Vários estudos que tentam compreender a gênese da aterosclerose têm demonstrado evidências que a oxLDL é peça importante para o desenvolvimento da doença, tornando-a um importante marcador. Os objetivos deste trabalho foram propor um novo imunossensor empregando anticorpos monoclonais anti-oxLDL e desenvolver um processo inovador de obtenção de anticorpos plásticos anti-oxLDL. Para construção do imunossensor, a região Fc do anticorpo foi ligada ao eletrodo de trabalho do dispositivo AuSPE (Screen-Printed Gold Electrodes), utilizando cisteamina. Posteriormente, foi adicionado BSA como bloqueador de possíveis regiões livres. Após o bloqueio, o imunossensor foi testado com oxLDL e outros antígenos, como forma de garantir a especificidade. Em relação aos anticorpos plásticos, chamados MAPS, estes foram desenvolvidos contruindo uma camada impressa de forma invertida ao anticorpo plástico SPAN, referência deste trabalho. Após obtenção dos MAPSs, estes passaram por diversos testes, similar ao imunossensor. Os resultados demonstraram excelente sensibilidade e especificidade às moléculas de oxLDL com detecção em tempo real em ambas as metodologias. / Increased levels of plasma oxLDL are associated with atherosclerosis, and the subsequent development of severe cardiovascular diseases that are today a major cause of death in modern countries. It is therefore important to find a reliable and fast assay to determine oxLDL. A new Immunosensor employing three monoclonal antibodies against oxLDL and a backside protein-surface imprinting process are proposed in this work. To generate the Immunosensor the mAbs were set-up by cysteamine on a gold layer of a disposable screen-printed electrode. BSA was immobilized further as bloker. All steps were followed by various characterization techniques such as electrochemical impedance spectroscopy and square wave voltammetry. To generate specific synthetic antibody materials, called MAPS, these were developed with a backside protein-surface imprinting process of the plastic antibody SPAN, the reference of the work. The devices were successfully applied to determine the oxLDL fraction in real serum, without prior dilution or necessary chemical treatment. Overall, these were promising results with the possibility to apply on the practical use of clinical.

BRUNETTA, D. M. Prevalência e fatores de risco para hemólise imune nos pacientes submetidos a transplante hepático. 2016. 133 f. Tese (Doutorado em Cirurgia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-16T11:50:36Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmbrunetta.pdf: 3436954 bytes, checksum: 2c336a327ea98342785512d377075ee1 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-16T11:50:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmbrunetta.pdf: 3436954 bytes, checksum: 2c336a327ea98342785512d377075ee1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T11:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmbrunetta.pdf: 3436954 bytes, checksum: 2c336a327ea98342785512d377075ee1 (MD5) Previous issue date: 2016-12-09 / Liver transplant (LT) anemia is multifactorial. Immune hemolysis occurs due to auto-antibodies, drug induced or not, or due to allo-antibodies, formed by transfusion or passenger lymphocyte syndrome (PLS). The aim of this study was to evaluate the prevalence and risk factors for immune hemolysis in LT. Between September 2014 and April 2016, 175 patients submitted to 178 LT were included. Multi-organ recipients were excluded. Samples from before, seven consecutive days and weekly for four weeks were analyzed for complete blood cound, reticulocyte count, lactate dehydrogenase (LDH), indirect bilirrubin (IB) and imummohematological tests. SPSS 24 was used for statistical analysis, p<0.05 was considered significant. The mean age was 52.1 ± 14.6 years old, with 105 male patients (60%). The most frequent causes of cirrhosis were hepatitis C virus (HCV, 59 – 33.7%) and alcohol (44 – 25.1%). Anemia before LT was present in 140 patients (74.2%), with lower hemoglobin (Hb) concentration in those with positive direct antiglobulin test (DAT, p=0.014). Nine patients (5.1%) presented positive antibody screen (AS) before transplant, with 2.3% of clinical significance. This finding was more frequent in RhD negative patients (p=0.017). Positive DAT occurred in 53 patients (30.3%) and was related to high MELD score (p=0,048), HCV (p=0.005) and furosemide use (p=0.001). These patients presented higher levels of IB (p<0.001). Ninety six patients (55%) were transfused in the studied period. One hundred and fourty five patients (87.8%) were still anemic on the fourth week. Twenty two patients (12.5%) presented positive AS after LT, with nine patients (5.7%) presenting clinically significant antibodies. Positive AS occurred more frequently in RhD negative (p=0.021) and in those transfused with red blood cells units (RBCU, p=0.022). Sixteen patients received grafts with minor ABO incompatibility. Post-transplant positive DAT was associated with higher levels of LDH (p=0.006), piperacillin-tazobactam use (p=0.021) and was more frequent in the non identical ABO group (p=0.0038). In this group, five of eleven positive DAT patients presented anti-A (2) or anti-B (3) on the eluate, representing PLS. All PLS patients received liver graft O and were using mycofenolate, tacrolimus and steroids. Four patients presented hemolysis and three were transfused due to PLS. These patients, compared to all the other patients, presented lower Hb concentration (p=0.043) and higher LDH levels (p=0.008) and reticulocyte counts (p=0.008). The presence of auto and allo-antibodies against red blood cell antigens is frequent in LT, but clinical significant hemolysis occurred in only 2.8%. Antibodies are more frequent in patients with higher MELD scores, with HCV, in use of pre-transplant furosemide, in those transfused patients with RBCU, RhD negative and piperacillin-tazobactam use after LT. The only risk factor for PLS is minor ABO mismatch between donor and recipient. / Anemia no transplante hepático (TH) é multifatorial. Hemólise imune ocorre por autoanticorpos, com ou sem relação com drogas, ou aloanticorpos, formados por transfusão ou síndrome do linfócito passageiro (SLP). O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência e fatores de risco para hemólise imune no TH. Foram incluídos, entre setembro de 2014 e abril de 2016,175 pacientes submetidos a 178 TH, sendo excluídos transplantes de múltiplos órgãos. Amostras pré-TH, de 7 dias consecutivos e semanalmente até 4 semanas foram avaliadas com hemograma, reticulócitos, lactato desidrogenase (LDH), bilirrubina indireta (BI) e testes imuno-hematológicos. SPSS 24 foi usado para estatística, com p<0,05 significante. A idade média foi de 52,1 ± 14,6 anos, com 105 homens (60%). As etiologias mais frequentes da cirrose foram vírus da hepatite C (VHC, 59 - 33,7%) e álcool (44 - 25,1%). Anemia pré-transplante estava presente em 140 pacientes (74,2%), com menores concentrações de hemoglobina (Hb) naqueles com teste direto da antiglobulina (TAD) positivo (p=0,014). Nove pacientes (5,1%) apresentaram pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) positiva pré-TH, sendo 2,3% clinicamente significantes. Esse achado foi mais frequente em RhD negativo (p=0,017). TAD positivo pré-TH ocorreu em 53 pacientes (30,3%), com relação com escore MELD elevado (p=0,048), VHC (p=0,005) e uso de furosemida (p=0,001). Esses pacientes apresentaram BI mais elevada (p<0,001). Noventa e seis pacientes (55%) receberam hemocomponentes no período estudo. Cento e quarenta e cinco pacientes (87,8%) ainda estavam anêmicos na 4a semana. Vinte e dois pacientes (12,5%) apresentaram PAI positiva pós-TH, sendo nove pacientes (5,7%) com anticorpos clinicamente significantes. PAI positiva foi mais frequente em RhD negativo (p=0,021) e nos transfundidos com concentrado de hemácias (CH - p=0,022). Dezesseis pacientes receberam enxerto ABO não idêntico. TAD positivo pós-TH esteve associado a aumento de LDH (p=0,006), uso de piperacilina-tazobactam (p=0,021) e foi mais frequente no grupo ABO não idêntico (p=0,0038). Nesse grupo, cinco dos 11 com TAD positivo apresentaram eluato com anti-A (02) ou anti-B (03), configurando SLP. Todos receberam fígado O e estavam em uso de micofenolato, tacrolimus e corticoide. Quatro apresentaram hemólise e três foram transfundidos pela SLP. Esses pacientes, quando comparados aos demais, apresentaram Hb menor (p=0,043) e LDH (p=0,008) e reticulócitos (p=0,008) maiores. A presença de auto e aloanticorpos contra antígenos eritrocitários é frequente no TH, porém hemólise clinicamente manifesta ocorreu em apenas 2,8%. A presença de anticorpos é mais frequente em pacientes com escore MELD mais elevado, com VHC, que utilizam furosemida pré-transplante, naqueles transfundidos com CH, RhD negativo e que utilizam piperacilina-tazobactam pós-transplante. O único fator de risco para o desenvolvimento de SLP encontrado é a incompatibilidade ABO menor entre doador e receptor.

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 382.pdf: 3183011 bytes, checksum: f744fa5f60906e4cd7c28ff86ac167bc (MD5) Previous issue date: 2009 / As infecções de transmissão sexual, em especial a sífilis, são um dos problemasde saúde mais comuns e ainda se desconhece sua real magnitude, inclusive no Brasil. Algumas explicações podem ser descritas pela insuficiência de recursos humanos e materiais necessários ao seu diagnóstico em zonas de difícil acesso, em diversos países. Nessas circunstancias, exames de diagnóstico denominados testes rápidos têm um papel importante para a identificação da doença, e, na tentativa de demonstrar sua aplicabilidade e seu papel na gestão de políticas públicas este trabalho atuou em quatro frentes de pesquisa: Primeira - validação das características operacionais, de quatro diferentes testes rápidos treponêmicos em clínica especializada em Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST), em Manaus, comparado-os com o FTA-Abs como padrão ouro e a avaliação da aceiilidade dos testes junto aos profissionais e clientela testada. Segundo- Validação multicêntrica com outros três países participantes do estudo. Terceira Estudos dirigidos a subgrupos de pessoas que habitualmente não acedem, de maneira espontânea, os serviços regulares de saúde. E, por fim Estudos junto a populações de diferentes prevalências para a sífilis. Onde somadas as quatro etapas comprovou-se as principais virtudes desta nova geração de testes, rapidez e facilidade na execução e interpretação; aceiilidade pelos pacientes e profissionais de saúde; favorecimento da decisão do tratamento imediato; dispensar energia elétrica ou profissional especializado. As evidências levantadas por estas investigações enfatizam o papel que os testes rápidos jogarão nos próximos anos, para o controle da sífilis.

Made available in DSpace on 2014-07-22T13:53:03Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 157.86.8.8/reports/mestrado_bibcb/luciana_alves_ipec_mest_2009.pdf.pdf: 3541582 bytes, checksum: 4f7757d0fbb7469be4d177d93edcc281 (MD5) 157.86.8.8/reports/mestrado_bibcb/luciana_alves_ipec_mest_2009.pdf.pdf.txt: 138310 bytes, checksum: 7d5d26beccd2b08b1f5ba40bc763462b (MD5) 157.86.8.8/reports/mestrado_bibcb/luciana_alves_ipec_mest_2009.pdf.pdf.jpg: 1441 bytes, checksum: 002a11824a4e1198360c0d79558ac3b8 (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Rio de Janeiro, Brasil / As galinhas de criações extensivas são hospedeiros indicadores da contaminação ambiental por oocistos de Toxoplasma gondii, pois se alimentam no solo. No Rio de Janeiro, há relatos de alta prevalência de toxoplasmose em humanos, porém não há estudos na região das Baixadas Litorâneas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento da ocorrência da infecção por T. gondii em galinhas domésticas criadas extensivamente para o consumo humano no município do Rio Bonito, Rio de Janeiro, Brasil. Com essa finalidade, foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-T. gondii por meio de exame sorológico e também do parasito em tecidos dessas aves utilizando-se a técnica de bioensaio em camundongos. Para realização dos exames sorológicos foram utilizadas 234 galinhas provenientes de 24 criações extensivas de cinco bairros de Rio Bonito: Praça Cruzeiro, Cachoeira dos Bagres, Nova Cidade, Prainha e Boa Esperança. Amostras de sangue dessas aves foram coletadas para a realização de reação de imunoflurescência indireta (RIFI) para detecção de anticorpos anti-T. gondii. Além disso, os proprietários de cada criação responderam um questionário epidemiológico para estudo de associações entre variáveis e a infecção por T. gondii em galinhas pelo teste T, adotando p<0,05. Foi encontrada uma prevalência de 25,9% de soro-reagentes para Toxoplasma gondii em galinhas As frequências encontradas nos bairros pelo teste T (p<0.05) foram: 34,1% (15,5-52,6%) em Prainha; 23,8% (4,3-43,4%) em Nova Cidade; 23,8% (0-47,8%) em Cachoeira dos Bagres; 21,7% (0-47,2%) em Praça Cruzeiro e 14,3% (0-51,4%) em Boa Esperança. Os resultados dos exames e orientações sobre medidas preventivas foram passados aos proprietários. Houve associação significante da presença de roedores e alimentação de gatos com vísceras cruas ou mal cozidas de galinhas com a positividade da RIFI para anticorpos IgG anti-T. gondii em galinhas pelo teste T. Uma outra amostra de trinta galinhas foi selecionada aleatoriamente nos bairros estudados para comparar a RIFI em relação ao bioensaio em camundongos. Amostras de sangue foram coletadas para realização da RIFI e em seguida, as galinhas foram submetidas à eutanásia. Durante a necropsia, foram coletados cérebro, coração e musculatura da coxa para preparo de suspensão e inoculação em camundongos. O parasito T. gondii foi isolado de oito galinhas com sorologia positiva e um não-reagente pela RIFI. Os resultados obtidos pela RIFI e bioensaio em camundongos indicam a contaminação ambiental na região e a possibilidade de infecção em humanos, caso a carne dessas aves seja ingerida crua ou mal cozida. A técnica de RIFI apresentou baixa sensibilidade e especificidade e valor kappa moderado (0,416) na amostra estudada, porém um número maior de amostras é necessário para confirmar esses resultados / Free-range chickens are good indicators of environmental contamination by Toxoplasma gondii because they feed from the ground. Studies in Rio de Janeiro reported high prevalences of toxoplasmosis in humans, but there aren’t informations about the region of Baixadas Litorâneas. The aim of survey was to investigate the occurrence of Toxoplasma gondii infection in free-range chickens (Gallus gallus domesticus) for human consumption in the county of Rio Bonito, Rio de Janeiro, Brazil. Search of antibodies to T. gondii by serology and of the parasite in tissues of chickens by bioassay in mice was realized. Twenty four breedings from five districts in Rio Bonito were investigated: Praça Cruzeiro, Cachoeira dos Bagres, Nova Cidade, Prainha and Boa Esperança. A total of 234 blood samples was collected from free-range chickens and antibodies to T. gondii were assayed by Indirect fluorescent antibody test (IFAT). The owners answered a questionnaire. Statistical association between the serologic status and several variables were analyzed by T test, adopting p<0,05. The T. gondii seropositivity found in chickens was 25.9%. The frequencies found by T test in districts were: 34.1% (15.5-52.6%) in Prainha; 23.8% (4.3-43.4%) in Nova Cidade; 23.8% (0-47.8%) in Cachoeira dos Bagres; 21.7% (0- 47.2%) in Praça Cruzeiro and 14.3% (0-51.4%) in Boa Esperança. Owners received results of tests and information about preventive measures.The significant association was observed between presence of rodents and feeding of cats with raw or undercooked visceras of chickens with seropositivity in chickens by T test. For comparison of IFAT and bioassay in mice, a other sample of 30 free-range chickens were randomly selected in districts studied. Blood samples of each chicken were collected and then euthanasia was performed. During the necropsy, brain, heart and leg muscle were collected, pooled and bioassayed in mice. The parasite T. gondii was isolated from eight seropositive chickens and one nonreactive by IFAT. The results obtained by IFAT and bioassay in mice suggest environment contamination in studied region and the possibility of human infection by eating raw or undercooked meat of chickens. Sensitivity and specificity of IFAT were low and the agreement was moderate (kappa= 0.416), but more samples are necessary to confirm this results.

Made available in DSpace on 2014-08-11T12:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) lilian_nascimento_ipec_dout_2012.pdf: 11773852 bytes, checksum: 9ad71852b1c498a40fac78e3aacc2a0a (MD5) lilian_nascimento_ipec_dout_2012.pdf.txt: 134129 bytes, checksum: 8b9796bdb9c63ac5f6e402b7415a47e7 (MD5) lilian_nascimento_ipec_dout_2012.pdf.jpg: 1525 bytes, checksum: a60802c425a9ae7d9f39a8ad44377192 (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, Brasil / Em decorrência da importância que o cão doméstico exerce frente à manutenção do ciclo de transmissão da leishmaniose visceral (LV), uma das estratégias de controle da doença é a eliminação de cães soropositivos. No entanto, até o início deste trabalho, ainda não havia sido realizado um estudo de acurácia diagnóstica com tamanho amostral expressivo do ensaio imunoenzimático (EIE) disponível no Brasil para diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC). Neste estudo foi avaliada a acurácia, reprodutibilidade e a validação do EIE para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (EIE-LVC) produzido pelo Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-Manguinhos). Foram incluídos 802 cães de áreas endêmicas captados por vigilância ativa e em Centros de Controle de Zoonoses (CCZ). Para o estudo de confiabilidade toda a amostra foi analisada de forma mascarada e em duplicata e 167 amostras foram repetidas também em outro laboratório (CCZ-Belo Horizonte). Foram considerados cães com LVC os que apresentaram diagnóstico parasitológico positivo com isolamento de Leishmania (Leishmania) chagasi ou imunofluorescência indireta (IFI) e reação em cadeia da polimerase (PCR) positivos. A confiabilidade das observações intraobservador foi excelente, com coeficiente de correlação intraclasse (CCI) de 0,98 (Intervalo de Confiança - IC 95% 0,98;0,99) para toda amostra e excelentes coeficientes de correlação de concordância de Lin Para a confiabilidade entreobservadores, o resultado também foi excelente. Os parâmetros de acurácia calculados para as duas aferições realizadas com toda amostra (N=802) indicaram sensibilidade de 89,9% (IC 95% 86,5;92,7) e 87,6% (IC 95% 83,9;90,7) para a 1ª e 2ª aferições, respectivamente, e especificidade de 89,4% (IC 95% 86,0;92,2) e 91,6% (IC 95% 88,5;94,1). A acurácia foi alta independente da condição clínica do cão com áreas sobre a curva ROC (Receiver Operating Characteristic) grandes variando de 0,94 a 0,92, e como esperado, os valores preditivos positivos aumentaram com a piora da condição clínica do cão. O desempenho do teste EIELVC o credencia para o diagnóstico em população de cães suspeitos de LVC / Due to the importance of domestic dog carries forward to the maintenance of the cycle transmission of visceral leishmaniasis, one of the strategies of disease control is the elimination of seropositive dogs. However, until the beginning of this work, had not been a study of diagnostic accuracy with expressive sample size available in Brazil for an enzyme immunoassay (EIA) for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL). We evaluated the accuracy, reproducibility and validation of EIA for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (EIE-LVC) produced by the Immunobiological Technology Institute (Bio-Manguinhos). We included 802 dogs from endemic areas captured by active surveillance and Zoonosis Control Centers (ZCC). For the study of reliability, tests were performed in duplicate and masked for entire sample and 167 samples were also repeated in another laboratory (ZCC-Belo Horizonte). We considered those dogs with CVL showed positive parasitological diagnosis with isolation of Leishmania (Leishmania) chagasi or indirect immunofluorescence and polymerase chain reaction positive. The reliability of intraobserver was excellent, with intraclass correlation coefficient (ICC) of 0.98 (confidence interval - 95% CI 0.98, 0.99) for the entire sample and excellent Lin's concordance correlation coefficients. The reliability between observers was still excellent. Accuracy parameters calculated for the two measurements taken with all serum sample (N = 802) showed a sensitivity of 89.9% (95% CI 86.5,92.7) and 87.6% (95% CI 83.9,90.7) for the 1st and 2nd measurements, respectively, and a specificity of 89.4% (95% CI 86.0,92.2) and 91.6% (95% CI 88.5,94.1). Accuracy was high regardless of the clinical condition of the dog with areas under the Receiver Operating Characteristic (ROC) curve ranging from 0.94 to 0.92, and as expected the positive predictive values increased with worsening clinical condition of the dog. The performance EIE-LVC enable the diagnosis in a population of dogs suspected of CVL.

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-12T17:13:48Z No. of bitstreams: 1 Nayara Final.pdf: 4140088 bytes, checksum: ab360755584995cab3cab99f56557007 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-12T18:50:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Nayara Final.pdf: 4140088 bytes, checksum: ab360755584995cab3cab99f56557007 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T18:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nayara Final.pdf: 4140088 bytes, checksum: ab360755584995cab3cab99f56557007 (MD5) / Fiocruz / Instituto Carlos Chagas, Fiocruz-PR, Curitiba, PR, Brasil / Sistemas convencionais para expressão de anticorpos diméricos consistem em geral na co-transfecção de dois plasmídeos, cada um codificando uma das duas cadeias do anticorpo. Este trabalho teve por objetivo construir novos vetores para expressão simultânea das duas cadeias do anticorpo e outras proteínas oligoméricas a partir de um único plasmídeo, buscando melhorar o nível de expressão de proteínas heterodiméricas. A eficiência desses vetores foi testada para expressão do anticorpo dimérico constituído pelo Fab do anticorpo MEDI-493 fusionado à fração cristalizável de uma IgG1 humana selecionada devido à sua maior estabilidade. A escolha deste anticorpo foi baseada no seu potencial para o tratamento e diagnóstico rápido de infecções pelo Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV). Os sistemas de expressão desenvolvidos neste projeto foram usados também para expressar partículas tipo-vírus (VLPs) de hRSV. As VLPs foram reconstituídas utilizando a combinação das proteínas G e M, ou F0 e M de hRSV. Sequências de aminoácidos do anticorpo e das VLPs foram usadas para gerar genes sintéticos que foram subclonados nos vetores de expressão. A expressão do anticorpo foi conduzida em células HEK293/HEK293T. Os melhores resultados foram obtidos com o plasmídeo baseado em dois cassetes de expressão. O anticorpo recombinante foi purificado a partir dos sobrenadantes da cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando proteína A/G imobilizada em uma fase sólida e a expressão foi confirmada por Western Blot. O reconhecimento da F1, que é a proteína do hRSV que contém o epítopo alvo deste anticorpo, foi demonstrado inicialmente por Western Blot contra a proteína F1 recombinante. A atividade do anticorpo recombinante foi subsequentemente testada utilizando amostras de paciente infectados com o vírus hRSV por Western Blot em também por ensaios de ELISA. O anticorpo recombinante foi capaz de reconhecer as amostras clínicas com especificidade equivalente a do anticorpo comercial MEDI-493, confirmando seu potencial para aplicação em diagnóstico de infecções causadas pelo hRSV. / Conventional systems for expression of dimeric antibodies rely usually on cotransfection of two plasmids, each one coding one of the two antibody chains. The aim of this work was to construct new vectors for simultaneous expression of both antibodies chains and of other oligomeric proteins from a single plasmid, aiming to improve the level of expression of heterodimeric proteins. The efficiency of these vectors was tested for expression of a dimeric antibody constructed by using the Fab fragment of the antibody MEDI-493 with the crystallizable fraction of a human IgG1 selected based on its higher stability. This antibody was chosen based on its potential for treatment and rapid diagnostic of Respiratory Syncytial Virus (hRSV) infections. The expression system developed in this project was also used to express virus-like particles (VLPs) of hRSV. The hRSV VLPs were reconstituted using G and M, or F0 and M protein combinations. The amino acid sequences of this antibody and VLPs were used to generate nucleotide sequences. The respective genes were acquired from a gene synthesis company and subcloned into the new expression vectors. Expression of the recombinant antibody was conducted in HEK293/HEK293T cells in parallel experiments to compare the performance of the three different genetic constructs. Best results were obtained with a plasmid containing two expression cassettes, one for each antibody chain. The recombinant antibody was purified from cell culture supernatants by affinity chromatography using protein A/G immobilized on a solid phase and its presence was confirmed by Western Blot. Interaction of the recombinant antibody with its target on the hRSV F1 protein was determined by Western Blot. The activity of the recombinant antibody was tested using clinical specimens from patients infected with hRSV by Western Blotting and ELISA assays. The recombinant antibody was able to detect the F1 protein the clinical specimens with efficiency similar to the commercial antibody MEDI-493. This result indicates the recombinant antibody can be used for diagnosis of infections caused by hRSV.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan that belongs to the Apicomplexa phylum and causes toxoplasmosis which is especially severe in immunocompromised individuals and who acquired the infection by congenital transmission. Dense granules are organelles involved in this parasite invasion and replication of the parasite inside the cell. Among the proteins secreted by dense granules, jointly called GRAs, the GRA 2 is particularly immunogenic. In the present work, we aim to study the role of this protein in inducing adaptive immune response by produced and characterized a monoclonal antibody against GRA2. The parasite treated with this antibody showed the lowest rate of replication in intracellular proliferation assay compared to treatment with irrelevant antibody. The epitopes of this protein that binds to the monoclonal antibody have been mapped by phage display. Through bioinformatics analysis, epitopes for B cells and T GRA2 were predicted and based on that and on the results of phage display amino acid sequences were chosen to synthesize two peptides that were tested as potential vaccine. Immunization tests were carried out in C57BL/6 mice with synthetic peptides and these animals were subsequently infected with T. gondii. There was a significant reduction in mortality in the group immunized with the mixture of both peptides. The negative control group, immunized only with BSA, showed the highest mortality and analysis of cytokine present in the sera of these animals there was a predominance of proinflammatory cytokines while antiinflammatory cytokines were shown to be almost nonexistent in the serum of these animals. Given these results, it was found that the group with higher survival showed better Th1/Th2 balance. This demonstrates that immunization with epitopes recognized by both B cells and T cells appear to be more effective. Thus, peptide mimetics GRA2 regions of the protein may be likely candidates for the development of vaccines against toxoplasmosis. / Toxoplasma gondii é um protozoário do filo Apicomplexa intracelular obrigatório causador da toxoplasmose, que é especialmente grave em indivíduos imunocomprometidos e em indivíduos que adquiriram a infecção por transmissão congênita. Grânulos densos são organelas deste parasito envolvidas no processo de invasão e replicação do parasito no interior da célula. Dentre as proteínas secretadas pelos grânulos densos, chamadas conjuntamente de GRAs, a GRA 2 é particularmente imunogênica. No presente trabalho, no sentido de estudar a participação dessa proteína na indução da resposta imune adaptativa, foi produzido e caracterizado um anticorpo monoclonal contra GRA2. O parasito tratado com esse anticorpo apresentou menor taxa de replicação em ensaio de proliferação intracelular comparado ao tratamento com anticorpo irrelevante. Os epítopos de ligação da proteína GRA2 ao anticorpo monoclonal foram mapeados por phage display. Por meio de análises de bioinformática, epítopos para células B e T da GRA2 foram preditos e com base nisso e nos resultados do phage display foram escolhidas seqüências de aminoácidos para sintetizar dois peptídeos que foram testados quanto ao potencial vacinal. Foram feitos ensaios de imunização em camundongos C57BL/6 com estes peptídeos sintéticos e os animais foram posteriormente infectados com T. gondii. Foi observada redução significativa na mortalidade no grupo imunizado com a mistura de ambos os peptídeos. O grupo controle negativo, imunizado somente com BSA, apresentou a maior mortalidade e nas análises de produção de citocinas presentes nos soros destes animais observou-se uma predominância de citocinas pró-inflamatórias enquanto as citocinas anti-inflamatórias mostraram-se quase inexistentes no soro destes animais. Tendo em vista esses resultados, percebeu-se que o grupo com maior sobrevivência apresentou melhor balanço Th1/Th2. Isso demonstra que a imunização com epítopos reconhecidos tanto por células B quanto por células T parece ser mais efetiva. Assim, peptídeos miméticos de regiões da proteína GRA2 podem ser prováveis candidatos no desenvolvimento de vacinas anti Toxoplasmose. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

A Leishmaniose visceral é uma doença parasitária crônica em homens e cães, causada por protozoários da espécie L. (Leishmania) chagasi. O diagnóstico parasitológico é confirmado pelo achado do agente em aspirados de medula óssea, linfonodo, baço e fígado, enquanto que a sorologia IgG especifica é usada em geral para estudos epidemiológicos, apesar dos altos níveis séricos de anticorpos IgG anti-Leishmania. Existem relatos anedóticos de resultados sorológicos negativos em doença ativa, atribuído à formação de imunocomplexos. Dado que imunocomplexos podem ser dissociados por tratamento ácido, nós buscamos a padronização de um teste simples de dissociação ácida dos imunocomplexos de amostras de soro, por tratamento ácido e neutralização em poços adsorvidos com antígenos de Leishmania, seguida de ELISA (ELISA dissociativo). A confirmação da presença de antígenos foi realizada pela detecção após adsorção ácida por DOT-ELISA, usando soro de coelho hiperimune anti-Leishmania. Amostras de hamsteres infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi mostraram a presença e interferência de imunocomplexos na sorologia principalmente nas fases iniciais da infecção, por ELISA dissociativo e DOT-ELISA. Em amostras maiores de áreas endêmicas, o ELISA dissociativo aumentou a soropositividade em 10% em amostras de cães negativas e 3,5% de amostras humanas negativas, com confirmação por DOT-ELISA. Os resultados mostram que este teste poderia ser usado no diagnóstico da LV, como abordagem alternativa para a identificação sorológica de casos assintomáticos e para indicação de métodos parasitológicos invasivos confirmatórios. / Visceral leishmaniasis, caused by Leishmania (Leishmania) chagasi, is a chronic parasitic disease of humans and dogs. Confirmation of the protozoal agent in bone marrow, lymph node or spleen aspirate is diagnostic, while specific-IgG serology is used mainly for epidemiology despite the general presence of high levels of serum immunoglobulins. Anecdotal reports of false-negative serology in active disease cases are known and are ascribed to the formation of immune complexes. Because dissociation of immune complexes can be accomplished by acid treatment, we devised a simple, routine enzyme immunoassay (ELISA) for the dissociation of immune complexes in serum samples using acid treatment and neutralization in wells adsorbed with Leishmania antigen (dELISA). Confirmatory acid DOT-ELISA was also developed for antigen detection by anti-Leishmania rabbit antiserum. In experimental L. (L.) chagasi hamster models, immune complexes interfered with ELISA mostly in the early stages of infection, according to both dELISA and antigen DOT-ELISA results. In larger samples from endemic areas, dELISA increased seropositivity by 10% in negative dog samples (7/70) and 3.5% in negative human samples (3/85), showing that dELISA could be used in the serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Moreover, dELISA could be used as an alternative approach to screening asymptomatic visceral leishmaniasis patients, instead of invasive confirmatory testing.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T12:55:53Z No. of bitstreams: 1 Joubert Santana Pimentel.pdf: 331586 bytes, checksum: a5ad502fe9d1ea2473615213205a4a88 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T12:55:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joubert Santana Pimentel.pdf: 331586 bytes, checksum: a5ad502fe9d1ea2473615213205a4a88 (MD5) Previous issue date: 2009-03-02 / Modern zoological gardens are institutions to wild fauna maintenance, aiming its conservation, the performance of scientific research and leisure, recreation and environmental education activities. The variety of wild species living in conditions different from the one found in its natural habitats represents a propitious environment for diseases spread, specially the zoonotic ones. Due to data shortage and wild mammals’ epidemiological relevance both for toxoplasmosis as for leptospirosis, this study aimed to determine the seroprevalence of toxoplasmosis and leptospirosis in neotropical wild mammals, from “Zoológico do Parque da Cidade Governador José Rollemberg Leite”, Aracaju, Sergipe, Brazil. Blood samples were collected from 32 wild mammals, adults and from both sexes: 14 tufted capuchins (Cebus apella), four golden-bellied capuchins (Cebus xanthosternus), three pumas (Puma concolor), one jaguar (Panthera onca), one fox (Pseudolopex vetulus), six crab-eating raccoons (Procyon cancrivorus), two South American coatis (Nasua nasua), and one tayra (Eira Barbara). Sera were tested by the modified agglutination test (MAT) using formalin-fixed whole tachyzoites and mercaptoetenhol (cut-off point 1:25) to Toxoplasma gondii antibodies, and by the microscopic seroagglutination test (cut-off point: 1:100) using 24 serovar of,pathogenic leptospiras and 2 serovar of saprophyte leptospiras. Antibodies to T. gondii were found in 17 of 32 wild mammals (53.1%), and antibodies to Leptospiras spp were found in 4 of 32 wild mammals (12.5%). In relation to gender, 9 of 15 (60%) males, and 8 of 17 (47.1%)females had antibodies to T. gondii, and 4 of 15 (26.7%) males had antibodies to Leptospira spp. Considering the origin of wild seropositive mammals to T. gondii, 8 of 17 (47%) was born in zoo, 7 of 17 (41.2%) were from other zoos, and 2 (11.8%) was from the wild, and 3 of4 (75%) seropositive to Leptospiras spp was born in zoo, and 1 of 4 (25%) was from the wild. This is the first serological survey of Leptospiras spp in neotropical primates and carnivores from Northeast zoo from Brazil, and the first found to antibodies to Leptospira spp (serovar Copenhageni) in the threaten specie of primate golden-bellied capuchins (Cebus xanthosternus). / Os zoológicos modernos são instituições destinadas à manutenção da fauna selvagem com objetivo de conservação, pesquisa cientifica, lazer, recreação e educação ambiental. A ampla variedade de espécies selvagens, vivendo em condições diferentes do seu habitat natural, representa um ambiente propício à disseminação de doenças, muitas delas zoonóticas. Devido à escassez de dados e à relevância dos mamíferos selvagens no contexto epidemiológico, tanto na toxoplasmose, quanto na leptospirose, objetivou–se determinar a soroprevalência de toxoplasmose e de leptospirose em mamíferos selvagens neotropicais do Zoológico do Parque da Cidade Governador José Rollemberg Leite, Aracaju, Sergipe. Para tanto foram colhidas amostras sanguíneas de 32 mamíferos selvagens, adultos e de ambos os sexos, das espécies: 14 macacos-prego (Cebus apella), quatro macacos-prego-do-peito-amarelo (Cebus xanthosternus), três onças-suçuaranas (Puma concolor), uma onça-pintada (Panthera onca), uma raposa-do-campo (Pseudolopex vetulus), seis guaxinins (Procyon cancrivorus), dois quatis (Nasua nasua) e um papa-mel (Eira barbara). Para pesquisa de anticorpos anti- Toxoplasma gondii foi utilizado o teste de Aglutinação Modificada com taquizoítos inativados na formalina e 2-mercaptoetanol (ponto de corte na diluição 1:25) e para pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp foi utilizado o teste de Soroaglutinação Microscópica (ponto de corte na diluição 1:100) com uma coleção de antígenos vivos que incluiu 24 variantes sorológicas de leptospiras patogênicas e duas leptospiras saprófitas. Dentre os 32 mamíferos, 17 (53,1%) apresentaram anticorpos anti-T. gondii e quatro (12,5%) foram positivos para anticorpos anti-Leptospira spp. De acordo com o sexo, 60% (9/15) dos machos e 47,1% (8/17) das fêmeas foram soropositivos para T. gondii e 26,7% (4/15) dos machosapresentaram anticorpos anti-Leptospira spp. Com relação à procedência, dos mamíferos que apresentaram anticorpos anti-T. gondii, 47% (8/17) nasceram no zoológico, 41,2% (7/17) foram oriundos de outras instituições e dois (11,8%) foram provenientes da natureza. Em relação aos quatro mamíferos soropositivos para Leptospira spp, três (75%) foram procedentes da natureza e um (25%) nasceu no zoológico. Este trabalho representou o primeiro inquérito sorológico para a ocorrência de anticorpos anti-Leptospira spp em primatas e carnívoros neotropicais em um zoológico do Nordeste do Brasil e descreveu pela primeira vez a ocorrência de anticorpos anti-T. gondii e anti-Leptospira spp com sorovar mais provável Copenhageni no primata ameaçado de extinção macaco-prego-de-peito-amarelo (C. xanthosternus).

Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Gisele Abigail Montan Torres / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorenzi_MarcelSalmeron_M.pdf: 4641112 bytes, checksum: 98293f35d81cf7287376bbbf8a203993 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: No Brasil a batata é considerada uma das principais hortaliças produzidas, tanto em área plantada quanto em consumo. A produção anual é em torno de 2 milhões de toneladas, ocupando uma área superior a 130 mil hectares, gerando cerca de 500 mil empregos. Nos últimos anos, a bataticultura brasileira vem sofrendo perdas significativas devido ao aumento da incidência de viroses, principalmente provocadas pelo vírus Y da batata (Potato virus Y - PVY). Mundialmente, são conhecidas pelo menos três linhagens distintas do vírus Y: PVYO, PVYC e PVYN, cujos sintomas variam de acordo com o ambiente e a planta hospedeira. A linhagem PVYN apresenta uma variante denominada PVYNTN, que provoca sintomas de mosaico foliar mais intenso e a indução de formação de anéis necróticos nos tubérculos. A presença de focos de infecção de PVY em índices acima de 4% (limite de tolerância regulamentada pelo Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento) é suficiente para condenar o uso de determinadas lavouras para a produção de batata-semente, além de representar grandes danos em cultivos comerciais de batata para consumo. Já o PVX pode representar um grande problema quando em associação com o PVY. É um vírus cosmopolita, sendo transmitido mecanicamente e caracterizado por mosaico leve nas folhas, mais visíveis na metade inferior da planta. Atualmente, a análise de fitossanidade e a indexação viral da batata-semente destinada à multiplicação comercial no Brasil são efetuadas através da combinação da utilização de plantas indicadoras, que demanda tempo, e por testes sorológicos como ELISA, os quais representam custos adicionais à cadeia produtiva, uma vez que o Brasil é dependente da importação dos antisoros de detecção. Deste modo, considerando a relevância do estabelecimento de testes de diagnóstico nacionais que permitam a identificação específica dos vírus Y e X, em virtude da grande incidência de infecções do PVY e da grande necessidade de proteção contra o aumento da introdução do PVX, com oagravante de grandes prejuízos na co-infecção, os objetivos específicos deste projeto foram produzir soros policlonais específicos para o PVX e PVY, estabelecer ELISA indireto e desenvolver diagnóstico molecular dos vírus através de primers específicos e do IC-RTPCR. Esse trabalho conseguiu isolar e purificar os vírus X e Y através da indexação biológica e protocolos de extração. Com isso, foi possível produzir e caracterizar os anticorpos policlonais para o PVY e o PVX, com grande especificidade e poder de detecção. Após essas etapas, foi realizado a construção de primers específicos, e o desenvolvimento de técnicas moleculares de detecção baseadas na extração de material genético de folhas infectadas e PCR com os respectivos primers, obtendo-se os respectivos fragmentos esperados, concluindo com sucesso o estabelecimento do teste. Por fim, tentouse estabelecer o IC-RT-PCR, todavia o tamanho reduzido das partículas virais inviabilizou a realização do teste, mas a execução da detecção por ELISA e molecular separadamente foi estabelecido com sucesso, permitindo agregar novas tecnologias nacionais e contribuindo com a redução dos custos para a execução dos testes de fitossanidade, importantes e imprescindíveis para o controle das viroses predominantes na bataticultura nacional. / Abstract: The potato culture (Solanum tuberosum L.) represents the fourth major vegetal production in the world, reaching productivity indexes which overcome that of cerals in 5 times. Potato crop may be affected by several disease. Actually, some references point out near 40 in a total of 70 disorders are caused by viral agents. Among the most important viruses of potato, virus X and Y usually cause major concern, due to their harmfull effects in productivity and comercialization of potato. Nowadays, the viral infecctions have found their way into Brazil's potato production reagions in a very fast maner. The state of São Paulo is the most afeccted. Althought potato crop is among the stocks 10 major crops in the country, its production relies on virus-free imported potato-seeds to mantain its production. This is not only responsable by a considerable part of the production costs, but also represents a dangerous entrance door for a number of exotic pathogens inexistent in our territory. Thus, a fitosanity control of imported seed-potato lots, which enter Brazil via Santos harbor in the State of São Paulo, has fundamental importance. The usage of imunodiagnosis like ELISA, althought being efficient and widely applied, results in an additional cost due to the dependency of Brazil on the importation of policlonal antisera and monoclonal antibodys necessaries for the proper detection of the most important virus afeccting the national potato plantations. It has becoming a must for the seed-potato production a program in Brazil to have our independence of the diagnoses antiserum reagents for ELISA to at least the most important seed-potato viruses. The independence on importation of these biotecnological products and the modernization of imunodiagnosis by applying molecular techniques with specifics primers and like IC-RT-PCR (ImmoCapture - Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction), which makes possible to detect the major potato's virus in a fast, efficient and cheap way in order to screen the sanity of the material produced in the country, leading to a increase in production and stating the quality of it. This work isolated and purified the virus X and Y by biological indexing and extraction protocols. Therefore, it was possible to produce and to characterize the polyclonals antiserum to PVX and to PVY, with great specificity and power of detection. After these steps, it was made specifics primers and the development of molecular detection techniques based on extraction of genetic material from infected leaves and PCR with the primers. The expected fragments was obtained, concluding with successful the establishment of the test. Finally, there was the attempt to establish the IC-RT-PCR, however the small size of viral particles prevented the test, but the implementation of detection by ELISA and molecular separately was successful, add new national technologies allowing and contributing to the reduction of costs for implementing of the fitosanitty tests, importants and essentials for the control of viruses prevailing in the national potato culture. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular