conjugado com RAC ou PAC não teve efeito. A citotoxicidade de PAC aparece um pouco menor que o RAC, o padrão de comparação. Este é o primeiro relatório que o PAC pode ter utilidade para o projeto e a construção de TI terapêuticas, destacando o papel potencial para o direcionamento celular específico, não apenas para a AIDS, também para a terapia do câncer.

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.

INTRODUÇÃO: A Região Metropolitana de São Paulo é a mais populosa do Brasil. A grande frota veicular contribui para uma maior concentração de poluentes atmosféricos. Diversos poluentes podem interferir na fertilidade humana, alterando os principais parâmetros seminais. Este estudo teve como objetivo avaliar a influência dos níveis atuais de poluição atmosférica de origem veicular nos parâmetros seminais em controladores de tráfego. MÉTODOS: Foram realizadas anamnese e avaliação clínica urológica (volume testicular, presença de varicocele, criptorquidia, má formações) em 62 controladores de tráfego da CET (grupo exposto) e 210 homens comprovadamente férteis do grupo de pré-vasectomia do ambulatório da urologia do HC-FMUSP (grupo controle). Os parâmetros seminais avaliados foram concentração, motilidade (quantitativa e qualitativa), morfologia pelos critérios da OMS e critério estrito de Kruger, teste para detecção de leucócitos e testes de função espermática, CK, ROS e anticorpo anti-espermatozóide. Parâmetros hormonais também foram avaliados. Avaliação de exposição à poluição foi realizada através da dispersão de poluentes registrado pela Cetesb, gerada pelo software SURFER 8.0. RESULTADOS: Os controladores de tráfego apresentaram volume testicular maior em relação ao grupo pré-vasectomia (p<0,001). Quanto aos níveis de Estradiol (p=0,119), LH (p=0,644), FSH (p=0,140) e Testosterona total (p=0,365), ambos os grupos apresentaram valores dentro da normalidade. A concentração espermática apresentou-se homogênea nos grupos (p= 0,395); os controladores de tráfego apresentaram média de 124,9 x 106/ml e os pré-vasectomia 110,1 x 106/ml. Os controladores de tráfego apresentaram motilidade quantitativa (total) reduzida (60%) em relação aos prévasectomia (65%) (p= 0,047). A motilidade qualitativa (progressiva) também se apresentou diminuída no grupo exposto (p<0,001). As morfologias espermáticas tanto pelo critério da OMS (grupo exposto = 12%; grupo controle = 20%), quanto pelo critério estrito de Kruger (grupo exposto = 3%; grupo controle = 6%) estavam significativamente diminuídas no grupo exposto em relação ao controle (p<0,001). O marcador de maturidade Creatina Quinase apresentou-se dentro da normalidade em ambos os grupos, porém maior no grupo controle (p<0,001). Anticorpos anti-espermatozóides estavam elevados nos dois grupos, porém não foi significativo (p=0,382). Radicais livres de oxigênio apresentaram-se em altas concentrações nos dois grupos, porém não foi significativo (p=0,141). CONCLUSÕES: A análise dos dados obtidos nessa pesquisa sugere que a poluição atmosférica exerce uma influência negativa sobre os parâmetros seminais motilidade e morfologia. Causa elevação dos níveis de ROS em todos os indivíduos, indicando perda da função espermática. Ainda demonstrou-se a elevação em todos os indivíduos dos níveis de anticorpos anti-espermatozóides, sugerindo que os poluentes teriam transposto a barreira hemato-testicular. O volume testicular do grupo exposto à poluição veicular apresentar-se maior em relação ao volume testicular do grupo controle nos leva a supor que isto se deva a uma reação inflamatória aos agentes poluidores. Apesar da diferença significativa na concentração de poluentes entre os grupos, uma correlação direta com parâmetros seminais não pôde ser demonstrada / Metropolitan Region of Sao Paulo is the most populous of Brazil. The huge number of vehicles contributes for a higher concentration of air pollutants. Various pollutants can interfere in human fertility, altering the main seminal parameters. The aim of this study was to evaluate the influence of air pollution of vehicular origin on seminal parameters of traffic controllers. Clinical history and urological evaluation (testicular volume, presence of varicocele, cryptorchidism, bad formations) were carried out in 62 traffic controllers (exposed group) and 210 proven fertile men from the pre-vasectomy group of urologic clinic at Hospital of Clinics University of Sao Paulo (control group). Seminal parameters evaluated were concentration, motility (quantitative and qualitative), morphology by WHO´s criteria and Kruger´s strict criteria, test for detection of leukocytes and tests of sperm function, CK, ROS and antisperm antibody. Hormonal parameters also were evaluated. Exposition to air pollution was analyzed through the dispersion of pollutants recorded by Cetesb, generated in the software SURFER 8.0. Traffic controllers presented bigger testicular volume than prevasectomy group (p<0,001). Hormonal levels were at normal range in both groups; Estradiol (p=0,119), LH (p=0,644), FSH (p=0,140) and Total Testosterone (p=0,365). Sperm concentration was homogeneous in both groups (p= 0,395); traffic controllers presented mean of 124.9x106/ml and pre vasectomy group 110.1x106/ml. The exposed group presented quantitative (total) motility (60%) diminished than control group (65%) (p=0,047). The qualitative (progressive) motility was also diminished in the exposed group (p <0,001). The sperm morphologies as by WHO´s criteria (exposed group = 12%; control group = 20%), as by Kruger´s strict criteria (exposed group = 3%; control group = 6%) were significantly diminished in the exposed group (p<0,001). The sperm maturity marker Creatine Kinase was at normal range at both groups, but higher in the control one (p<0,001). Antisperm antibodies was elevated in both groups, however it was not significant (p=0,382). ROS presented higher concentrations in both groups, however it was not significant (p=0,141). The facts presented in this study suggest that air pollution exercises negative effects on the seminal parameters motility and morphology. It causes elevation of ROS levels in all individuals, indicating loss of sperm function. It also showed, elevation of antisperm antibodies levels, suggesting that pollutants would have transposed the blood-testis barrier. The testicular volume in the exposed group was higher than the testicular volume of the control group; we can suppose that it must occur due to an inflammatory reaction against the polluting agents. Although the significant difference in pollutants concentrations between groups, no direct correlation to seminal parameters could be demonstrated

Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-&#946;2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a &#946;2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de &#946;2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / &#946;2-glycoprotein I (&#946;2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The &#946;2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-&#946;2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the &#946;2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for &#946;2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

Linfomas são cânceres que se iniciam a partir da transformação maligna de um linfócito no sistema linfático. Os linfomas são divididos em duas categorias principais: os linfomas de Hodgkin e todos os outros linfomas, denominados linfomas não-Hodgkin (LNH). Os pacientes com LNH são comumente tratados com radioterapia apenas ou combinada com quimioterapia utilizando-se de anticorpo monoclonal anti-CD20, principalmente o rituximab (MabThera&reg). O uso de anticorpos monoclonais (Acm) conjugados à quelantes bifuncionais radiomarcados com radionuclídeos metálicos ou lantanídeos é uma realidade de tratamento para portadores de LNH pelo princípio de radioimunoterapia (RIT). Este estudo concentrou-se nas condições de conjugação do anticorpo monoclonal rituximab (MabThera&reg) com grupamentos quelantes bifuncionais DOTA e DTPA. Na marcação dos Acm conjugados com lutécio-177, foram estudadas as condições de pré-purificação do Acm, condições de conjugação, determinação de número de quelantes acoplados à molécula do anticorpo, purificação do anticorpo conjugado, radiomarcação do anticorpo conjugado, com lutécio-177, purificação do anticorpo marcado, a ligação específica in vitro dos compostos marcados às células Raji, e distribuição biológica em camundongos BALB/c sadios. As três metodologias empregadas na pré-purificação do anticorpo (diálise, cromatografia de exclusão molecular com coluna Sephadex G-50 e ultrafiltração) demonstram-se eficientes e proporcionaram recuperação da amostra superior a 90%. A metodologia de ultrafiltração foi considerada a mais simples e prática, podendo ser aplicada a procedimentos rotineiros de produção de radiofármacos. Além disso, proporcionou a recuperação final de amostra de 97% em microlitros. Nas conjugações do anticorpo com os quelantes DOTA e DTPA em razões molares diferentes do Acm:quelante, observou-se número de grupamentos quelantes acoplados à molécula do Acm proporcional à razão molar estudada. Quando foi avaliada a influência de condições diferentes de conjugação no número de quelantes acoplados à molécula do Acm, não foram observadas diferenças significativas, com resultados de pureza radioquímica (PR) inferior a 80% em todas as condições estudadas. Na comparação de métodos de purificação do Acm conjugado, a abordagem inédita apresentada neste estudo, na qual a cromatografia de exclusão molecular foi combinada com a ultrafiltração resultou em maior eficiência na purificação e preservação da estrutura do anticorpo. Nos estudos de radiomarcação do anticorpo conjugado com DOTA e DTPA, os imunoconjugados de DTPA apresentaram, de forma geral, maior eficiência de marcação com resultados reprodutíveis quando comparados com os imunoconjugados de DOTA, considerando-se as diferentes razões molares utilizadas. As metodologias cromatográficas empregadas no controle de pureza radioquímica do composto radiomarcado proporcionaram a discriminação das diferentes espécies radioquímicas no meio de marcação. A metodologia de purificação do composto conjugado e radiomarcado utilizada proporcionou a obtenção de compostos com alta pureza radioquímica, 97,4&plusmn;1,3% (DOTA 1:50) e 98,7&plusmn;0,2% (DTPA 1:50). Nos estudos de ligação específica às células tumorais Raji, o anticorpo conjugado com quelante DTPA nas razões molares de 1:50 e 1:20 apresentaram perfil semelhante de ligação, com aumento da porcentagem de ligação específica proporcional à concentração celular, enquanto que o imunoconjugado na razão molar de 1:10 apresentou alta porcentagem de ligação não específica. Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição in vivo do anticorpo conjugado e radiomarcado nem sempre se mostraram compatíveis com a biodistribuição de anticorpos radiomarcados íntegros. No caso do quelante DOTA, o imunoconjugado obtido a partir da razão molar 1:20, apresentou melhores características de biodistribuição. No caso do quelante DTPA, a razão molar utilizada pareceu refletir diretamente no clareamento sanguíneo do anticorpo e todas as razões molares utilizadas apresentaram instabilidade in vivo. / Lymphomas are malignancies or cancers that start from the malign transformation of a lymphocyte in the lymphatic system. Lymphomas are divided in two major categories: Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patient with NHL are generally treated with radiotherapy alone or combined with immunotherapy using monoclonal antibody rituximab (MabThera&reg). Currently, monoclonal antibodies (Mab) conjugated with bifunctional chelate agents and radiolabeled with metallic or lanthanides radionuclides are a treatment reality for patients with NHL by the principle of radioimmunotherapy (RIT). This study focused on the conditions of conjugation of Acm rituximab (MabThera&reg) with bifunctional chelating agents DOTA and DTPA and labeling with 177-luthetium. Various parameters were studied: method of Acm purification, conditions of Acm conjugation and the determination of the number of chelate coupled to the Acm, the purification of the conjugated Mab, labeling conditions with lutetium-177, purification of the radiolabeled immunoconjugate, radiochemical purity (RP), in vitro specific binding determination to Raji cells (Human Burkitt) and biological distribution performed in normal BALB/c mouse. The three methodologies employed in pre-purification of Acm (dialysis, size exclusion chromatograph and ultrafiltration) demonstrated to be efficient; they provided sample recovery exceeding 90%. However, the methodology of ultrafiltration resulted in greater sample recovery and in microliters. The number of chelate attached to the Mab molecule was proportional to the molar ratio studied. When the influence of different conditions of conjugation in the number of chelate bounded to the Mab was studied, no notable differences were observed. The RP < 80% was observed in all the methods applied. Purification of the conjugated antibody by different methods showed that the innovative combination of Sephadex and ultrafiltration methods resulted in higher efficiency of purification. The optimized conditions for purification of the conjugated antibody preserved the protein integrity. Radiolabelling studies of DOTA and DTPA immunoconjugated showed that DTPA derivatives presented, in general, radiochemical yield superior than DOTA conjugated Mab, considering the different molar ratios studied. The chromatographic methods employed in the RP determination were efficient to separate the different radiochemical species presented in the reaction medium. The methodology used in the purification of the labeled Mab resulted in labeled compounds with high radiochemical purity, 97.4&plusmn;1.3% (DOTA 1:50) and 98.7&plusmn;0.2% (DTPA 1:50). Considering specific cell binding assays (Raji cells), the Mab conjugated to DTPA at 1:50 and 1:20 molar ratios presented similar results, and the percent of cell binding were proportional to the cell concentration, whereas the cell binding for 1:10 molar ratio showed high percent of nonspecific cell binding. The results of in vivo biodistribution studies of labeled Mab not always were compatible with the biodistribution of intact radiolabelled antibody. The DOTA immunoconjugated produced at 1:20 molar ratio, showed better performance in biodistribution studies. In the case of DTPA immunoconjugated, the blood clearance seems to be influenced by the molar ratio applied and the immunoconjugated produced with DTPA chelate at different molar ratio resulted in high in vivo instability compounds.

Objetivo: Avaliar a função testicular em pacientes do sexo masculino com espondilite anquilosante (EA). Métodos: Vinte pacientes com EA e vinte e quatro adultos masculinos saudáveis foram avaliados quanto às características demográficas, exame urológico, ultrassonografia testicular, avaliações dos espermatozóides, anticorpo anti-espermatozóide e perfil hormonal. Critérios de seleção foram: período de pelo menos 3 meses sem o uso de sulfasalazina e metotrexato e nunca terem usado agentes biológicos ou imunossupressores. As avaliações da EA incluíram investigações clínica e laboratorial. Resultados: A mediana da idade atual foi similar no grupo controle e EA (p=0,175). A freqüência de varicocele foi significantemente maior nos pacientes com EA em comparação com os controles (40% vs 8%, p=0,027). A mediana das formas normais de espermatozóides foi similar em pacientes com EA versus controles [17,25 (2-32,5) vs. 22,5 (1,5-45)%, p=0,215], assim como os outros parâmetros dos espermatozóides (p>0,05). Em contraste, a mediana das formas normais de espermatozóides foi significantemente menor em pacientes com EA com varicocele versus aqueles sem varicocele [13,5 (2-27) vs. 22 (10-32,5)%, p=0,049]. Reforçando esse achado, não foi observada nenhuma diferença nesse parâmetro comparando pacientes com EA e controles sem varicocele (p=0,670). Além disso, outros fatores relevantes para a disfunção testicular (anticorpo anti-espermatozóide, hormônios, marcadores inflamatórios e escores da EA) foram comparáveis em pacientes com e sem varicocele (p>0,05). Conclusão: Nós identificamos uma freqüência alta de varicocele em pacientes com EA associada a anormalidades espermáticas, contudo sem associação com tratamento, anticorpos anti-espermatozóides, alterações hormonais ou parâmetros da doença. A exclusão desses fatores sugere que a varicocele pode ser a responsável pela disfunção testicular em pacientes com EA e não o processo da doença ou a autoimunidade. Investigação da varicocele deve ser sempre realizada em pacientes com EA e problemas de fertilidade / Objective: To assess reproductive function in male ankylosing spondylitis (AS) patients in comparison to healthy controls. Methods: 20 AS patients were compared to 24 male healthy subjects in regard to demographic data, urologic examination, testicular ultrasound (US), semen analysis, anti-sperm antibodies and hormone profile. Exclusion criteria were present use of sulfasalazine or methotrexate, and ever use of biological/cytotoxic agents. Disease activity of AS was evaluated by clinical and laboratory assessments. Results: Demographic data were similar in AS and controls (p=0.175). Varicocele was significantly more frequently found in AS patients than in controls (40% vs. 8%, p=0.027). Semen analysis revealed no significant differences in sperm quality between AS patients and controls (p>0.05). In contrast, the median of normal sperm forms was significantly lower in AS patients with versus those without varicocele [13.5 (2-27) vs. 22 (10-32.5) %, p=0.049] whereas no difference in sperm morphology was observed comparing AS patients and controls without varicocele (p=0.670). Comparison of AS patients with and without varicocele showed that anti-sperm antibodies, hormones, inflammatory markers and disease activity scores did not contribute to the impaired sperm morphology observed in AS patients with varicocele. Conclusion: An increased frequency of varicocele was found in AS patients associated with sperm abnormalities, but independent of therapy, anti-sperm antibodies, hormonal alterations or disease parameters. The exclusion of these factors suggests that varicocele may underlie testicular dysfunction in AS patients and not the disease process or autoimmunity. Investigation for varicocele should be done in AS patients with fertility problems

Immunotoxins (ITs), which consist of antibodies conjugated to toxins, have been proposed as a treatment for cancer and chronic infections. To develop and improve the ITs, different toxins such as ricin, have been used, aiming for higher efficacy against target cells. The toxin pulchellin, isolated from the Abrus pulchellus plant, has similar structure and function as ricin. Here we have compared two plant toxins, recombinant A chains from ricin (RAC) and pulchellin (PAC) toxins, for their ability to kill HIV Env-expressing cells. Briefly, RAC and PAC were produced in E. coli, and chromatographically purified, then chemically conjugated to two different anti-HIV monoclonal antibodies (MAbs), anti-gp120 MAb 924 or anti-gp41 MAb 7B2. These conjugates were characterized biochemically by microcapillary electrophoresis and BCA assay and immunologically by a variety of ELISA tests. We performed a side-by-side comparison of their ability to bind, enter and kill HIV infected cells (H9/NL4-3) or Env-transfected 293T cells, as well as their non-specific toxicity on uninfected or non-transfected parental cells. Cell binding and internalization were studied by flow cytometry and confocal microscopy. Results showed that PAC can function within an effective IT. The ITs demonstrated specific binding against native antigens on persistently HIV-infected cells and recombinant antigens on Env-transfected cells. An irrelevant antibody conjugated to either RAC or PAC had no effect. PAC cytotoxicity appears somewhat less than RAC, the standard for comparison. This is the first report that PAC may have utility for the design and construction of therapeutic ITs, highlighting the potential role for specific cell targeting not only for AIDS also for cancer therapy. / As toxinas imunológicas (TIs), que consistem em anticorpos conjugados com toxinas, foram propostas como tratamento para câncer e infecções crônicas. Para desenvolver e melhorar as TI, diferentes toxinas, como a ricina, foram usadas, visando uma maior eficácia contra células alvo. A toxina pulchellina, isolada da planta de Abrus Pulchellus, tem estrutura e função semelhantes à da ricina. Aqui, comparamos duas toxinas de plantas, cadeias A recombinantes de toxinas de ricina (RAC) e pulchellina (PAC), por sua capacidade de matar células que expressam HIV. Resumidamente, RAC e PAC foram produzidos em E. coli e purificados por cromatografia, depois conjugados quimicamente com dois anticorpos monoclonais anti corpo-HIV diferentes (MAcs), MAc 924 anti-gp120 ou MAc 7B2 anti-gp41. Estes conjugados foram caracterizados bioquimicamente por eletroforese microcapilar e teste BCA e imunologicamente por uma variedade de testes ELISA. Realizamos uma comparação lado-a-lado de sua capacidade de ligar, entrar e matar células infectadas pelo HIV (H9 / NL4-3) ou células 293T transfectadas com Env, bem como a sua toxicidade não específica em parentes não infectados ou não transfectados Células. A ligação celular e a internalização foram estudadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os resultados mostraram que PAC pode funcionar dentro de uma TI efetiva. As TI demonstraram ligação específica contra antígenos nativos em células persistentemente infectadas pelo HIV e antígenos recombinantes em células transfectadas com Env. Um anticorpo irrelevante conjugado com RAC ou PAC não teve efeito. A citotoxicidade de PAC aparece um pouco menor que o RAC, o padrão de comparação. Este é o primeiro relatório que o PAC pode ter utilidade para o projeto e a construção de TI terapêuticas, destacando o papel potencial para o direcionamento celular específico, não apenas para a AIDS, também para a terapia do câncer.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

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Diversos aspectos associados com a atividade do LES, especialmente a doença renal presente em importante proporção dos pacientes, têm sido objeto de intensa investigação. Entre estes, a participação de autoanticorpos e a contribuição de componentes bioativos como citocinas e hormônios na nefrite lúpica ocupam posição de destaque. Objetivo: No presente estudo foi investigada a participação dos anticorpos anti-dsDNA totais e de alta avidez, antinucleossomo (ANuA) e hiperprolactinemia na atividade do LES e nas suas manifestações clínicas com destaque para Artropatia de Jaccoud, usando como população alvo mulheres lúpicas residentes na Bahia. Material e Métodos: Cento e quarenta e duas mulheres portadoras de LES foram investigadas para a prevalência e níveis de anticorpos anti-dsDNA totais, anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e ANuA, além de hiperprolactinemia. Adicionalmente, foram testadas as correlações dos níveis destes componentes com a atividade da doença e suas associações com as manifestações clínicas mais prevalentes nestas pacientes. Autoanticorpos antinucleares foram determinados por testes de imunofluorescência indireta e ELISA. Níveis séricos de prolactina e citocinas foram determinados por imunoensaios de captura de antígeno, enquanto os níveis de C3 e C4 foram determinados por imunonefelometria. Os níveis de creatinina e proteinúria foram medidos por métodos colorimétricos e a atividade lúpica avaliada com o protocolo SLEDAI-2K. Testes de estatística univariada foram usados nas análises dos resultados. Resultados: Os níveis de anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e de anti-dsDNA totais se correlacionaram diretamente com os níveis de anticorpos antinucleossomo, sendo esta correlação mais forte com os primeiros. Correlações significativas entre os níveis de C3, C4, VHS, proteinúria e SLEDAI foram observadas com os níveis de anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e, exceto proteinúria, com os níveis de ANuA. Os níveis de anticorpos anti-dsDNA totais se correlacionaram apenas com os níveis de C3 e SLEDAI, porém de forma menos significativa que os anticorpos anti-dsDNA de alta avidez e ANuA. Pacientes com artropatia de Jaccoud apresentaram níveis mais altos de anticorpos antidsDNA totais e IL-6. Hiperprolactinemia leve a moderada foi encontrada em 19,7% das pacientes, observando-se níveis séricos de prolactina mais altos nas pacientes com comprometimento renal, além de existir correlação entre os níveis séricos deste hormônio com os níveis de creatinina sérica e proteinúria. Adicionalmente, existiu uma aparente supressão da produção de anticorpos anti-RNP- 70 em pacientes lúpicas hiperprolactinêmicas com fenômeno de Raynaud. Conclusões: Anticorpos anti-dsDNA constituem-se em importantes biomarcadores de doença ativa em pacientes portadoras de LES residentes na Bahia, podendo complementar o diagnóstico da artropatia de Jaccoud nestas pacientes, além de sugerir a presença de comprometimento renal quando são de alta avidez e detectados conjuntamente com proteinúria e baixos níveis de C3. Por outro lado, a presença de uma hiperprolactinemia leve a moderada pode ser verificada nestas mulheres, cujo envolvimento na doença renal lúpica foi demonstrado neste estudo, além de inibir a produção de anticorpos anti- RNP-70. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune rheumatic disease that affect one in 1,700 Brazilian women. This disease is associated with a genetic predisposition of the patients and has the contribution of hormonal and environmental factors. Lupus' patients have a loss of immune tolerance, resulting in uncontrolled autoimmune reactivity and complex and multivariate clinical manifestations. Various aspects associated with the activity of SLE, especially kidney disease, have been the subject of intense investigation. Among these, the participation of autoantibodies and the contribution of bioactive components such as cytokines and hormones occupy a prominent position in these studies. Objective: The present study investigated in SLE women who lived in Bahia (Brazil), the participation of total and high avidity dsDNA, antinucleosome antibodies (ANuA) and hyperprolactinemia in the activity of this disease and its clinical manifestations, especially arthropathy of Jaccoud. Material and Methods: One hundred and forty-two women with SLE were investigated for the presence of hyperprolactinemia and prevalence and levels of total and high avidity anti-dsDNA antibodies and ANuA. Correlations among these components with biomarkers of lupus activity and their associations with the most prevalent clinical manifestations in the patients were also tested. Indirect fluorescent antibody test and ELISA determined antinuclear autoantibodies. Capture immunoassays measured prolactin and cytokine levels while C3 and C4 levels were determined by immunonephelometric tests. Creatinine levels and proteinuria were measured by colorimetric methods and lupus activity assessed with the SLEDAI-2K protocol. Descriptive statistical tests were used in the analyses of the results. Results: The levels of both high avidity and total anti-ds DNA antibodies correlated directly with the levels of antinucleosome antibodies, but this correlation was stronger with dsDNA antibodies of high avidity. Significant correlations among the levels of C3, C4, ESR, proteinuria and SLEDAI were observed with the levels of anti-dsDNA antibodies of high avidity and, except proteinuria, with ANuA levels. The levels of total anti-dsDNA antibodies correlated only with levels of C3 and SLEDAI, but these correlations were lesser than those of high avidity dsDNA antibodies and ANuA. Patients with Jaccoud arthropathy presented higher levels of dsDNA antibodies and IL-6, whereas mild to moderate hyperprolactinemia was found in 19.7% of the lupus patients. Higher serum levels of prolactin were demonstrated in patients with kidney disease, as well as there was a correlation between the levels of this hormone with their serum levels of creatinine and urine protein. In addition, hyperprolactinemia seems to inhibit the production of anti-RNP-70 autoantibodies. CONCLUSIONS: Antibodies to dsDNA are important biomarkers of active disease in SLE patients from Bahia and the increase in dsDNA antibody levels can complement the diagnosis of Jaccoud’s arthropathy. In addition, high avidity dsDNA autoantibodies are a good laboratory evidence of renal impairment in lupus patients when they are detected together with proteinuria and low levels of C3. On the other hand, the presence of a mild to moderate hyperprolactinaemia can be seen in lupus women whose involvement in lupus kidney disease and inhibition of the production of RNP-70 autoantibodies was demonstrated in this study.