Made available in DSpace on 2016-06-23T12:19:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 3 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf.txt: 114168 bytes, checksum: 0b16d652e923152bc1715e232dfbbe05 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela. Teresina, PI, Brasil / Meningite criptocócica causa aproximadamente 15% da mortalidade relacionada com a AIDS anualmente. A Criptococose é uma enfermidade negligenciada. Contudo, pode ser prevenida pela realização do screening através da pesquisa do Antígeno Criptocócico(CrAg) e de tratamento precoce durante um longo período de detecção ou infecção subclínica. Nosso estudo determinou a prevalência da antigenemia criptocócica levando em consideração níveis de linfócitos CD4 e sintomas clínicos. MÉTODOS: Ao todo, 109 pacientes com HIV/AIDS, consentiram em participar deste estudo. Inicialmente, fez-se um levantamento de dados sócio- demográficos dos mesmos, além dos dados clínicos contidos no prontuário. A pesquisa de antígeno criptocócico utilizando Lateral Flow Assay( CrAg/LFA) no sangue e urina foi realizado em todos os pacientes inclusos no estudo, independente dos níveis de linfócitos CD4. Para os que apresentaram CrAg positivo em sangue e urina, foram submetidos a punção lombar para avaliação de CrAg no líquor RESULTADOS: Dos 109 pacientes, 67% eram do sexo masculino, 92% eram provenientes da área urbana e 76% eram procedentes do estado do Piauí. A média de idade foi de 35 anos, sendo 57% com idade entre 31-45 anos de idade. Cerca de 49,5% faziam uso irregular da terapia antirretroviral (TARV), 18% usavam corretamente a TARV e 32,5% eram virgens de tratamento. A prevalência de antigenemia criptocócica, foi de 8,2%. Daqueles pacientes com CrAg no sangue e urina positivos, em 3,6 % apresentava-se com CD4< 100 cél/mm3, 58,7% com CD4 100-199 cel/mm3 e 37,7% com CD4 \2265 200 cel/mm3. Os sintomas mais comuns nos pacientes com CrAg positivo foram cefaleia, febre e vômitos. CONCLUSÃO: O CrAg/LFA permite um exame simples, rápido e de baixo custo para o diagnóstico da criptococose e é recomendado para uso com soro, plasma, urina ou líquor em pacientes sintomáticos. O uso adequado da terapia antirretroviral contribui para uma redução da morbimortalidade dos pacientes com HIV/AIDS. Além disso, CrAg/LFA tem o potencial para identificar pacientes com infecção assintomática quem devem receber fluconazol profilático / Annually, cryptococcal meningitis causes approximately 15% of deaths related to AIDS. The cryptococcosis is a neglected disease. Nevertheless, it can be prevented by performing the screening by means of investigating the cryptococcal antigen (CrAg) and early treatment for a long period of detection or subclinical infection. Our study determined the prevalence of cryptococcal antigenemia taking into account the levels of CD4 lymphocytes and clinical symptoms. METHODS: All together, 109 patients with HIV / AIDS, agreed to participate in this study. Initially, there was a survey of patients\2019 socio-demographic data, in addition to clinical data from the medical record. The cryptococcal antigen test using Lateral Flow Assay (CrAg / LFA) in blood and urine was carried out in all patients included in the study, regardless of CD4 lymphocyte levels. Those who were CrAg positive for blood and urine underwent a lumbar puncture for CrAg assessment in the fluid RESULTS: From the 109 patients, 67% were male, 92% were from urban areas and 76% were from the state of Piauí. The average age was 35 years, 57% aged between 31-45 years old. About 49.5% made irregular use of antiretroviral therapy (ART), 18% correctly used the ART and 32.5% were treatment-naïve patients. The prevalence of cryptococcal antigenemia was 8.2%. From the patients tested positive for CrAg for blood and urine, 3.6% had CD4 < 100 cells/mm³, 58.7% had CD4 100-199 cells/mm³ and 37.7% had CD4 \2265 200 cells/mm³. The most common symptoms in patients with CrAg positive were headaches, fever and vomiting. CONCLUSION: CrAg / LFA allows a simple, fast and low cost test for the diagnosis of cryptococcosis and is recommended for use with serum, plasma, urine or fluid in symptomatic patients. The correct use of the antiretroviral therapy contributes to a reduction in morbidity and mortality of HIV / AIDS patients. Furthermore, CrAg / LFA have the potential to identify patients with asymptomatic infection who must receive prophylactic fluconazole

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:00:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318438.pdf: 1197690 bytes, checksum: d7b7c394fe8be0ae876dd221c456e73a (MD5) Previous issue date: 2013 / O intestino possui uma grande diversidade microbiana e parte desta é responsável por estimular os anticorpos os do Sistema ABO. Pacientes que possuem anticorpos anti-ABO no plasma podem apresentar uma diminuição da concentração plaquetária após a transfusão de plaquetas ABO não compatível, assim como hemólise de eritrócitos (incompatibilidade menor). Essa atividade hemolítica pode ser detectada através da titulação de anticorpos ABO ou através de testes de hemólise (Pesquisa de Hemolisina). Há inúmeros relatos de reações transfusionais ocasionadas por transfusões de hemocomponentes não isogrupo, destacando-se um que apontou como provável causa do aumento de títulos de anticorpos anti-ABO o uso de cápsulas de probióticos pelo doador. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi realizar um estudo clínico para avaliar o efeito do consumo de iogurte probiótico sobre os títulos de anticorpos contra antígenos ABO de voluntários correlacionando-os com a concentração fecal de bifidobactérias. Participaram do estudo 126 voluntários que consumiram diariamente uma unidade de iogurte contendo Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis pelo período de 30 dias.Antes e após o consumo do probiótico foram analisados os títulos de anticorpos anti-ABO, os resultados da Pesquisa de Hemolisina ABO, o pH e a concentração de bifidobactérias fecais.Entre os voluntários foi observada a frequência dos fenótipos ABO na proporção de 45% (57) do Grupo A, 9% (11) do Grupo B e 46% (58) do Grupo O. O percentual de amostras consideradas com altos títulos de anticorpos ABO em temperatura ambiente (TA) e em presença de antiglobulina humana (AGH) foi de 32,5% e 40,5% respectivamente, antes do consumo do iogurte. Após o consumo do probiótico os títulos aumentaram para 34,9% e 50,8%, respectivamente. Após o consumo do iogurte foi observada relação significativa entre a idade dos voluntários e o título de anticorpos Anti-B somente em TA, sendo que não houve relação significativa com anticorpos Anti-A. Os resultados sugerem que o uso de probióticos por indivíduos com mais de 40 anos pode manter elevado o título de anticorpos ABO.Após o consumo do iogurte contendo Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis evidenciou-se que os títulos Anti-B em TA reduziram e os títulos de Anti-A em AGH aumentaram significativamente.Também foi observada relação significativa entre a quantidade de bifidobactérias e o título de anticorpos Anti-B em AGH após o consumo de probióticos.No entanto,não foi evidenciada relação significativa entre a quantidade de bifidobactérias e o pH fecal antes ou após o consumo do probiótico. Evidenciamos que 65,1% das amostras não apresentaram alteração nos resultados de hemolisina, 29,4% passaram a ser consideradas Hemolisina Positiva e 5,6% passaram ser consideradas Hemolisina Negativa após o consumo de probióticos. Nossos resultados sugerem que a mudança alimentar da sociedade (como o aumento no consumo de produtos probióticos) possa influenciar na frequência de altos títulos de anticorpos contra antígenos do Sistema ABO. Assim, consequentemente, pode ocorrer uma diminuição dos hemocomponentes disponíveis para transfusão não isogrupo nas instituições hemoterápicas. / Abstract: Intestine has a large microbial diversity that is responsible for stimulates antibodies against ABO system. Patients with plasmatic ABO antibodies may exhibit a decreased platelet concentration after platelet transfusion ABO-mismatched, as well as hemolysis of erythrocytes (ABO-minormismatch). This hemolytic activity can be detected by titration of ABO antibodies or by hemolysis test (Hemolysin Test). There are numerous reports of transfusion reactions caused by transfusions of blood products ABO-mismatched. One study pointed out the probable cause of increased titer of ABO antibodies after use of probiotics capsules of by the donor. In this context, the aim of this study was to perform a clinical study to evaluate the effect of probiotic yoghurt consumption on antibody titers against ABO antigens correlating them with fecal bifidobacteria. The study included 126 volunteers who consumed a daily unit of yoghurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis for 30 days. Before and after probiotic consumption it were analyzed the titers of anti-ABO, the results of ABO hemolysin, fecal pH and concentration of bifidobacteria. Among volunteers, it was observed the frequency of ABO phenotype of 45% (57) from A Group, 9% (11) of B Group and 46% (58) of O Group. The percentage of samples considered with high titers of antibodies ABO at ambient temperature (AT) and in presence of human antiglobulin (AGH) was 32.5% and 40.5%, respectively, before the consumption of yoghurt. After consumption of probiotic the titers increased to 34.9% and 50.8%, respectively. After consumption of yoghurt it was observed a significant association between the age of volunteers and the titer of Anti-B antibodies only in TA, and there was no significant relationship with Anti-A antibodies. The results suggest that the use of probiotics for individuals over than 40 years old can maintain a high antibody titer ABO. After consumption of yoghurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis it was observed that the titers of Anti-B in TA reduced and Anti-A titers in AGH increased significantly. Was also a significant association between the amount of bifidobacteria and the titer of Anti-B antibodies at AGH after consumption of probiotics. However, no correlation was observed between the amount of fecal bifidobacteria and pH before or after consumption of probiotic. It was demonstrated that 65.1% of the samples had no change in the results of hemolysin, 29.4% became considered Hemolysin Positive and 5.6% became Hemolysin Negative after consumption of probiotics. Our findings suggest that the dietary change of society (such as the increase in the consumption of probiotics) may influence the frequency of high titers of antibodies against antigens of ABO system. So, consequently, there may be a decrease in blood components available for isogroup transfusion at institutions of hemotherapy.

Submitted by Gabriela Torres Rebech (gtr.torres@hotmail.com) on 2018-05-11T23:25:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Gabriela.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) / Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2018-05-14T17:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rebech_gt_me_araca_int.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T17:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rebech_gt_me_araca_int.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) Previous issue date: 2018-04-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose é uma doença imunossupressora causada por protozoários do gênero Leishmania, tendo os cães como reservatório doméstico. A molécula Programmed Cell Death 1 (PD-1) é altamente expressa em células leucocitárias de cães com leishmaniose visceral e promove a exaustão dos linfócitos T e a supressão da secreção de citocinas. Como o PD-1 tem função supressiva em relação à imunidade celular, avaliamos o efeito de anticorpos bloqueadores de PD-1 na produção de NO, ROS, interleucina 17 (IL-17) e na carga parasitária em cultura de leucócitos esplênicos de cães naturalmente infectados. In vitro, o bloqueio de PD-1 promoveu aumento dos níveis de NO intracelular e reduziu os de IL-17 no sobrenadante da cultura, além de reduzir a carga parasitária, más não alterou os níveis de ROS. Concluímos que a PD-1 participa na regulação da resposta imune e que o anticorpo bloqueador é efetivo na restauração da atividade microbicida do hospedeiro. Isso pode ser investigado em estudos imuno-terapêuticos no futuro. / Leishmaniasis is an immunosuppressive disease caused by protozoa of the genus Leishmania for which dogs are the domestic reservoir. The programmed cell death 1 molecule (PD-1) is highly expressed in leukocyte cells of dogs with visceral leishmaniasis, and it promotes T lymphocyte exhaustion and suppression of cytokine secretion. Because PD-1 has a suppressive function regarding cell immunity, we evaluated the effect of PD-1 blocking antibodies on NO, ROS and interleukin 17 (IL-17) production and on parasite load in spleen leukocyte cultures from naturally infected dogs. In vitro, PD-1 blocking promoted increased levels of intracellular NO and reduced the levels of IL-17 in the culture supernatant, in addition to reducing the parasite load, but do not change ROS levels. We conclude that PD-1 participates in regulation of the immune response and that the blocking antibody is effective in restoring host microbicidal activity. This can be investigated in an immuno-therapeutic study in the future.

Dengue fever is caused by an arbovirus of the Flaviridae family, transmitted from person to another through an intermediate fly vector, Aedes aegypti. It is a tropical and subtropical infectious disease characterized by fever and strong pain in joints, which could also lead to bleeding in its hemorrhagic form. In this investigation, Phage Display technology was used to identify recombinant peptides with affinity to polyclonal antibodies (IgY) raised in immunized chickens with total proteins of the DENV-3 culture. Animal sera was purified in a HiTrap column and concentrated through dialysis. The IgY s were immunoreactive against DENV cultures, but were not type specific. Phage clones were selected from a random peptide library (PhD-7) in four cycles of biopanning against IgY. Selected phages were amplified in deepwell microtiter plates and submitted to ELISA tests. Immunoreactive clones against IgY were sequenced, translated and analysed through bioinformatics. Fourteen distinct clones were selected and aligned against viral proteome sequences and among themselves. Three consensus sequences among phage clones were detected: VLRN, APP and LPP. The peptide search in BLASTp showed similarity to the following viral proteins: polyprotein, envelop, and the nonstructural proteins NS1, NS2a, NS3 and NS5. All of them have matched with DENV-1, -2, -3, and/or -4 sequences, corroborating with the lack of type specificity of the raised IgY. Considering the VLRN motif, the analyses of antigenicity indexes of similar peptides demonstrated that its antigenicity is highly influenced by neighboring residues. Three-dimensional analysis of the DENV-2 capsid protein, with the alignment of the VLRN motif, have identified two target sequences, NRVSTVQQL and EIGRMLNILNRR, that are present in the polyprotein of all four viral types, which may contain the two possible domains VxRN and LRN, respectively. Six selected phages have presented known protein domains, and five of them presented specific phosphorylation and glycosylation sites, similar to known eukaryotic viruses; however, they may not be physiologically active sites in the dengue virus. Finally, the peptides were used to detect human IgG and IgM. ELISA tests were performed in two patients with isolated infections of DENV-1 or DENV-3. The reactivity of the 14 clones was superior to total antigens obtained from cultures, but they were not type specific. / RESUMO - GERAL A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, transmitida de uma pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fêmea contaminada de um mosquito Aedes aegypti. A doença é causada por um arbovírus, membro da família Flaviviridae e do gênero flavivirus. Existem quatro tipos de vírus da dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e há um grande espectro de manifestações clínicas da doença, sendo as duas principais, a dengue clássica e a dengue hemorrágica. O diagnóstico geralmente é baseado em sintomas, e laboratorialmente é tardio, no entanto vários testes específicos para cada sorotipo. A tecnologia do Phage Display (exposição de biomoléculas em fagos) tem sido amplamente utilizada no mapeamento de epítopos de diversos antígenos, constituintes de vários agentes causadores de doenças. Com o objetivo de selecionar peptídeos recombinantes expressos no capsídeo de bacteriófagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente sensibilizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. Após 4 ciclos de seleção de uma biblioteca de fagos com peptídeos recombinantes lineares de 7 resíduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e suas seqüências de ácidos nucléicos foram posteriormente analisadas por bioinformática. Foi possível identificar domínios protéicos comuns entre os peptídeos, sendo que o principal domínio mapeado foi VLRN. Testes subseqüentes se fazem necessários para a melhor caracterização destes peptídeos, incluindo possíveis aplicações diagnósticas e vacinais dos peptídeos selecionados. RESUMO - CAPÍTULO I A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, transmitido de uma pessoa à outra através de um hospedeiro intermediário, o mosquito Aedes aegypti. É uma doença infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e dor intensa nas articulações, além de sangramentos intensos quando na sua forma hemorrágica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposição de peptídeos randômicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptídeos recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas imunizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diálise. As IgYs foram imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas não foram tipo específico. Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randômicos (PhD-7) por quatro ciclos de seleção contra as IgYs. Os fagos selecionados foram amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones imunorreativos contra IgY foram seqüenciados, traduzidos e analisados por bioinformática. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a seqüência de dados do proteoma viral e entre todos eles. Três seqüências consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por prováveis seqüências protéicas do vírus da dengue no BLAST mostrou similaridade a diversos sítios protéicos virais: poliproteína, envelope e as proteínas não-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com as seqüências dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as análises dos índices de antigenicidade dos peptídeos similares demonstraram que estes índices são altamente influenciados pelos resíduos vizinhos. Análise 3-D da proteína do capsídeo viral do tipo DENV-2, com superposição do motivo VLRN, identificou duas seqüências alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes na poliproteína dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois prováveis domínios, VxRN e LRN, respectivamente. Domínios de fosforilação e glicosilação, encontrados em vírus eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em cinco fagos recombinantes selecionados, o que não implica que estes motivos sejam fisiologicamente ativos no vírus da dengue. Finalmente, os peptídeos foram usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois pacientes com infecções isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14 clones foi superior àquela observada para antígenos totais obtidos das culturas, embora não tenha sido específica. / Mestre em Genética e Bioquímica

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-12T16:14:53Z No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / A primeira microepidemia pelo Trypanosoma cruzi na Amazônia brasileira foi publicada em 1969 e, desde então, outras têm sido observadas em famílias residentes em vários municípios dos Estados daquela região. Em 2007 e 2009 foram identificados casos clínicos de doença de Chagas aguda (DCA) em famílias dos municípios de Barcarena e Breves, Estado do Pará. Este estudo mostrou anticorpos da classe IgG contra antígenos do T. cruzi em 35,7% (39/109) das pessoas, sendo 29,5% (13/44), 26,6% (4/15), 20,6% (6/29), respectivamente, das famílias A, B, e C residentes no município de Barcarena, e em 76,1% (16/21) da família D do município de Breves; em 66,6% (14/21) dos casos dessa família foram identificados anticorpos IgM anti-T. cruzi. Os resultados de PCR com iniciadores de nDNA do parasito foram positivos em 76,1% (83/109) dos casos: Família A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8% e D, 57,1%. De grande interesse, em 21 casos de DCA o exame parasitológico positivo foi convalidado pela PCR com iniciadores de nDNA de T. cruzi. Ademais, nas células germinativas do sêmen foi confirmada infecção ativa pelo T. cruzi, também presente nas células somáticas do sangue, pela PCR com iniciadores específicos de nDNA e kDNA. Adicionalmente, 16,5% (18/109) casos positivos apenas para kDNA, sem a infecção ativa, retiveram seqüências de minicírculos integradas no genoma. Nesses 18 casos as mutações de kDNA foram transferidas para as progênies pela reprodução sexuada. Com esse respeito, a diferença de 53% (44/83) entre os resultados obtidos pela PCR para nDNA e aqueles dos testes imunológicos contra antígenos de T. cruzi tem importância epidemiólogica ainda não apreciada em outra investigação. Pois, a presença de nDNA e kDNA foi encontrada na ausência de anticorpos contra antígenos de T. cruzi nos hospedeiros tolerantes aos antígenos do parasito. Ademais, em todos esses casos de infecção ativa também ocorreu transferência vertical de seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada e as mutações foram prontamente identificadas no genoma humano. Então, a larga diferença entre os resultados de testes imunológicos e de PCR pode ser explicada pela aquisição da infecção via sexual ou transplacentária, durante a fecundação ou na fase inicial da gestação, antes do desenvolvimento do sistema imune do embrião, e o indivíduo nasce tolerante aos antígenos de T. cruzi. As mutações de kDNA foram identificadas nos cromossomos, e o principal sítio de integração foi retrotransposon LINE-1 em 70% (301/430) das quimeras identificadas. Em 83,3% (50/60) dos casos as mutações ocorreram no gene do receptor olfatório OR1-17, e em apenas 16,6% (10/60) foram encontradas em genes com outras funções reconhecidas. O achado mais relevante neste estudo foi a documentação de transmissão do kDNA e do nDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / By 1969, a microepidemic of Trypanosoma cruzi was recognized in the Brazilian Amazonia, and lately they have been constantly reported in families from several counties in the region. By 2007 and 2009, clinical cases of acute Chagas disease were identified in families living in counties of Barcarena and Breves, Estado do Pará. The exams revealed IgG antibodyes against T. cruzi antígens in 35,7% (39/109) cases of the study population: Family A, 29,5% (13/44); B, 26,6% (4/15); C, 20,6% (6/29) of Barcarena county, and Family D, 76,1% (16/21) of Breves; Anti-T. cruzi IgM antibody was identified in 66,6% (14/21) of family D cases. The PCR assays with specific nDNA primer sets yielded positive results in 76,1% (83/109) cases: Family A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8%; and D, 57,1%. Of interest, 21 cases showing symptoms of acute Chagas disease had parasitologic demonstration of T. cruzi and these were convalidated by the PCR assays with nDNA primer sets. Moreover, germline cells from male gametes showed T. cruzi nDNA and kDNA as well as somatic mononuclear cells from blood. Additionally, 16,5% (18/109) of kDNA positive cases in absence of active infection retained the minicircle sequences in the genome. In these cases the kDNA mutations were vertically transfered to progenie by sexual reproduction. With this respect, the reported differences 53% (44/83) between results of antibody assays and those obtained by PCR with primer sets to T. cruzi nDNA have broad epidemiologic importance not yet reported by previous investigation. The presence of nDNA and kDNA was documented in the absence of antibody against T. cruzi antigens in hosts’ immue tolerant to the parasite antigens. Furthermore, vertical transfer of T. cruzi minicircle occurs by sexual reproduction in every case nDNA and kDNA are present in the course of an active infection. Insofar, the reported differences herein can be explained by the acquisition of the infection during fecundation or in the early gestational period, via sexual transmissão or transplacenta from mother to offspring before embryo immune system development; and the newborn becomes tolerant to T. cruzi antigens. The kDNA mutations were identified in several chromosomes, and the main integration hotspot was LINE-1 in 70% (301/430) cases. The mutations entered at the olfactory ORI-17 gene in (50/60) cases (83,3%) and in (10/60) cases (16,6%) they were found in genes with annotated functions. A highly relevant finding in this study was the documentation of transmission of kDNA, and of nDNA from T. cruzi active infection by sexual reproduction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-28T15:56:09Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK) , cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de \"mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)\" obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular. / In the pregnant uterus of animals developing hemochorial type placentation occurs a transient migration and accumulation of natural killer lymphocytes (NK) which activity in the pregnancy has not been fully elucidated. These NK cells from uterine environment (uNK) present a distinct behavior from those found in the peripheral circulating blood (cNK), composing a subset of NK cells with specific gene expression that is regulated by pregnant uterus. Actually, these cells isolated from pregnant mice uteri were inoculated in the male mice of same strains, they induced immune response with production of antibodies reactivity specifically to uNK cells. In the present work it was used one of these mouse anti-mouse uterine natural killer cells clone 1 (mam-uNK1) monoclonal antibody that was obtained previously in our laboratory, in the aim to evaluate the specificity of this antibody and localization of corresponding antigenic molecule. It was used histological sections of uteri on 9º gestational day, lymphoid organs (spleen, thymus and lymph node), brain, liver and heart processed for immunocytochemistry with mam-uNK antibody at light microscopy and immunoelectron microscopy for uNK cells in pregnant uterus and cardiac muscle cells. Tissue homogenates from the same organs that were evaluated by immunocytochemistry were obtained to perform SDS-PAGE and Western-blot primary to identify the proteins fractions reactive with mam-uNK antibody and possible homology among the tissues. The immunolabeling pattern using mam-uNK both, in histological sections and Western-blot were compared with pattern of Dolichos biflorus (DBA) lectin reactions. The results showed diffuse positive reaction distributed in the cytoplasm with higher intensity on perimeter of uNK cells and diffuse labeling in the cytoplasm of decidual cells and, in smooth muscle cells of miometrium. Positive reaction was also found in the cytoplasm of cardiac muscle cells, reticular cells of lymphoid organs, hepatocytes and in the axon bundles of the brain. By immunelectron microscopy, were observed higher number of gold particles in the cytoplasm of microvillous-like cell processes and in the marginal cytoplasm near the plasma membrane of uNK cells. In the cardiac muscle cells the most conspicuous labeling was seen in the cytoplasm of muscle cells at the end portions, that is, where the myofibrills were less organized and anchoring to plasma membrane. The Western-blot identified two bands with 52 and 54 kDa reactive do mam-uNK constantly found in all organs analyzed. These data show that the molecule that is recognized by mam-uNK1 antibody is widely distributed in several cell types, not specific for mouse uNK cells, but has a very peculiar localization in these cells and in the cardiac muscle cells. To the localization pattern that was identified by immunelectron microscopy it was suggested that, these molecules were associated to the modulation of the cytoskeleton in many activities that these structural component potentially could carry out in the cells, being particularly attractive those related to cell motility.

O gene humano KIAA0090 mapeia uma região cromossômica (1p36.13) com freqüentes aberrações em cânceres humanos e é superexpresso em muitos tipos de tumores. É um gene altamente complexo cujas seqüências de cDNA oriundas de bases de dados públicas apóiam a existência de mais de 20 transcritos alternativos. Sua RefSeq prediz a codificação de uma proteína altamente conservada com 993aa, cujo ortólogo em S. cerevisae (ECM1) foi proposto recentemente atuar no enovelamento de proteínas transmembrana no retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi adquirir conhecimento sobre a localização e função da proteína KIAA0090, em células e tecidos normais e tumorais, bem como em células expostas a estresse. Geramos anticorpos policlonais (anti-K2) contra a metade C-terminal da proteína e comparamos seu padrão ao tratamento obtido com o anticorpo (anti-K1), previamente gerado contra a metade N-terminal. A proteína endógena foi localizada primariamente no Golgi e na mitocôndria, dependendo se o anticorpo utilizado foi contra a região N- ou C-terminal, respectivamente. Observamos também, embora menos notável, uma marcação sobreposta com a rede do RE e na margem celular, e variáveis graus de marcação dentro do núcleo e associada a pequenas partículas citoplasmáticas. A análise imunohistoquímica forneceu evidências que a KIAA0090 é ubiquamente epressa. O anti-K2 marcou estruturas semelhantes a Golgi em todo tipo celular, predominando assim naquelas com Golgi mais visíveis, como células secretórias. Observamos para a maioria dos tecidos uma marcação leve a moderada para o anti-K1, mas uma forte marcação foi encontrada em grupos restritos de células, como as células reticulares do timo, epitélio ductal das glândulas da língua e na lâmina basal do epitélio escamoso na zona de transição esôfago-gástrica. Em cortes histológicos de melanoma primário, observamos uma forte marcação para o anti-K1, principalmente em vasos e em células invasoras na margem do tumor, enquanto o anti-K2 mostrou um padrão sugestivo de infiltrado inflamatório e/ou células mesenquimais. Em tecidos de câncer de mama, vimos uma forte marcação nas células de carcinoma ductal em comparação ao epitélio ductal normal para o anti-K2, ao passo que o anti-K1, marcou fortemente vasos e células basais no epitélio de revestimento glandular, tanto no tecido normal como no tumoral. Utilizando uma matriz com amostras teciduais de câncer de mama obtidas de 96 pacientes, observamos uma marcação forte a moderada para o anti-K1 em 84% dos casos, enquanto 16% dos casos não apresentaram marcação. Notamos que os casos positivos para o anti-K1 estavam 100, 85 e 71% entre os casos de grade 1, 2 e 3, respectivamente, sugerindo uma tendência de perda da KIAA0090 associada à progressão do câncer de mama. Foi interessante notar que a brefeldina A e MG132 alteraram os níveis de RNAm da KIAA0090 e levaram à redistribuição da proteína endógena. Outros tratamentos de estresse, incluindo tunicamicina, complexo de rutênio doador de óxido nítrico e etoposídeo, também alteraram o padrão de distribuição da proteína. Este estudo fornece evidências preliminares que corroboram os resultados obtidos de estudos de expressão gênica em larga escala, fortalecendo os indícios de que a KIAA0090 desenvolve um papel na homeostase celular e está envolvida no câncer. / Human KIAA0090 gene maps to a chromosomal region (1p36.13) with frequent aberrations in cancer and is overexpressed in many tumor types. It is a highly complex gene with cDNA sequences in databases supporting the occurrence of more than 20 alternative transcripts. The RefSeq transcript is predicted to encode a highly conserved 993 aa transmembrane protein whose S. cerevisiae ortolog (EMC1) was recently proposed to function on transmembrane protein folding in the endoplasmic reticulum (ER). The aim of this work was to gain insight into the localization and function of KIAA0090 protein, in normal and tumor cells and tissues, as well as in cells exposed to stress treatments. We raised a polyclonal antibody (anti-K2) to the C-terminal half of the protein and compared its pattern of staining with an antibody (anti-K1) previously generated in our laboratory to the N-terminal half. The endogenous protein was primarily localized either to mitochondria or Golgi, depending whether the antibody used was to the N- or C-terminal, respectively. Also, less conspicuous staining overlapped with the ER network and cell margin, and variable degrees of labeling was observed within the nucleus and associated to small cytoplasmic particles. Immunohistochemistry survey provided evidence that the KIAA0090 protein is ubiquitously expressed. Anti-K2 labeled in a Golgi-like pattern in every cell type, predominating in those with more conspicuous Golgi, such as secretory cells. Faint to moderate anti-K1 staining was found in most tissues, but very strong staining was seen in restricted groups of cells, such as thymus reticular cells, ductal epithelium of salivary lingual glands and the basal layer of the squamous epithelium in the esophagus-gastric transition zone. In histological sections of primary melanomas, we observed a strong staining for the anti-K1, mostly in vessels and at the invasive tumor margin, while the anti-K2 showed a staining pattern suggestive of infiltrating inflammatory and mesenchymal cells. In breast tissues, stronger staining was seen in ductal carcinoma cells in comparison to normal ductal epithelium for anti-K2 antibody, whereas anti-K1 strongly marked vessels and basal cells in epithelia lining glandular ducts both in normal and tumor tissues. Using a tissue array of breast cancer samples obtained from 96 patients, we observed strong to moderate staining for anti-K1 in 84% of the samples and lack of staining in 16%, interestingly anti-K1 positive cases were 100, 85 and 71% among cases of grades 1, 2 and 3, respectively, suggesting a tendency of KIAA0090 loss associated with breast cancer progression. A positive correlation was found with estrogen receptor expression and the opposite for HER2. Interestingly, Brefeldin A and MG132 altered KIAA0090 mRNA levels and caused endogenous KIAA0090 protein to redistribute. Other stress treatments, including tunicamycin, a ruthenium complex nitric oxide donor and etoposide, also altered KIAA0090 distribution. This study supports the notion that KIAA0090 play a role in cellular homeostasis and is involved in cancer.

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O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos e apresenta uma multiplicidade de funções de regulação no corpo humano, tais como neurotrasmissão, vasodilatação, participa nas respostas imunes e em vários processos associados com o desenvolvimento dos tumores. Vários estudos fornecem evidências sobre as propriedades tumoricidas do óxido nítrico e doadores de NO que podem ser usados para o tratamento de tumores malignos e são objetos de interesse na atualidade. Baseado nisto o objetivo deste trabalho foi de sintetizar e descrever aspectos estruturais dos compostos [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = ácido 4,4\'-dicarboxi-2,2\'-bipiridina, bpy = 2,2\'-bipyridina) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = cloreto), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridina) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO], além de ensaios de citotoxicidade in vitro para alguns dos complexos sintetizados. Ensaios de citotoxicidade com solução aquosa de complexos rutênio-nitrosilo em linhagem de células metastáticas B16-F10 mostrou resultados relativamente baixos. Medidas de viabilidade celular mostrou que estes decrescem cerca de 10 % em relação ao controle. Este resultado foi interpretado como sendo devido a baixa interação entre o complexo e a célula. Bioconjugação de rutênio-nitrosilo com anticorpo policlonal IgG foi obtido por interação convalente e mostrou maior especificidade com um alvo na célula. Cromatografia de exclusão foi utilizada para separar o bioconjugado --IgG, que foi caracterizado por teste Western Blotting. Após a bioconjugação, o --IgG foi submetido a estudos de citotoxicidade com células metastáticas e a viablidade celular avaliada com ensaios MTT. Os resultados exibiram um incrível aumento na citotoxicidade de células B16-F10. Viabilidade celular foi determinada e valores de morte celular de cerca de 90 % obtida para uma das frações de --IgG. Nossos resultados demonstraram que o bioconjugado --IgG pode aumentar a resposta citotóxica e quiçá ser útil em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes and shows a multitude of regulatory roles in the human body, such as neurotrasmission, vasodilatation, immune responses and also participates in various processes associated with cancer development. Several studies provide evidences of the tumoricidal properties of NO donors that can be used for the treatment of malignant tumors and nowadays are objects of interest. Based on this the aim of this work was synthesize compounds that in a controlled manner can deliver NO in a biological process. The synthesis, structural aspects, and in vitro cytotoxic properties of [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = 2,2\'-bipyridine-4,4\'-dicarboxylic acid), 2\'-bipyridine; bpy = 2,2\'-bipyridine) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = chloride), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridine) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO] are described. Citotoxicity assays with aqueous nitrosyl ruthenium complex in metastatic B16-F10 cells displayed very little effect. Cell viability measurement showed decrease around 10 % in comparison to the control. It was associated due to the low interaction between nitrosyl ruthenium specie and the cell. Bioconjugation of nitrosyl ruthenium specie with polyclonal antibody IgG was achieved by covalent interaction and showed more specific interaction between bioconjugated and target cell. Exclusion chromatography was used to isolate --IgG conjugated, which was characterized by Western Blotting test. Following bioconjugation, the --IgG was submitted to cytotoxic studies with metastatic cells and the viability evaluated by MTT assay. The results displayed incredible increase of citotoxicity for B16F10 cells. Cell viability was achieved to decrease until to 90 % in comparison to the control when one fraction of --IgG was used. Taken together, the present findings demonstrate that the --IgG complex may elicit citotoxicity responses that may find useful applications in clinical therapy.