Linfomas são cânceres que se iniciam a partir da transformação maligna de um linfócito no sistema linfático. Os linfomas são divididos em duas categorias principais: os linfomas de Hodgkin e todos os outros linfomas, denominados linfomas não-Hodgkin (LNH). Os pacientes com LNH são comumente tratados com radioterapia apenas ou combinada com quimioterapia utilizando-se de anticorpo monoclonal anti-CD20, principalmente o rituximab (MabThera&reg). O uso de anticorpos monoclonais (Acm) conjugados à quelantes bifuncionais radiomarcados com radionuclídeos metálicos ou lantanídeos é uma realidade de tratamento para portadores de LNH pelo princípio de radioimunoterapia (RIT). Este estudo concentrou-se nas condições de conjugação do anticorpo monoclonal rituximab (MabThera&reg) com grupamentos quelantes bifuncionais DOTA e DTPA. Na marcação dos Acm conjugados com lutécio-177, foram estudadas as condições de pré-purificação do Acm, condições de conjugação, determinação de número de quelantes acoplados à molécula do anticorpo, purificação do anticorpo conjugado, radiomarcação do anticorpo conjugado, com lutécio-177, purificação do anticorpo marcado, a ligação específica in vitro dos compostos marcados às células Raji, e distribuição biológica em camundongos BALB/c sadios. As três metodologias empregadas na pré-purificação do anticorpo (diálise, cromatografia de exclusão molecular com coluna Sephadex G-50 e ultrafiltração) demonstram-se eficientes e proporcionaram recuperação da amostra superior a 90%. A metodologia de ultrafiltração foi considerada a mais simples e prática, podendo ser aplicada a procedimentos rotineiros de produção de radiofármacos. Além disso, proporcionou a recuperação final de amostra de 97% em microlitros. Nas conjugações do anticorpo com os quelantes DOTA e DTPA em razões molares diferentes do Acm:quelante, observou-se número de grupamentos quelantes acoplados à molécula do Acm proporcional à razão molar estudada. Quando foi avaliada a influência de condições diferentes de conjugação no número de quelantes acoplados à molécula do Acm, não foram observadas diferenças significativas, com resultados de pureza radioquímica (PR) inferior a 80% em todas as condições estudadas. Na comparação de métodos de purificação do Acm conjugado, a abordagem inédita apresentada neste estudo, na qual a cromatografia de exclusão molecular foi combinada com a ultrafiltração resultou em maior eficiência na purificação e preservação da estrutura do anticorpo. Nos estudos de radiomarcação do anticorpo conjugado com DOTA e DTPA, os imunoconjugados de DTPA apresentaram, de forma geral, maior eficiência de marcação com resultados reprodutíveis quando comparados com os imunoconjugados de DOTA, considerando-se as diferentes razões molares utilizadas. As metodologias cromatográficas empregadas no controle de pureza radioquímica do composto radiomarcado proporcionaram a discriminação das diferentes espécies radioquímicas no meio de marcação. A metodologia de purificação do composto conjugado e radiomarcado utilizada proporcionou a obtenção de compostos com alta pureza radioquímica, 97,4&plusmn;1,3% (DOTA 1:50) e 98,7&plusmn;0,2% (DTPA 1:50). Nos estudos de ligação específica às células tumorais Raji, o anticorpo conjugado com quelante DTPA nas razões molares de 1:50 e 1:20 apresentaram perfil semelhante de ligação, com aumento da porcentagem de ligação específica proporcional à concentração celular, enquanto que o imunoconjugado na razão molar de 1:10 apresentou alta porcentagem de ligação não específica. Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição in vivo do anticorpo conjugado e radiomarcado nem sempre se mostraram compatíveis com a biodistribuição de anticorpos radiomarcados íntegros. No caso do quelante DOTA, o imunoconjugado obtido a partir da razão molar 1:20, apresentou melhores características de biodistribuição. No caso do quelante DTPA, a razão molar utilizada pareceu refletir diretamente no clareamento sanguíneo do anticorpo e todas as razões molares utilizadas apresentaram instabilidade in vivo. / Lymphomas are malignancies or cancers that start from the malign transformation of a lymphocyte in the lymphatic system. Lymphomas are divided in two major categories: Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patient with NHL are generally treated with radiotherapy alone or combined with immunotherapy using monoclonal antibody rituximab (MabThera&reg). Currently, monoclonal antibodies (Mab) conjugated with bifunctional chelate agents and radiolabeled with metallic or lanthanides radionuclides are a treatment reality for patients with NHL by the principle of radioimmunotherapy (RIT). This study focused on the conditions of conjugation of Acm rituximab (MabThera&reg) with bifunctional chelating agents DOTA and DTPA and labeling with 177-luthetium. Various parameters were studied: method of Acm purification, conditions of Acm conjugation and the determination of the number of chelate coupled to the Acm, the purification of the conjugated Mab, labeling conditions with lutetium-177, purification of the radiolabeled immunoconjugate, radiochemical purity (RP), in vitro specific binding determination to Raji cells (Human Burkitt) and biological distribution performed in normal BALB/c mouse. The three methodologies employed in pre-purification of Acm (dialysis, size exclusion chromatograph and ultrafiltration) demonstrated to be efficient; they provided sample recovery exceeding 90%. However, the methodology of ultrafiltration resulted in greater sample recovery and in microliters. The number of chelate attached to the Mab molecule was proportional to the molar ratio studied. When the influence of different conditions of conjugation in the number of chelate bounded to the Mab was studied, no notable differences were observed. The RP < 80% was observed in all the methods applied. Purification of the conjugated antibody by different methods showed that the innovative combination of Sephadex and ultrafiltration methods resulted in higher efficiency of purification. The optimized conditions for purification of the conjugated antibody preserved the protein integrity. Radiolabelling studies of DOTA and DTPA immunoconjugated showed that DTPA derivatives presented, in general, radiochemical yield superior than DOTA conjugated Mab, considering the different molar ratios studied. The chromatographic methods employed in the RP determination were efficient to separate the different radiochemical species presented in the reaction medium. The methodology used in the purification of the labeled Mab resulted in labeled compounds with high radiochemical purity, 97.4&plusmn;1.3% (DOTA 1:50) and 98.7&plusmn;0.2% (DTPA 1:50). Considering specific cell binding assays (Raji cells), the Mab conjugated to DTPA at 1:50 and 1:20 molar ratios presented similar results, and the percent of cell binding were proportional to the cell concentration, whereas the cell binding for 1:10 molar ratio showed high percent of nonspecific cell binding. The results of in vivo biodistribution studies of labeled Mab not always were compatible with the biodistribution of intact radiolabelled antibody. The DOTA immunoconjugated produced at 1:20 molar ratio, showed better performance in biodistribution studies. In the case of DTPA immunoconjugated, the blood clearance seems to be influenced by the molar ratio applied and the immunoconjugated produced with DTPA chelate at different molar ratio resulted in high in vivo instability compounds.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Resumo: Os animais silvestres, tanto os de vida livre como os de cativeiro, podem ser reservatórios e portadores de diversos protozoários, como os integrantes do gênero Trypanosoma. Trypanosoma cruzi é um dos mais conhecidos tripanosomas, agente etiológico da doença de Chagas. Manifesta-se clinicamente com um caráter multifacetado, afetando humanos e várias espécies de animais domésticos e silvestres, como os primatas não humanos, que podem constituir-se em reservatórios do parasito. Em relação aos primatas neotropicais, ocorrem diferentes infecções por tripanosomas que também acometem humanos. No presente estudo, foram coletadas amostras de sangue de 39 primatas não humanos procedentes do Parque Zoológico Municipal de Bauru para pesquisa sorológica anti-T. cruzi e molecular de T. cruzi utilizando-se primers da região de kDNA de T. cruzi (TCZ1 e TCZ2) e da região codificadora da proteína de choque térmico (hsp70). Todos os animais foram negativos ao teste sorológico anti-T. cruzi e molecular para T. cruzi com os primers da região de kDNA. Porém, com a utilização de primers para hsp70, 11 dos 39 (28,2%) animais foram positivos. Os resultados do sequenciamento apresentaram similaridade para protozoários do gênero Trypanosoma. Apesar das dificuldades em se chegar à espécie circulante de tripanosoma entre os primatas, conclui-se que vetores triatomíneos e/ou moscas hematófagas podem estar circulando no ambiente dos animais e que ações de vigilância e busca dos mesmos são altamente recome... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Wild animals, both free-living and the captive ones, can be reservoirs and carriers of various protozoa, such as members of the genus Trypanosoma. Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, is one of the most known trypanosomes. Chagas disease is manifested clinically with a multifaceted character, affecting humans and several species of wild and domestic animals, such as non-human primates, which can be reservoirs of this parasite. Regarding the Neo-tropical primates, different infections occur by trypanosomes that also can affect humans. In this study, 39 blood samples were collected from nonhuman primates from Zoo Park Municipal of Bauru, São Paulo, Brazil, by serological and molecular analysis for T. cruzi infection using specific primers for kDNA region (TCZ1 and TCZ2) and the region encoding the heat shock protein (hsp70). All animals were negative to the serological test for anti-T. cruzi and molecular for T. cruzi with primers for kDNA region. However, with the use of primers for hsp70, 11 of 39 (28.2%) animals were positive. The sequencing results showed similarity to the genus Trypanosoma. Despite the difficulties in stablish the species of trypanosome among these primates, it is concluded that triatomine vectors and/or bloodsucking flies may be present in the animal environment; so, the entomologic vigilance for these insects are highly recommended. / Mestre

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Resumo: A família Trypanosomatidae inclui agentes etiológicos responsáveis por ocasionar doenças em humanos e demais animais, englobando dezenas de protozoários pertencentes a diferentes gêneros, destacando-se os protozoários representantes dos gêneros Leishmania, causadores das leishmanioses e Trypanosoma, causador de tripanosomíase. Enquanto a transmissão das leishmanioses ocorre devido à picada de insetos fêmeas de flebotomíneos pertencentes ao gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo, a transmissão da tripanossomíase depende da espécie de tripanosoma envolvida na infecção, podendo ocorrer pela picada de insetos adultos do gênero Glossina; pelas fezes de triatomíneos, sobretudo do gênero Triatoma e mecanicamente por moscas hematófagas, principalmente do gênero Stomoxys. Além dos humanos, animais domésticos e silvestres podem atuar como reservatórios de tripanosomatídeos, incluindo os primatas não humanos, os quais estão associados com o ciclo enzoótico das leishmanioses e tripanosomíase, sendo que a infecção natural por protozoários do gênero Trypanosoma e Leishmania em mamíferos selvagens é comum na natureza. O objetivo do trabalho foi pesquisar tripanosomatídeos em primatas de cativeiro procedentes do Parque Zoológico Municipal de Bauru - SP por meio de anticorpos contra o parasito e pela amplificação do DNA do protozoário. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue de 39 primatas. A técnica molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi aplicada na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The family Trypanosomatidae includes etiological agents responsible for causing diseases in humans and other animals. There are dozens of protozoa belonging to different genres, especially protozoa representatives of Leishmania genre, which causes leishmaniasis and Trypanosoma, responsible for trypanosomiasis. While the transmission of leishmaniasis is due to the bites of female sand flies belonging to the genus Phlebotomus in the Old World and Lutzomyia in the New World, the transmission of trypanosomiasis depends on the species of trypanosome involved in the infection. It may occurs by the bite of adult insects of the genus Glossina or by the feces of insects, especially by the genre Triatoma and mechanically by bloodsucking flies, especially the Stomoxys genre. In addition to humans, domestic and wild animals can act as trypanosomatids reservoirs, including non-human primates, which are associated with the enzootic cycle of leishmaniasis and trypanosomiasis; the natural infection by Trypanosoma and Leishmania protozoa in wild mammals is common in nature. The aim of the study was to investigate trypanosomatids in captive primates coming from Municipal Zoological Park of Bauru by antibodies against the parasite and the amplification of the DNA of the parasite. For this, blood samples were collected from 39 primates. The molecular technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied in research for Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania infantum us... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-19T14:08:54Z No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1235721 bytes, checksum: fa10ebf32171212966df2a23383f5075 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T14:08:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilia Maria de Souza Leao e Silva.pdf: 1235721 bytes, checksum: fa10ebf32171212966df2a23383f5075 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Glanders is a highly contagious disease caused by Burkholderia mallei solipeds, a Gram - negative bacterium, not motility and aerobic coccobacillus, primarily infecting horses, donkeys and mules, though humans are considered accidental hosts . The Burkholderia mallei is listed in the list of the World Organisation for Animal Health (OIE) as an important public health disease, and due to its high potential for infection is referred to as a bioterrorism agent. According to the OIE comprises the serological diagnosis, allergy testing and bacterial isolation, and complement fixation, the official test to be performed for trade of animals. This method of diagnosis is recommended in Brazil by Normative Instruction Nº 24 Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply by its high sensitivity and specificity. Serological qPCR showed 76 (16.7%) positivity and a sensitivity of 24.7% and a specificity of 89 % when compared to the gold standard western blotting used. The results show that the use of the qPCR may be used as a complementary technique to other methods for rapid and accurate identification of Burkholderia mallei. About statistical results showed that the ELISAi showed the highest sensitivity (35.5%) and specificity (97.6 %) when compared to western blotting. The results show the importance of preparation and use of antigens that are produced with local strains, resulting in higher sensitivity and specificity of the test. / O Mormo constitui-se em uma doença altamente contagiosa dos solípedes causada pela Burkholderia mallei, uma bactéria Gram-negativa, não móvel e cocobacilo aeróbio, infectando primariamente cavalos, burros e mulas, entretanto humanos são considerados hospedeiros acidentais. A Burkholderia mallei está relacionada na lista de doenças da Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE) como doença de importância de saúde pública, e devido ao seu alto potencial de infecção é referenciada como agente de bioterrorismo. De acordo com a OIE o diagnóstico compreende o teste sorológico, alérgico e o isolamento bacteriano, sendo a fixação do complemento, o teste oficial a ser realizado para trânsito de animais. Este método de diagnóstico está preconizado no Brasil pela Instrução Normativa Nº 24 do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento por apresentar alta sensibilidade e especificidade. A qPCR sorológica apresentou 76 (16,7%) positividade e uma sensibilidade de 24,7% e especifidade de 89% quando comparado ao western blotting padrão ouro utilizado.. Os resultados mostram que a utilização da qPCR pode ser utilizada como técnica complementar de outras metodologias para identificação rápida e precisa da Burkholderia mallei. Em relação aos testes sorológicos, os resultados estatísticos mostraram que o ELISAi apresentou a maior sensibilidade (35,5%) e especificidade (97,6%) quando comparado ao western blotting. Os resultados mostram a necessidade da preparação e utilização de antígenos que sejam produzidos com cepas locais, determinando maior sensibilidade e especificidade ao teste.

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

INTRODUÇÃO: A Região Metropolitana de São Paulo é a mais populosa do Brasil. A grande frota veicular contribui para uma maior concentração de poluentes atmosféricos. Diversos poluentes podem interferir na fertilidade humana, alterando os principais parâmetros seminais. Este estudo teve como objetivo avaliar a influência dos níveis atuais de poluição atmosférica de origem veicular nos parâmetros seminais em controladores de tráfego. MÉTODOS: Foram realizadas anamnese e avaliação clínica urológica (volume testicular, presença de varicocele, criptorquidia, má formações) em 62 controladores de tráfego da CET (grupo exposto) e 210 homens comprovadamente férteis do grupo de pré-vasectomia do ambulatório da urologia do HC-FMUSP (grupo controle). Os parâmetros seminais avaliados foram concentração, motilidade (quantitativa e qualitativa), morfologia pelos critérios da OMS e critério estrito de Kruger, teste para detecção de leucócitos e testes de função espermática, CK, ROS e anticorpo anti-espermatozóide. Parâmetros hormonais também foram avaliados. Avaliação de exposição à poluição foi realizada através da dispersão de poluentes registrado pela Cetesb, gerada pelo software SURFER 8.0. RESULTADOS: Os controladores de tráfego apresentaram volume testicular maior em relação ao grupo pré-vasectomia (p<0,001). Quanto aos níveis de Estradiol (p=0,119), LH (p=0,644), FSH (p=0,140) e Testosterona total (p=0,365), ambos os grupos apresentaram valores dentro da normalidade. A concentração espermática apresentou-se homogênea nos grupos (p= 0,395); os controladores de tráfego apresentaram média de 124,9 x 106/ml e os pré-vasectomia 110,1 x 106/ml. Os controladores de tráfego apresentaram motilidade quantitativa (total) reduzida (60%) em relação aos prévasectomia (65%) (p= 0,047). A motilidade qualitativa (progressiva) também se apresentou diminuída no grupo exposto (p<0,001). As morfologias espermáticas tanto pelo critério da OMS (grupo exposto = 12%; grupo controle = 20%), quanto pelo critério estrito de Kruger (grupo exposto = 3%; grupo controle = 6%) estavam significativamente diminuídas no grupo exposto em relação ao controle (p<0,001). O marcador de maturidade Creatina Quinase apresentou-se dentro da normalidade em ambos os grupos, porém maior no grupo controle (p<0,001). Anticorpos anti-espermatozóides estavam elevados nos dois grupos, porém não foi significativo (p=0,382). Radicais livres de oxigênio apresentaram-se em altas concentrações nos dois grupos, porém não foi significativo (p=0,141). CONCLUSÕES: A análise dos dados obtidos nessa pesquisa sugere que a poluição atmosférica exerce uma influência negativa sobre os parâmetros seminais motilidade e morfologia. Causa elevação dos níveis de ROS em todos os indivíduos, indicando perda da função espermática. Ainda demonstrou-se a elevação em todos os indivíduos dos níveis de anticorpos anti-espermatozóides, sugerindo que os poluentes teriam transposto a barreira hemato-testicular. O volume testicular do grupo exposto à poluição veicular apresentar-se maior em relação ao volume testicular do grupo controle nos leva a supor que isto se deva a uma reação inflamatória aos agentes poluidores. Apesar da diferença significativa na concentração de poluentes entre os grupos, uma correlação direta com parâmetros seminais não pôde ser demonstrada / Metropolitan Region of Sao Paulo is the most populous of Brazil. The huge number of vehicles contributes for a higher concentration of air pollutants. Various pollutants can interfere in human fertility, altering the main seminal parameters. The aim of this study was to evaluate the influence of air pollution of vehicular origin on seminal parameters of traffic controllers. Clinical history and urological evaluation (testicular volume, presence of varicocele, cryptorchidism, bad formations) were carried out in 62 traffic controllers (exposed group) and 210 proven fertile men from the pre-vasectomy group of urologic clinic at Hospital of Clinics University of Sao Paulo (control group). Seminal parameters evaluated were concentration, motility (quantitative and qualitative), morphology by WHO´s criteria and Kruger´s strict criteria, test for detection of leukocytes and tests of sperm function, CK, ROS and antisperm antibody. Hormonal parameters also were evaluated. Exposition to air pollution was analyzed through the dispersion of pollutants recorded by Cetesb, generated in the software SURFER 8.0. Traffic controllers presented bigger testicular volume than prevasectomy group (p<0,001). Hormonal levels were at normal range in both groups; Estradiol (p=0,119), LH (p=0,644), FSH (p=0,140) and Total Testosterone (p=0,365). Sperm concentration was homogeneous in both groups (p= 0,395); traffic controllers presented mean of 124.9x106/ml and pre vasectomy group 110.1x106/ml. The exposed group presented quantitative (total) motility (60%) diminished than control group (65%) (p=0,047). The qualitative (progressive) motility was also diminished in the exposed group (p <0,001). The sperm morphologies as by WHO´s criteria (exposed group = 12%; control group = 20%), as by Kruger´s strict criteria (exposed group = 3%; control group = 6%) were significantly diminished in the exposed group (p<0,001). The sperm maturity marker Creatine Kinase was at normal range at both groups, but higher in the control one (p<0,001). Antisperm antibodies was elevated in both groups, however it was not significant (p=0,382). ROS presented higher concentrations in both groups, however it was not significant (p=0,141). The facts presented in this study suggest that air pollution exercises negative effects on the seminal parameters motility and morphology. It causes elevation of ROS levels in all individuals, indicating loss of sperm function. It also showed, elevation of antisperm antibodies levels, suggesting that pollutants would have transposed the blood-testis barrier. The testicular volume in the exposed group was higher than the testicular volume of the control group; we can suppose that it must occur due to an inflammatory reaction against the polluting agents. Although the significant difference in pollutants concentrations between groups, no direct correlation to seminal parameters could be demonstrated

Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-&#946;2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a &#946;2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de &#946;2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / &#946;2-glycoprotein I (&#946;2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The &#946;2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-&#946;2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the &#946;2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for &#946;2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 &#181;g desse anticorpo reconheceu 0,6 &#181;g de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 &#181;g de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina &#945; no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 &#181;g of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 &#181;g of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and &#945; intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.