A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa (LDL-) é um importante antígeno envolvido na patogênese da aterosclerose. A LDL(-) provoca resposta inflamatória e imunológica, levando à produção de autoanticorpos anti-LDL(-) e a formação subsequente de imunocomplexos (IC-LDL-), os quais também contribuem com o processo aterosclerótico. Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de imunoensaios para quantificação plasmática de LDL(-), anti-LDL(-) e IC-LDL(-), assim como o desenvolvimento de ferramentas aplicáveis em um biossensor para LDL(-). Após a padronização de cada ELISA, foram avaliadas as características de desempenho dos métodos: limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão intra e inter-ensaios, exatidão, linearidade de diluição e interferentes. Os LD e LQ do ELISA para LDL(-) foram 0,423 mg/L e 0,517 mg/L de LDL(-), respectivamente. As concentrações plasmáticas de LDL(-) apresentaram linearidade quando os plasmas foram diluídos 1:1000, 1:2000, 1:4000 e 1:8000. Os LD e LQ do ELISA para anti-LDL(-) foram 0,0028 mg/L e 0,0032 mg/L de anti-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade na diluição quando diluídos 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800. Os LD e LQ do ELISA para IC-LDL(-) foram 0,023 g/L e 0,034 g/L de IC-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade quando diluídos 1:12,5, 1:25, 1:50 e 1:100. Os três ELISAs apresentaram precisão intra e inter-ensaios e recuperação dentro dos limites requeridos para imunoensaios. Para o desenvolvimento de um biossensor para LDL(-), uma proteína recombinante, denominada GFP5-scFv, foi expressa em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3). Para obtenção dessa proteína foi realizada a inserção da sequência de DNA de um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LDL(-) em um vetor bacteriano com a sequência de DNA da proteína verde fluorescente (GFP5). Dessa forma, a GFP5-scFv é fluorescente e tem afinidade pela LDL(-). Também foram sintetizadas nanopartículas de ouro, as quais podem ser eficientemente utilizadas na supressão da emissão da fluorescência de GFP5-scFv. Portanto, os imunoensaios validados e os aplicativos desenvolvidos para o biossensor são ferramentas que tem potencial para serem utilizadas na avaliação da patogênese da aterosclerose. / The electronegative low-density lipoprotein (LDL) is an important antigen involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The LDL(-) causes inflammatory and immune response, leading to production of autoantibodies anti-LDL(-) and the subsequent formation of immune complexes (IC-LDL), which also contribute to the atherosclerotic process. Thus, this study aimed to develop and validate immunoassays for quantification of plasma LDL(-), anti-LDL(-) and LDL-IC(-) as well as developing tools applicable to a biosensor for LDL(-). After the standardization of each ELISA, were evaluated the performance characteristics of methods: limits of detection (LD) and quantification (LQ), intra- and inter-assays precision, accuracy, linearity of dilution and interferences. The LD and LQ of LDL(-) ELISA were 0.423 mg/L and 0.517 mg/L of LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:1000, 1:2000, 1:4000 and 1:8000. The LD and LQ of anti-LDL(-) ELISA were 0.0028 mg/L and 0.0032 mg/L of anti-LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:100, 1:200, 1:400 and 1:800. The LD and LQ of IC-LDL(-) ELISA were 0.023 g/L and 0.034 g/L of LDL-IC(-), respectively. Plasma showed linearity when diluted 1:12.5, 1:25, 1:50 and 1:100. The three ELISAs showed good intra- and inter-assays precision and recovery within the limits required for immunoassays. To develop a biosensor for LDL(-), a recombinant protein, called GFP5-scFv was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) strain. The obtainment of this protein was performed inserting the DNA sequence of an anti-LDL(-) single chain variable fragment (scFv) in a bacterial vector with a DNA sequence of green fluorescent protein (GFP5). Thus, the scFv-GFP5 is fluorescent and has affinity for LDL(-). Were also synthesized gold nanoparticles, which can be efficiently used for quenching the fluorescence emission of GFP5-scFv. Therefore, immunoassays validated and developed applications for the biosensor are tools that have potential to be used in evaluating the pathogenesis of atherosclerosis.

As modificações das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são uma etapa essencial na aterogênese pois acarretam a geração de LDL eletronegativa [LDL(-)] que apresenta propriedades quimiotática, citotóxica, imunogênica e pró-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi a produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-LDL(-), a clonagem dos genes que codificam para as cadeias variáveis destes anticorpos, e sua expressão como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv). A LDL(-) isolada de plasma humano foi utilizada como antígeno para imunização de camundongos BALB/c. Após triagem dos clones, dois anticorpos monoclonais foram obtidos baseados em sua reatividade pela LDL( -) e não pela LDL nativa: 1A3H2 (1A3) e 2C7D5F10 (2C7). Os cDNAs codificante para a cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL), de ambos os anticorpos, foram obtidos por meio de RT-PCR utilizando bibliotecas de oligonucleotídeos que reconhecem todas os genes de domínios variáveis das famílias de VH e VL murinas. Os genes da VH e VL obtidos foram clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega®) e suas seqüências determinadas. A VH do anti-LDL(-) 1A3 pertence família J558.84 e fragmento gênico JH2, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A VH do anti¬-LDL(-) 2C7 pertence a família Vmu 3.2 (J558) e fragmento gênico JH4, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A partir disso, oligonucleotídeos sintéticos foram sintetizados a fim de clonar estes segmentos gênicos no vetor pPlgLE de expressão em Pichia pastoris. Foram realizadas três construções: o scFv 1A3, scFV 2C7 e um scFv híbrido (VH do 1A3 e VL do 2C7). Das três construções obtidas, conseguimos expressar o scFv do anti-LDL 2C7D5F10 que demonstrou ser capaz de reconhecer o antígeno. A proteína recombinante expressa tem grande potencial de ser usada no diagnóstico clínico incluindo imunoensaios in vitro e como reagentes para exames que envolvam a obtenção e análise de imagens. / Oxidative modification of low-density lipoproteins (LDL) is an essential step in atherogenesis, generating electronegative LDL [LDL(-)], which has chemotactic cytotoxic, immunogenic and proinflammatory properties. The aim of this study was the generation of anti-LDL(-) mAbs, the cloning of the genes that code for their variable domains and their expression as single-chain Fv (scFv). LDL(-) was isolated from human blood plasma and used as an antigen for immunization of Balb/c mice. Upon screening, two different mAbs were selected based on their ability to recognize LDL(-) and not native LDL: 1A3H2 (1A3) e 2C705F10 (2C7). The cDNAs that code for VH and VL were obtained by RT-PCR using specific immunoglobulin primer libraries wich recognize all VH and VL murine families. The VH and VL genes were cloned in pGEM-T Easy (Promega®) and sequenced. The anti-LDL(-) 1A3 uses a VH segment from J558.84 and a JH2 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. The anti-LDL(-) 2C7 uses a VH segment from Vmu 3.2 (J558) and a JH4 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. Oligonucleotides were synthetized and those gene segments were cloned in pPIGLE a Pichia pastoris immunoglobulin expression vector. We obtained three scFv constructions: scFV 1A3, scFv 2C7 and a husk hybrid, harboring 1A3 VH and 2C7 VL. Among those, we expressed the scFv anti¬-LDL(-) 2C7 that are able to recognize the antigen. The recombinant protein has a great potential for clinicai diagnostic applications, including in vitro immunoassays and as imaging reagents.

Evidências epidemiológica e imunológica sugerem que o desenvolvimento da imunidade natural contra doença meningocócica pode está associado com a reação cruzada de antígenos em comuns com Neisseria meningitidis e outras bactérias comensais, como Neisseria lactamica. O Objetivo deste trabalho foi de investigar a imunogenicidade de antígenos de vesículas de membrana externa (OMV) de N. lactamica, com ou sem a presença de Bordetella pertussis (BP), utilizada como adjuvante. Grupos de camundongos neonatos da linhagem BALB/c foram imunizados com antígenos de N. lactamica. Os resultados de nossos estudos mostraram o predomínio de altos títulos de anticorpos dos isótipos IgG e IgM com alta e intermediária avidez, depois das imunizações pela via (i.n) com N. lactamica. A análise do soro por immunoblot mostrou proteínas com reatividade cruzada entre as espécies do gênero Neisseria e os anticorpos monoclonais utilizados neste trabalho. Estes resultados sugerem que antígenos de N. lactamica e N. meningititdis em comum, possam ser importantes na imunidade natural contra doença meningocócica, e no desenvolvimento de vacina. / Immunological and epidemiological evidences suggest that the development of natural immunity to meningogoccal disease may be associated with crossreactive antigens together with Neisseria meningitidis and other commensal bacteria, like Neisseria lactamica. The present study aimed to investigate the immunogenicity of antigens of outer membrane vesicles (OMV) of N. lactamica with or without the presence of Bordetella pertussis (BP) used as an adjuvant. Groups of neonate BALB/c mice were immunized intranasally antigens of N. lactamica. The results of our studies showed the predominance of high titers of antibodies of IgG and IgM isotipes with high and intermediate avidity after intranasal immunization with N. lactamica. Immunoblot analysis of serum showed cross-reactivity proteins between the species of the gender Neisseria and the monoclonal antibodies used in this study. These results suggest that antigens of N. lactamica and N. meningitidis in common may be important in natural immunity against meningogoccal disease and in the development of vaccine.

O transplante de órgãos é hoje uma opção de tratamento de várias doenças terminais. Apesar de todos os progressos no campo do transplante, o principal problema enfrentado ainda é a rejeição. As principais moléculas responsáveis pela resposta alogeneica e subsequente rejeição ao enxerto, são os antígenos leucocitários humanos (HLA, do inglês Human Leucocyte Antigens). Porém, existem evidências que anticorpos dirigidos a antígenos não-HLA estão associados com rejeição de transplantes. Neste estudo, foi investigada a presença de anticorpos anti-célula endotelial (AACE) em 11 pacientes que perderam seus rins transplantados devido à rejeição humoral irreversível e em 2 com perda por trombose de veia renal. A ausência de anticorpos anti-HLA contra o doador foi verificada antes do transplante, da rejeição e antes e depois da transplantectomia, através da realização de provas cruzadas usando as técnicas mais sensíveis. Anticorpos não-HLA presentes em nove eluatos reagiram com EAHy.926. Eluatos positivos e negativos contra linhagem EAHy.926 foram testados contra cortes histológicos de 6 rins sadios para detecção de quais estruturas renais são reconhecidas por esses anticorpos. A reação foi avaliada pelo método de imunofluorescência indireta. Dos 13 eluatos testados, 4 (isotipo IgG) e 5 (isotipo IgM) reagiram com forte fluorescência nos glomérulos e endotélio arterial, mas não foi verificada reação na cápsula de Bowman e no epitélio tubular. Não foi observado polimorfismo na reatividade dos eluatos. Em onclusão, verificamos que os anticorpos não-HLA têm um importante papel na rejeição humoral. Estes estão reconhecendo antígenos de um sistema provavelmente não-polimórfico nas células de endoteliais presentes, principalmente, nos capilares glomerulares. / The transplant of organs is today an option of treatment to several terminal diseases. In spite of all the progress in the field of the transplants, the rejection remains a problem to be solved. The main target molecules for the allogenic response and subsequent allograft rejection are the human leukocyte antigens (HLA). However, there are growing evidences that non-HLA antibodies are associated with transplant rejection. In this study it was investigated the presence of anti-endothelial cell antibodies (AECA) in 11 patients who had early lost their transplanted kidney by irreversible humoral rejection and in 2 ones from renal venal thrombosis. The absence of anti-HLA antibodies against the donor was verified by the negativity of crossmatches performed using the most sensitive assays, at the transplant, at the rejection, and before and after the transplantectomy Antibodies from 9 eluates bound to EAHy.926. Positive and negatives eluates were tested against frozen sections from 6 normal kidneys in order to define the structures to which they were reactive. The reactivity was identified by indirect immunofluorescence method. From 13 eluates evaluated, 4 (isotipe IgG) and 5 (isotipe IgM) reacted to the glomerulus and renal arterial endothelium with intense fluorescence but they did not react to the Bowmans capsule and tubular epithelium. No polymorphism was observed in eluates reactivity. In conclusion, we have shown that non-HLA antibodies may represent a cause of the humoral rejection. These antibodies are probably recognizing antigens of a nonpolymorphic system in endothelial cells present, mainly, in the glomerular capillaries.

Diversos estudos têm evidenciado que as doenças inflamatórias estão fortemente ligadas à condição de estresse oxidativo. Dentre elas, uma das mais estudadas é a aterosclerose. A aterosclerose é uma doença de grande importância mundial, devido à alta mortalidade resultante de condições clínicas decorrentes da doença. Estudos demonstram que a modificação da LDL é um fator importante no desenvolvimento desta doença. Por isso, a determinação da LDLox plasmática é essencial, não apenas para investigar sua relevância para as doenças cardiovasculares, mas, também, como um auxiliar no diagnóstico destas doenças. A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox) induz à formação de epítopos imunogênicos na molécula. Contudo, o papel desses anticorpos na fisiopatologia da aterosclerose e o seu significado clínico permanecem indefinidos. O objetivo deste estudo foi produzir anticorpos anti-LDLox para uso em diagnóstico laboratorial de risco cardiovascular e também avaliar a associação entre a LDLox e o complexo formado entre o LDLox e o anticorpos anti-LDL na resposta inflamatória de macrófagos pela ativação da NADPH oxidase associada a proteína dissulfeto isomerase (PDI). A ativação da NADPH oxidase de macrófagos requer o acoplamento das subunidades citosólicas aos componentes de grânulos e translocação do complexo à membrana do fagossoma. A PDI é uma chaperona envolvida no tráfego protéico celular, sendo encontrada na superfície de diversas células procarióticas e eucarióticas. Trabalhos prévios sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsáveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o trânsito das subunidades até à membrana do fagossoma. Neste trabalho testou-se a atividade de Nox2 de macrófagos inflamatórios correlacionada à atividade redutase de PDI de membrana. Macrófagos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e não foi detectado consumo de oxigênio associado ao sistema Nox2. Sob estímulo de LDLox e do complexo LDLox/ anti-LDLox, os fagócitos consumiram quantidade significativa de oxigênio e apresentaram atividade de PDI, maior que as células dormentes. Testes com inibidores padrões de PDI (bacitracina e ácido ditionitrobenzóico- DTNB) confirmaram que a inibição de PDI determina decréscimo da atividade de Nox2, resultados obtidos através de ensaios espectrofotométricos (redução de citocromo c, 550 nm). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente à atividade de Nox2 em macrófagos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona está diretamente associada à ativação e/ou manutenção da atividade da oxidase fagocitária. / Inflammatory disorders are strongly associated with the condition of oxidative stress, and atherosclerosis is one of the most studied condition. Atherosclerosis is a disease of great world-wide importance due to the high mortality of decurrently clinical conditions of the illness. Studies have demonstrated that the modification of the LDL is an important factor in the development of the illness. Therefore, the determination of the plasma LDL-ox is essential not only to investigate its relevance for the atherosclerotic diseases, but also to contribute in the diagnosis of these illnesses. The oxidation of low-density lipoprotein (oxLDL) induces the formation of immunogenic epitopes in molecules. However, the role of these antibodies in the pathophysiology of atherosclerosis and their clinical significance remain undefined. Objective this study was produce antibodies anti-LDLox in the diagnosis of atherosclerotic diseases and evaluate the association between LDLox and complex LDLox/anti-LDLox in activation the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory macrophages. Protein disulfide isomerase is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). LDLox and complex LDLox/ anti-LDLox-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in macrophages, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the macrophages respiratory burst. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

O ligante de merozoítos de Plasmodium vivax em DARC nos eritrócitos é PvDBPII. Aqui, nós testamos se anticorpos naturalmente adquiridos contra PvDBPII conferem proteção para malária vivax clínica em indivíduos da Amazônia. Para tanto, foram realizados ensaios multiplex com 466 indivíduos revelando uma alta proporção de respondedores. Porém, nenhuma associação entre níveis de anticorpos anti-PvDBPII e atraso para o próximo episódio de malária vivax foi encontrad a. Dessas amostras, 27,8% mostraram alta atividade inibitória e a presença desses anticorpos foi associada com atraso no próximo episódio de malária vivax. Para produzir um painel de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-PvDBPII de indivíduos do Amazonas foi realizado um sorting de células B especificas de indivíduos com respostas inibitórias. Um desses mAbs competiu pelo mesmo sitio de ligação ou similar com anticorpos inibitórios naturalmente adquiridos. Em culturas P. vivax esse mAb foi capaz de reduzir a invasão de merozoítos em eritrócitos. / Merozoites of Plasmodium vivax has a critical parasite ligand (PvDBPII) that binds to DARC on erythrocytes. Here, we tested whether naturally acquired antibodies to PvDBPII conferred protection against clinical vivax malaria among rural Amazonians. We measured IgG antibodies from 466 individuals using a multiplex assay. A high proportion of samples tested had IgG antibodies to PvDBPII. However, found no association between high-level antibody response to PvDBPII and time to the next malaria episode. Of these samples, 27.8% displayed high blocking activity against PvDBP and these subjects had a statistically significant longer time to the next clinical P. vivax episode. To produce a panel of monoclonal antibodies (MoAbs) against PvDBPII from Amazon individuals, we sorted single PvDBPII-specific B-cell from subjects with BIAb responses. One of these MoAb generated recognizes PvDBPII and compete with naturally acquired antibodies from plasma samples to the same epitope recognized by MoAb. In short-term culture of Plasmodium vivax this Moab can reduced invasion.

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: Biossensores são aparelhos de análises que combinam componentes biológicos com detectores físico-químicos. É possível interpretar e disponibilizar os resultados de uma forma de fácil interpretação ao usuário ou até associá-los de forma automática a uma rede de dados. O termo internacional "biosensor" tem sido usado de forma crescente em publicações científicas desde 1980, demonstrando a importância e interesse científico mundialmente sobre este conceito. Em questão de mercados, há relatórios que indicam que biossensores movimentaram mais de 220 bilhões de dólares mundialmente ano passado. Point-of-care (POC) trata da ideia de se realizar atendimento e exames próximos ao paciente, trazendo como vantagem: diagnóstico mais rápido, preciso e menos propenso a erros ou troca de dados. Os biossensores são capazes de prover resultados em menor tempo além de possibilitar seu transporte até o paciente independentemente de onde esteja. O propósito deste trabalho é utilizar os anticorpos anti-hemoglobina do tipo A tipo B e tipo AB adquiridos no mercado, para desenvolver um imunossensor capaz de realizar a tipagem sanguínea de forma rápida, precisa e com resultados objetivos em plataformas digitais. No início a pesquisa se mostrou promissora pois a utilização de eletrodos de platina com pirrol foi capaz de fixar os anticorpos e o tempo de incubação para obtenção de resultados que diferenciassem os grupos sanguíneos foi definido em 10 minutos, o que é considerado um tempo adequado para ess... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

As modificações das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são uma etapa essencial na aterogênese pois acarretam a geração de LDL eletronegativa [LDL(-)] que apresenta propriedades quimiotática, citotóxica, imunogênica e pró-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi a produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-LDL(-), a clonagem dos genes que codificam para as cadeias variáveis destes anticorpos, e sua expressão como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv). A LDL(-) isolada de plasma humano foi utilizada como antígeno para imunização de camundongos BALB/c. Após triagem dos clones, dois anticorpos monoclonais foram obtidos baseados em sua reatividade pela LDL( -) e não pela LDL nativa: 1A3H2 (1A3) e 2C7D5F10 (2C7). Os cDNAs codificante para a cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL), de ambos os anticorpos, foram obtidos por meio de RT-PCR utilizando bibliotecas de oligonucleotídeos que reconhecem todas os genes de domínios variáveis das famílias de VH e VL murinas. Os genes da VH e VL obtidos foram clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega®) e suas seqüências determinadas. A VH do anti-LDL(-) 1A3 pertence família J558.84 e fragmento gênico JH2, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A VH do anti¬-LDL(-) 2C7 pertence a família Vmu 3.2 (J558) e fragmento gênico JH4, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A partir disso, oligonucleotídeos sintéticos foram sintetizados a fim de clonar estes segmentos gênicos no vetor pPlgLE de expressão em Pichia pastoris. Foram realizadas três construções: o scFv 1A3, scFV 2C7 e um scFv híbrido (VH do 1A3 e VL do 2C7). Das três construções obtidas, conseguimos expressar o scFv do anti-LDL 2C7D5F10 que demonstrou ser capaz de reconhecer o antígeno. A proteína recombinante expressa tem grande potencial de ser usada no diagnóstico clínico incluindo imunoensaios in vitro e como reagentes para exames que envolvam a obtenção e análise de imagens. / Oxidative modification of low-density lipoproteins (LDL) is an essential step in atherogenesis, generating electronegative LDL [LDL(-)], which has chemotactic cytotoxic, immunogenic and proinflammatory properties. The aim of this study was the generation of anti-LDL(-) mAbs, the cloning of the genes that code for their variable domains and their expression as single-chain Fv (scFv). LDL(-) was isolated from human blood plasma and used as an antigen for immunization of Balb/c mice. Upon screening, two different mAbs were selected based on their ability to recognize LDL(-) and not native LDL: 1A3H2 (1A3) e 2C705F10 (2C7). The cDNAs that code for VH and VL were obtained by RT-PCR using specific immunoglobulin primer libraries wich recognize all VH and VL murine families. The VH and VL genes were cloned in pGEM-T Easy (Promega®) and sequenced. The anti-LDL(-) 1A3 uses a VH segment from J558.84 and a JH2 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. The anti-LDL(-) 2C7 uses a VH segment from Vmu 3.2 (J558) and a JH4 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. Oligonucleotides were synthetized and those gene segments were cloned in pPIGLE a Pichia pastoris immunoglobulin expression vector. We obtained three scFv constructions: scFV 1A3, scFv 2C7 and a husk hybrid, harboring 1A3 VH and 2C7 VL. Among those, we expressed the scFv anti¬-LDL(-) 2C7 that are able to recognize the antigen. The recombinant protein has a great potential for clinicai diagnostic applications, including in vitro immunoassays and as imaging reagents.

Nas doenças difusas do tecido conjuntivo (DDTC) uma característica marcante é a produção de auto-anticorpos, com alta afinidade contra constituintes intracelulares e extracelulares, fazendo com que esses sejam marcadores específicos dessas doenças. No entanto, estes auto-anticorpos somente possuem significado clínico quando estão associados a outras manifestações de doença. A pesquisa de auto-anticorpos contra antígenos nucleares extraíveis (anti-ENA) é usada para identificação de um grupo desses auto-anticorpos que inclui o anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm e o anti-Scl-70. Os anti-ENAs podem ser detectados por diversos métodos, como contra-imunoeletroforese (CIE), western blot (WB), imunodifusão radial dupla (IDD), enzimaimunoensaio (ELISA) e hemaglutinação passiva (HA). Entretanto existe importante variabilidade nos resultados observados entre essas técnicas, pois elas divergem em sensibilidade e especificidade, e são escassos os estudos comparativos abordando o desempenho diagnóstico em DDTC. O presente trabalho tem como objetivo avaliar o desempenho diagnóstico dos métodos ELISA, HA e IDD na determinação de auto-anticorpos anti-ENA em DDTC. Em pacientes acompanhados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) com solicitação de pesquisa da presença de anti-ENA encaminhada ao Serviço da Patologia Clínica (SPC/HCPA), foi determinada a presença ou ausência dos auto-anticorpos pelos métodos de HA, ELISA e IDD. Foram calculados os parâmetros: sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, razão de verossimilhança positiva e negativa utilizando a presença ou ausência de DDTC como referência. O diagnóstico de uma DDTC era determinado por critérios diagnósticos específicos a partir da revisão do prontuário dos pacientes, realizada num período de 6 a 12 meses após solicitação do exame por um reumatologista cegado aos objetivos do estudo. Foram incluídas como DDTC: lúpus eritematoso sistêmico (LES), esclerose sistêmica (ES), síndrome de Sjögren primária (SSp), dermatomiosite (DM), polimiosite (PM), atrite reumatóide (AR) e doença indiferenciada do tecido conjuntivo (DITC). Encontrou-se uma alta prevalência de DDTC na amostra (69%), o que sugere boa adequação da solicitação do exame. O diagnóstico mais comum na amostra foi de LES 78/189 (41.3%). Sensibilidade e especificidade das técnicas para a presença de DDTC foram: ELISA 50% e 78,9%; IDD 31,3% e 89,5%; HA 40,9% e 87,7%. Os valores preditivo positivos foram: HA - 88,5%; IDD - 87,2% e ELISA - 84,6%. Os valores preditivo negativos foram: ELISA - 40,5%; HA - 39,1% e IDD - 36,2%. HA teve a razão de verossimilhança positiva mais alta 3,33 e ELISA teve a razão de verossimilhança negativa mais baixa 0,76. IDD, como esperado, teve menor sensibilidade para detectar DDTC, ao contrário da ELISA (mais sensível). Baseado resultados semelhantes dos valores preditivos (positivo e negativo), nós acreditamos que, ao menos em uma moderada a alta probabilidade pré-teste, que é a recomendada para solicitar esse teste, não há diferença significativa na interpretação do resultado dentre os métodos estudados. / Autoantibodies produced against cellular components are a hallmark of autoimmune connective tissue diseases (CTDs), being specific markers of these diseases. However these autoantibodies are clinically useful only when associated with other disease manifestations. Testing for autoantibodies to extractable nuclear antigens (ENAs) is used to identify a group of autoantibodies which includes anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm e o anti-Scl-70. Anti-ENA antibodies can be detected by several methods like, counterimmunoelectrophoresis (CIE), immunoblot (IB), double immunodifusion (DID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and passive haemagglutination (HA). However there is an important variability in results observed between theses techniques, because they diverge in sensitivity and specificity, and there are few comparative studies evaluating their diagnostic performance for CTDs. The aim of the present study was to evaluate the performance of DID, ELISA and HA for anti-ENA antibodies detection in patients CDTs. Testing for the presence of anti-ENA antibodies was performed by HA, ELISA and DID in sera from patients followed in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre with a request from the attending physician sent to the Clinical Pathology Service of HCPA (SPC/HCPA). Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and positive and negative likelihood ratios (LR) were calculated using the presence or absent of a CTD as reference. Presence of a CTD was determined by chart review by diagnosis criteria, performed between 6 and 12 months after the test was ordered by a rheumatologist blinded to study objectives. As a CTD were included the following diseases: systemic lupus erythematosus (SLE), Sjögren’s syndrome (SS), dermatomyositis/polymyositis (DM/PM)(1), systemic sclerosis (SSc), rheumatoid arthritis (RA) and undifferentiated connective disease (UCTD). We found 69% of the patients having a CTD, which points to an adequate test ordering by the attending physicians. SLE was the most common clinical condition, present in 78 of the 189 patients studied (41.3%). Sensitivity and specificity of the techniques for the presence of CTD were: ELISA 50% and 78.9%; DID 31.3% and 89.5%; HA 40.9% and 87.7%. Positive predict values were: HA – 88.5%; DID – 87.2% and ELISA – 84.6%. Negative predict values were: ELISA – 40.5%; HA – 39.1% e IDD – 36.2%. HA had the highest positive LR (3.33), while ELISA had the lowest negative LR (0.63). DID, as expected, had a low sensitivity to detect ARD, in contrast with ELISA, which was the most sensitive, but least specific. Based on the very similar predictive test values (PPV and NPV), we believe that, at least in a moderate to high pre-test probability - which is the recommended situation for ordering a diagnostic test - there are no significant differences on the interpretation of test results when using ELISA, HA and DID for ENA detection.