Chez la majorité des eucaryotes, les petits ARN (miRNA et siRNA) jouent des rôles essentiels au cours du développement, dans les réponses adaptatives aux stress, et dans la maintenance de la stabilité génétique. Les plantes codent quatre enzymes RNaseIII de type DICER-LIKE (DCL). DCL1, produit les miRNAs, tandis que DCL2, DCL3 et DCL4 produisent des siRNAs des tailles diverses. Les plantes codent également des enzymes appelées RNASE-THREE-LIKE (RTL) auxquelles il manque certains domaines spécifiques aux DCLs, et dont la fonction est largement inconnue.Des plantes sur-exprimant RTL1 montrent des défauts morphologiques, et n'accumulent pas les siRNAs produits par DCL2, DCL3 ou DCL4, indiquant que RTL1 est un suppresseur général des voies de siRNA chez les plantes. L’activité de RTL1 nécessite un domaine RNaseIII fonctionnel. RTL1 ne s'exprime naturellement que faiblement dans les racines, mais l'infection virale induite fortement son expression dans les feuilles, ce qui suggère que l’induction de RTL1 est une stratégie générale utilisée par les virus pour contrer la défense antivirale basée sur siRNAs. En accord avec cette hypothèse, les plantes transgéniques sur-exprimant RTL1 sont plus sensibles à l'infection par le TYMV que des plantes de type sauvage, probablement parce que RTL1 empêche la production des siRNAs dirigés contre les RNA viraux. Cependant, les plantes transgéniques sur-exprimant RTL1 ne sont pas plus sensibles à l'infection par le TCV, TVCV ou le CMV, qui codent les suppresseurs de RNA silencing (VSR) plus puissants que le TYMV. En effet, le VSR de TCV inhibe l'activité de RTL1, suggérant que l'induction de l’expression de RTL1 par les virus et l’amortissement de l’activité de RTL1 par leurs VSRs est une double stratégie permettant d’établir une infection avec succès. Des plantes sur-exprimant RTL2 ou des mutants rtl2 ne montrent aucun défaut morphologique, et ne montrent pas de changement majeur du répertoire des petits ARNs endogènes. Toutefois, la sur-expression de RTL2 augmente l’accumulation des petits ARNs exogènes dans des essais d’expression transitoire, et cette activité nécessite un domaine RNaseIII fonctionnel. Il est donc possible que RTL2 clive certains substrats pour faciliter l’action des enzymes DCL. / Small RNAs, including miRNA and siRNA, play essential regulatory roles in genome stability, development and stress responses in most eukaryotes. Plants encode four DICER-LIKE (DCL) RNaseIII enzymes. DCL1 produces miRNAs, while DCL2, DCL3 and DCL4 produce diverse size classes of siRNA. Plants also encode RNASE THREE-LIKE (RTL) enzymes that lack DCL-specific domains and whose function is largely unknown. Arabidopsis plants over-expressing RTL1 exhibit morphological defects and lack all types of small RNAs produced by DCL2, DCL3 and DCL4, indicating that RTL1 is a general suppressor of plant siRNA pathways. RTL1 activity requires a functional RNaseIII domain. RTL1 is naturally expressed only weakly in roots, but virus infection strongly induces its expression in leaves, suggesting that RTL1 induction is a general strategy used by viruses to counteract the siRNA-based plant antiviral defense. Accordingly, transgenic plants over-expressing RTL1 are more sensitive to TYMV infection than wild-type plants, likely because RTL1 prevents the production of antiviral siRNAs. However, TCV, TVCV and CMV, which encode stronger suppressors of RNA silencing (VSR) than TYMV, are insensitive to RTL1 over-expression. Indeed, TCV VSR inhibits RTL1 activity, suggesting that inducing RTL1 expression and dampening RTL1 activity is a dual strategy used by viruses to establish a successful infection. Plants over-expressing RTL2 and rtl2 mutants do not exhibit morphological defects and do not show major changes in the endogenous small RNA repertoire. However, RTL2 over-expression enhances the accumulation of exogenous siRNAs in transient assays, and this activity requires a functional RNaseIII domain. Therefore, it is possible that plant RTL2 processes certain substrates to facilitate the action of DCL enzymes.

L’expression des gènes mitochondriaux est grande partie dirigée par des protéines codées dans le noyau et importées dans l’organite depuis le cytosol. Diverses études ont montré que les protéines de la famille PentatricoPeptide Repeat (PPR) jouent un rôle prépondérant et varié dans ce phénomène. Au cours de ma thèse, j’ai déterminé la fonction de deux nouvelles protéines PPR chez Arabidopsis thaliana, nommées MTSF1 (pour Mitochondrial Stability Factor 1) et PPR24. Chacune de ces protéines est impliquée dans l’expression d’un ARNm mitochondrial codant une sous-unité du complexe I de la chaine respiratoire. J’ai montré que la protéine MTSF1 était requise pour stabiliser l’ARN mitochondrial nad4. Le site de liaison de MTSF1 a été déterminé et il correspond aux vingt derniers nucléotides de l’ARN nad4. Nous pensons donc qu’en s’associant à l’extrémité 3’ terminale de cet ARN, la protéine MTSF1 bloque la progression d’exoribonucléases 3’-5’ et stabilise ainsi l’ARN nad4 in vivo. L’étude de la protéine PPR24 nous a conduit à observer qu’elle était essentielle à la traduction de l’ARNm mitochondrial nad7. J’ai pu démontrer que la protéine NAD7 n’était pas synthétisée chez les mutants ppr24 et que cela était associé à l’absence de ribosomes sur l’ARNm nad7. J’ai aussi montré que la protéine PPR24 pouvait se lier spécifiquement à une courte région située au milieu de la 5’ UTR de l’ARN nad7. La modélisation de la 5’ UTR de cet ARN indique que ce site de liaison se situerait à la base d’une structure en tige-boucle pouvant diminuer fortement l’accessibilité au codon initiateur de la traduction de l’ARN nad7. Il est donc possible que la fixation de la protéine PPR24 puisse déstabiliser cette structure en tige-boucle et permettre aux ribosomes mitochondriaux d’accéder plus facilement au codon AUG. L’ensemble de ces études a permis d’apporter des informations essentielles sur la fonction et le mode d’action des protéines PPR dans l’expression génétique mitochondriale chez les plantes. / Gene expression in mitochondria is for the most controlled by nuclear encoded proteins that are from the cytosol into the organelle. Recent genetic and biochemical analysis have revealed that proteins of the PentatricoPeptide Repeat (PPR) family play preponderant and multifarious role in this process. During my thesis, I characterized the function of two novel Arabidopsis thaliana PPR protein called MTSF1 (for Mitochondrial Stability Factor 1) and PPR24. Each of these proteins is involved in the expression of a single mitochondrial gene encoding respiratory complex I subunit. I showed that the MTSF1 protein is essential for the stabilization of nad4 mRNA. The MTSF1 binding site was determined and was shown to correspond to the last twenty nucleotides of nad4 3’ UTR. We propose that, through an interaction with the extremity of nad4 transcript, the MTSF1 protein blocks the progression of 3’ to 5’ exoribonucleases and protects nad4 mRNA from degradation in vivo. PPR24 analysis indicated that this PPR protein is essential for nad7 mRNA translation. I observed that the NAD7 protein is not produced in ppr24 mutants and that this correlated with lack of ribosome loading of nad7 mature mRNA. I also showed that PPR24 binds to a short RNA fragment with high specificity located in the center of nad7 5’ leader. Structural predictions indicated that PPR24 binding site could correspond to the basis of a long stem-loop RNA structure just upstream of the AUG codon, which could prevent the accessibility to the nad7 translation codon. PPR24 binding could destabilize this stem-loop structure and permit a better access of the ribosome to the nad7 translation initiation codon. These findings shed light on the function and the mode of action of PPR proteins involved in mitochondrial gene expression in plants.

La machinerie d'assemblage HSP90/R2TP est impliquée dans la biogenèse de complexes essentiels à l'expression génique et à la croissance cellulaire. Le complexe est constitué des protéines PIH1D1, RPAP3 et des AAA+ ATPases RVB1 et RVB2. Le R2TP, via son adaptateur NUFIP, permet l'assemblage de complexes ribonucléoprotéiques tels que les snoRNP à boîtes C/D, et le snRNP U4, tous deux impliqués respectivement dans la maturation des ARNr et ARNm. Le mode d'action du R2TP dans ces processus n'était pas bien compris. Pour étudier cela, une approche de protéomique, avec des tests d'interaction ARN/protéine et protéine/protéine, ainsi qu'une approche structurale, ont été utilisés. Un nouveau modèle a ainsi été établi. Le R2TP permettrait de former des pré-complexes d'assemblage contenant les protéines cœurs du complexe RNP avec des facteurs d'assemblage mais sans l'ARN. Les protéines RVB se détacheraient du R2TP pour rester associées à ce pré-complexe d'assemblage, par la suite, elles permettraient de le stabiliser tout en y incorporant de nouvelles protéines cœurs, et en relargant des facteurs d'assemblage ayant déjà accompli leur fonction dans le processus de biogenèse. Cette fonction de chaperon moléculaire des complexes en cours d'assemblage est très probablement régulée par hydrolyse de l'ATP par les ATPases RVB, et ceci sous le contrôle de co-facteurs, comme potentiellement la protéine BCD1. Dans le cas de l'assemblage des C/D snoRNP, il a été établi un modèle d'assemblage dans lequel le rôle des différents facteurs d'assemblage peut être prédit. ZNHIT3 aurait un rôle dans l'incorporation du snoARN naissant dans le pré-complexe, et NUFIP permettrait de garder la particule immature dans une conformation inactive afin de faciliter l'obtention de la structure active du snoRNP grâce aux RVB. Avec les travaux sur la biogenèse de la particule U4, il a été mis en évidence l'existence d'un pré-complexe cytoplasmique contenant PRP31/NUFIP/R2TP/complexe SMN qui serait important pour l'assemblage de la snRNP U4 avec non seulement les protéines Sm, mais aussi la protéine PRP31. / The HSP90/R2TP machinery is involved in the biogenesis of essential complex for gene expression and cell growth. The complex consists of proteins PIH1D1, RPAP3 and the AAA+ ATPases RVB1 and RVB2. The R2TP, via its NUFIP adaptator, allows assembly of ribonucleoprotein complexes like box C/D snoRNP, and the U4 snRNP, both involved in the maturation of mRNA and rRNA respectively. The mode of action of R2TP in these processes is not well understood. In this study, a proteomic approach, with tests of interaction RNA/protein and protein/protein and a structural approach, were used. A new model has been established. The R2TP would form an assembly pre-complex containing RNP core proteins with assembly factors but not RNA. RVB proteins detach from R2TP to remain associated with the assembly pre-complex, and then, would stabilize it while incorporating new core proteins. They would also release assembly factors that already have accomplished their function in the biogenesis process. This function of molecular chaperone complex during assembly is most likely regulated by ATP hydrolysis by the RVB ATPases, and this under the control of co-factors as potentially BCD1 protein. In the case of the assembly of box C/D snoRNP, it was established an assembly model in which the roles of the various assembly factors can be predicted. ZNHIT3 has a role in the incorporation of the nascent snoRNA in the pre-complex and NUFIP would keep the immature particle into an inactive conformation to facilitate the formation of the active structure of the snoRNP through RVB. With the study of the biogenesis of the U4 particle, it was revealed the existence of a cytoplasmic pre-complex containing PRP31/NUFIP/R2TP/SMN complex that would be important for the assembly of the U4 snRNP with not only Sm protein but also the PRP31 protein.

En réponse à son environnement composé de signaux endogènes et exogènes, une cellule doit pouvoir adapter son transcriptome, et cela à travers une modulation fine de l'expression de ses gènes. Les mécanismes permettant une telle adaptation reposent sur de multiples paramètres, entre autre l'organisation du génome, que ce soit au niveau de sa séquence primaire ou de son organisation au sein de la chromatine qui est un support pour l'intégration de nombreuses informations (structurelles et épigénétiques). De plus, l'organisation tridimensionnelle du noyau cellulaire apporte des contraintes physiques et fonctionnelles qui contribuent également à ces régulations. Afin de comprendre comment toutes ces informations peuvent être intégrées lorsqu'un signal régule la transcription d'un ensemble de gènes colinéaires («cluster» de gènes), nos études se sont focalisées sur la description et dissection des mécanismes impliqués dans la régulation coordonnées de gènes œstrogéno-dépendant par le récepteur aux œstrogènes (ER) et ses facteurs pionniers (FOXA1, FOXA2 et GATAs) dans des cellules cancéreuses d'origine mammaire. Dans ce cadre, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au cluster TFF, situé sur le bras long du chromosome 21, incluant le gène modèle TFF1, en utilisant des techniques d'analyse à grande échelle (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C et analyses transcriptomiques). / A given cell has to be able to adapt its fate and homeostasis in response to endogenous and exogenous signals. This adaptation occurs through finely tuned regulations of genes' expressions leading to the variation of their transcriptomes. Multiple parameters have to be integrated in order to provide such mechanisms of regulation. First, the primary sequence of the genome and its organization into chromatin are major regulatory components that harbor genetic, structural and epigenetic information. Second, the three-dimensional organization of the genome into the nucleus brings both physical and functional constraints that also contribute towards these regulatory processes. Here, we engaged a work aiming to understand and dissect how these several levels of information are integrated during the transcriptional regulation of colinear genes (cluster of genes) by the same signal. We took as a model the coordinated regulation of the estrogen-sensitive TFF cluster driven by the estrogen receptor (ER) and its pioneering factors (FOXA1, FOXA2 and GATAs) in mammary cancer cells. This cluster is located within the long arm of the chromosome 21, and contains the gene model termed TFF1. We used large-scale methods (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C and microarray transcriptomic analyses) to decipher these dynamic mechanisms.

Comme pour la plupart des virus à ARN+, le VHC induit des remaniements membranaires appelés membranous web. Les protéines non structurales virales formant le complexe de réplication du virus sont associées à ces membranes néosynthétisées. La compréhension de la mise en place de ces membranes cellulaire est encore actuellement mal connue. Afin d’étudier ce phénomène, nous avons dans un premier temps sélectionné des clones cellulaires Huh7.5 hébergeants un réplicon sous-génomiquedu virus. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la présence d’un réseau multivésiculaire semblant provenir de l’induction de mécanismes d’autophagie. Plus récemment l’utilisation du modèle de propagation du virus complet nous a permis de mieux caractériser ce réseau multivésiculaire en déterminant trois sous réseaux vésiculaires structuralement différents. L’analyse de cette étude est effectuée principalement par microscopie électronique avec des techniques innovantes tels que la reconstruction tridimensionnelle et des immunogolds. / As other RNA viruses, HCV induces membrane alterations termed membranous web and its nonstructural proteins forming the viral replication complex are associated to these neo-synthesized membranes. The mechanism underlying these host cell membranes alterations is still currently unknown. To investigate this mechanism, we initially selected Huh7.5 cells clones harbouring a HCV subgenomic replicon. We were able to demonstrate the presence of a multivesicular network apparently linked to the autophagy induction mechanisms. More recently, using the cell culture-adapted HCVsystem, we better characterized this network by determining three multivesiculars vesicles structurally different subnets. This study was carried out mainly by performing electron microscopy observations,with using innovative techniques such as three-dimensional reconstruction and immunogold.

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif. / Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique. / In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome.

Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivo. / Recent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells.

L’inactivation d’un des deux chromosomes X dans les cellules d’organismes femelles permet d’assurer un taux similaire des transcrits des gènes liés aux chromosomes X entre les deux sexes. L’ARN non codant Xist d’environ 17000 nts joue un rôle central dans ce processus. Il habille le futur chromosome X inactivé et induit la mise en place de modifications épigénétiques qui permettent d’éteindre l’expression des gènes. Une région d’approximativement 500 nts située à l’extrémité 5’ de l’ARN Xist est nécessaire à l’initiation de l’inactivation. Cette région appelée region des A-repeats contient 8 répétitions d’une séquence de 24 nucléotides. La délétion de cette région provoque un défaut d’inactivation, ce qui souligne son importance dans le processus. Etant donné que la fonction d’un ARN est bien souvent conditionnée par sa structure 2D, mon travail de thèse a consisté à réaliser l’étude expérimentale de la structure 2D de la région des A-repeats, ceci en utilisant des sondes de la structure secondaire des ARN en solution et une méthode de FRET. Nous avons montré que la région des A-repeats se structure selon 2 grandes structures tige-boucle irrégulières formées par l’appariement 2 à 2 des éléments répétés. Par purification des RNP et identification de leurs protéines, nous avons démontré que le complexe PRC2, impliqué dans la mise en place des marques épigénétiques du Xi, se lie à la région des A-repeats. Nous avons également identifié un grand nombre d’autres protéines pouvant avoir un rôle dans l’activité de la région des A-repeats (PTB, KSRP, Sam68, Vigiline, RHA, TIAR, DEK, H1, BRML1, Rod1, Lin28). Leurs implications dans l’inactivation du chromosome X est en cours de vérification. / Silencing of one X chromosome (XCI) in cells of mammalian female ensures sex chromosome dosage compensation between male and female. The 17kb Xist ncRNA plays an essential role in XCI. Its spread along the future inactivated X chromosome is associated with major modifications of the epigenetic status of this chromosome, including histone H3K27 methylations mediated by PRC2 complex. One key part of Xist necessary for XCI initiation is the phylogenetically conserved A region. It lies at the 5’ end of the Xist molecule and contains 8 of a 24-nucleotides motif. Female mouse embryos carrying a mutated Xist deleted for the A region are selectively lost during embryogenesis, which underlines the importance of this element. We performed the first experimental analysis of the structure of the entire A region in solution. By the use of chemical and enzymatic probes and FRET experiments, using oligonucleotides carrying fluorescent dyes, we established a 2D structure for the A region that contains two long stem-loop structures each including 4 repeats which interact together two by two. By immunoprecipitation assays and mass spectrometry analysis, we identified the protein partners of the A region. We demonstrated that the A region associate with PRC2 components which is responsible for the apposition of epigenetic modifications of X inactive chromosome. Others proteins which would have a role in A region function were also identified (PTB, KSRP, Sam68, Vigiline, RHA, TIAR, DEK, H1, BRML1, Rod1, Lin28).

Afin de se répliquer, les rétrovirus doivent disposer à la fois d’ARN épissés et non épissés. Chez le virus du Sarcome de Rous (RSV), l’accumulation de l’ARN non épissé dépend de l’élément NRS (Negative Regulator of Splicing). L’élément NRS est un élément bipartite. Sa région 5’ est assimilée à une séquence ESE (Exon Splicing Enhancer) à laquelle se fixent de nombreuses protéines SR tandis que sa région 3’ contient un pseudo-site 5’ non fonctionnel qui constitue un leurre qui est responsable de l’inhibition de l’épissage à l’unique site 5’ fonctionnel du virus. Seule la structure 3D de la partie 3’ du NRS qui contient le pseudo-site a été expérimentalement établie. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure 2D de la totalité de l’élément NRS à l’aide de sondes chimiques et enzymatiques. La comparaison de cette structure expérimentale à celles que nous avons établies pour d’autres éléments NRS mutants fonctionnels et non fonctionnel ainsi qu’à celles théoriques de la totalité des virus aviaires séquencés argumente en faveur de la forte signification biologique de notre modèle. Des expériences d’épissage in vitro réalisées sur l’élément NRS sauvage ainsi que ses formes tronquées ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de deux structures tige-boucles dans la fonction du NRS. Les expériences de purification de complexes formés avec un extrait nucléaire de cellules HeLa sur ces différents éléments NRS par des techniques chromatographie d’affinité ont permis de démontrer l’importance de l’association de ces deux structures tige-boucles avec les protéines SR et la snRNP U1. Nous avons défini un nouvel élément NRS minimal fonctionnel capable d’inhiber l’épissage et nous avons démontré l’activation de l’inhibition de l’épissage de l’élément NRS par la protéine 9G8 in vitro et in cellulo / Retroviruses require both spliced and unspliced RNAs for productive replication. Accumulation of unspliced RNA in Rous Sarcoma Virus (RSV) depends on the NRS element, (Negative Regulator of Splicing). The NRS element is bipartite. Its 5’ terminal part is considered as an ESE that binds SR proteins and its 3’ part contains a decoy 5’-splice site (ss), which inhibits splicing at the bona fide 5’ ss. Only the 3D structure of a small NRS fragment including the decoy 5’ ss had been experimentally studied. Here, by chemical and enzymatic probing of entire RSV NRS, we determine its 2D structure. By comparative analysis of 2D structures of functional and non-functional avian NRS variants and of all sequenced avian NRSs, we bring strong arguments for a biological significance of the established structure. By in vitro splicing assays, we show a crucial role of two of the established stem-loop structures and by affinity purification of complexes formed by WT and truncated NRSs in HeLa cell nuclear extract, we demonstrate their importance for SR protein and U1 snRNP association. We define a new small NRS element retaining splicing inhibitory properties and finally demonstrate the capability of the SR protein 9G8 to increase NRS activity in vitro and in cellulo