Les pathologies cardiovasculaires sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde aujourd’hui, dont plus de la moitié trouve son origine dans des anomalies rythmiques. Les phénomènes de dépolarisation et de repolarisation rythmiques des cardiomyocytes, à l’origine de l’activité contractile rythmique du myocarde, mettent en jeu des processus cellulaires consommateurs d’énergie et les mitochondries,. Dans cette thèse, la régulation de la fonction mitochondriale a été étudiée lors de l’induction d’arythmies ventriculaires sur coeurs isolés perfusés de rats. Les résultats montrent que l'évolution de la consommation d’oxygène du myocarde est un paramètre important dans la réponse aux arythmies. L’inhibition des myosines ATPases par la blebbistatine induit sur la durée une diminution de la susceptibilité vis-à-vis des arythmies. Les acteurs impliqués dans les différents types de réponses mitochondriales ont été caractérisés sur fibres perméabilisées. Nous montrons que la régulation de la fonction mitochondriale varie en fonction de la chambre cardiaque considérée. Les mesures de Km de la respiration mitochondriale, ainsi que l’étude des principaux mécanismes de transfert énergétiques, mettent en évidence des différences marquées entre les différentes chambres cardiaques. .Les résultats de nos travaux suggèrent que le remodelage myocardique observé en réponse aux modifications de charge, et/ou lors du développement des pathologies du myocarde sont susceptibles de favoriser la constitution d’un substrat arythmogène, propre à chaque chambre, et impliquant des perturbations des mécanismes de transfert énergétique. / Cardiovascular disease is the first cause of mortality in the whole world. Half of this mortality is due to heart failure, a progressive deterioration of cardiac contraction, which can be caused by electrical dyssynchrony. Implication of heart energetics on susceptibility to arrhythmia is therefore of particular interest to better understood the overall effect as well as the relative importance of the potential partners on developed pathologies. In this thesis, energetic regulation of mitochondria was studied in perfused hearts paced to induce arrhythmia. Myocardial oxygen consumption was shown as a crucial parameter in the response to rhythm troubles. Inhibitions of ATPase myofibrils by blebbistatin or AK-phosphotransfer by Ap5a did not produce same responses of mitochondrial compartment. When inhibited by Blebb, most of hearts presented less ectopic beats highlighting an anti-arrhythmic profile in this case of myofibrils inhibition. Energetic parameters involved in mitochondrial responses were characterized in skinned fibres. Mitochondria regulation was different between ventricle and atria, with a less sensitivity of mitochondria in atria compared to ventricle. Mechanisms of energy transfer between supply and demand were different between ventricle and atria. The role of AK-phosphotransfer was described as a determining parameter for atria energy maintenance, whereas ventricle presented a functional efficacy of CK pathway to regulate adenine nucleotide turnover. As suggested by these results, the role of adenylic nucleotides channeling could be considered as a mechanism used to counteract altered cardiac energetics that potentially sustained electrical pathologies.

Während meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Synthese von polyhalogenierten Carbazolderivaten. Das Carbazolgerüst wurde über den Palladiumvermittelten, bestehend aus Buchwald-Hartwig-Aminierung und oxidativer Cyclisierung, aufgebaut. Die Halogensubstituenten wurden entweder am Carbazol eingeführt oder bereits über die Startmoleküle in die Synthese eingebracht. Somit konnten verschiedene halogenierte halogenierte Derivate synthetisiert werden. Diese Verbindungen konnten in einer Kooperation mit Herrn Prof. Gutzeit aus der Fachrichtung Biologie der TU Dresden auf ihre Aktivität in der Inhibierung der Myosin ATPase untersucht werden. Dabei wurde ein tribromiertes 1-Hydroxycarbazol als wirksamer Inhibitor identifiziert. Der zweite Teil der Promotion umfasst die Darstellung der Amaryllisalkaloide Pratosin und Hippadin, sowie der auf diesem Weg ebenfalls zugänglichen Naturstoffe Assoanin, Oxoassoanin, Anhydrolycorin-7-on und deren Naturstoffanaloga Anhydrolycorin. Die Synthese wurde auf zwei verschiedenen Wegen durchgeführt und beinhaltet als Schlüsselreaktionen die Eisenvermittelte C-C und C-N Bindungsbildung, sowie die Palladiumvermittelte Biarylkupplung. / This thesis is about my research study of the synthesis of polyhalogenated carbazoles. The skeletal structure of the carbazoles are easily assembled by palladium(0)-catalyzed Buchwald-Hartwig coupling and palladium(II)-mediated oxidative cyclisation. Through cooperation with Prof. Gutzeit many different halogenated carbazole derivatives could be analyzed concerning the activity of the inhibition of myosin ATPase. The tribrominated 1-Hydroxycarbazole was identified as sn effective inhibitor. The second part of my thesis includes the total synthesis of amaryllidaceae alkaloids pratosine, oxoassoanine, assoanine, hippadine, anhydrolycorinone and anhydrolycorine. The synthesis was accomplished by two different pathways which include the Iron-mediated C-C and C-N bond formation and intramolecular palladium-catalysed biaryl coupling reaction as the key steps.

Während meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Synthese von polyhalogenierten Pyrrolalkaloiden. Im Zentrum der Darstellung dieser Verbindungen stand die von mir in meiner Diplomarbeit erfolgreich zur Synthese von Pentabrompseudilin angewandte silber-katalysierte Cyclisierung von N-tosylsubstituierten Homopropargylaminen. So konnte das Pentachlorpseudilin in der zweiten Totalsynthese überhaupt sowie mehrere gemischt halogenierte synthetische Derivate aufgebaut werden. Diese Verbindungen konnten in einer Kooperation mit Herrn Prof. Gutzeit aus der Fachrichtung Biologie der TU Dresden und Herrn Prof. Manstein von der Medizinischen Hochschule Hannover, als hochwirksame Myosin ATPase-Inhibitoren identifiziert werden. Bei den verschieden halogenierten Verbindungen ließen sich deutliche Unterschiede in der inhibitorischen Aktivität feststellen. Ein zum Pentabrompseudilin benzologes Indolderivat, welches in einer kurzen Synthese aufgebaut werden konnte, war hingegen nicht aktiv. Im zweiten Teil der Promotion beschäftigte ich mich in einer Kooperation mit Dr. Kurzchalia vom Max-Planck-Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik (Dresden) mit der Synthese von hormonell aktiven Steroiden, speziell den Cholesten-26-säuren, welche Liganden für den hormonellen Rezeptor DAF-12 des Nematoden Caenorhabditis elegans repräsentieren. Die an C-25 R-konfigurierten Säuren waren in der Literatur mit einer deutlich geringeren Aktivität als die 25S-Säuren beschrieben. Die 25R-Steroide waren synthetisch leicht aus kommerziell erhältlichem Diosgenin zugänglich. So konnten alle drei 25R-Säuren in kurzen Synthesen dargestellt werden. In deren Verlauf wurden verschiedene Oxidations- und Schutzgruppenreaktionen eindrucksvoll angewendet. Für die Einführung der 25S-Konfiguration in der Seitenkette sollte eine EVANS-Aldolreaktion an geeignetem Startmaterial angewandt werden. In der Tat führte die Verwendung eines chiralen Oxazolidinons stereoselektiv zum gewünschten Enantiomer in sehr guten Ausbeuten, selbst bei großen Ansätzen. Zur weiteren Transformation musste die durch die Aldolreaktion eingeführte Hydroxygruppe an C-24 entfernt werden. Dies gelang in exzellenter Ausbeute mit Hilfe einer radikalischen Deoxygenierung nach BARTON und MCCOMBIE. So konnte in acht Stufen ein zentrales Syntheseintermediat gewonnen werden, dass in alle drei Naturstoffe überführt werden konnte. Damit waren ausreichende Mengen für biologische Untersuchungen hergestellt worden. Mit der gesättigten (25S)-Dafachronic Acid konnte ein neuer Ligand für DAF-12 synthetisiert werden. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass die Existenz einer Doppelbindung in den Cholesten-26-säuren für die biologische Aktivität unerheblich ist. Für weitere biologische Tests konnten neue Normethylderivate des Cholesterols gewonnen werden. Diese zeigten zum Teil ungewöhnliche biologische Aktivität. Außerdem wurden Versuche zu an verschiedenen Positionen bromierten Cholesterolderivaten unternommen. Im letzten Teil meiner Dissertation konnten neue hoch hydroxylierte Steroide dargestellt werden, die in einer Kooperation mit Prof. Franzblau vom Institute for Tuberculosis Research (Chicago, USA) auf ihre Aktivität gegen Mycobacterium tuberculosis getestet werden sollten. Dabei konnte eine ungewöhnliche 1,2-anti-Hydroborierung beoachtet werden, deren Mechanismus noch genauer untersucht werden muss.

Ouabain and other cardiotonic steroids are known to inhibit Na + ,K + -ATPase (NKA), theion pump responsible for the ionic gradient across the plasma membrane. These steroidsdisplay a selective toxicity towards several tumour cells in comparison to primary humancells, however, the mechanism behind this is not yet understood. Here, we examined theouabain toxicity in renal epithelial cells, proximal tubular cells (PTCs) of different origin. Weinvestigated the relative cytotoxicity in cancer cells (A-498) and papilloma virus-transformedPTCs (HK-2) as well as to primary human PTCs (hPTC) to validate key components in theeffect. In exposure to ouabain, we examined the cell viability and density by MTT and CrystalViolet assays, and cell migration by a scratch assay. The cytotoxic effect was also studied invarious pH, glucose and potassium ion concentrations. In addition, apoptosis was examinedby the TUNEL assay, and if ouabain kills cancer cells through activation of thevolume-regulated anion channel VRAC channel via NKA. We found that there is a decrease in viable cells when cells are exposed to ouabain ≥ 10nM, however, the effect was not seen to be selective towards cancer cells, nor due toapoptosis and the activation of VRAC. The cytotoxic effect was greater in more acidicextracellular pH ~6.8, but independent of glucose concentration in the medium. Interestingly,the effect was also reversed at an increased extracellular concentration of potassium, andouabain did selectively inhibit the cancer cells to migrate. Thus, there could be potential forouabain to act as an anti-cancer agent for renal cancer and to inhibit tumour metastasization. / Ouabain och andra kardiotoniska steroider är kända för att inhibera Na + ,K + -ATPas (NKA),membranpumpen som är ansvarig för den aktiva jontransporten av natrium och kalium ochjongradienten över plasmamembranet. De har påvisat en selektiv toxicitet mot vissatumörceller i jämförelse med primära humana celler, men det är dock inte förstått hurmekanismen bakom denna företeelse fungerar. I denna studien undersökte vi ouabainstoxicitet i njurcancerceller (A-498) och papillomavirustransformerade proximala tubuliceller(hPTC) för att identifiera effektens nyckelkomponenter. Vid exponering av ouabain undersökte vi cellviabiliteten och -densiteten genom MTT- ochkristallviolett-analyser, samt cellmigrering genom scratch-analys. Den cytotoxiska effektenstuderades också under olika pH-förhållanden samt glukos- och kaliumkoncentrationer.Dessutom undersöktes det om apoptos orsakar celldöd genom TUNEL-analys, och omouabain dödar njurcancerceller genom aktivering av den volymreglerade anjonkanalen(VRAC) via NKA. Vi fann minskning av cellernas livskraft vid exponering av ≥ 10 nM ouabain, men effektentycktes dock inte se ut att vara selektiv gentemot cancerceller, inte heller på grund av apoptosoch aktivering av VRAC. Den cytotoxiska effekten var större vid lägre pH, men oberoendeav mediets glukoskoncentrationen. Intressant nog motverkades också effekten vid förhöjdkoncentration av kaliumjoner, och ouabain hämmade selektivt cancercellerna att migrera.Således finns det en viss potential för ouabain att kunna fungera som ett anticancermedel motnjurcancer och att hämma metastasutveckling.

Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.

Vor zehn Jahren wurde der (Pro)Renin-Rezeptor [(P)RR] entdeckt und als neuer Bestandteil des Renin-Angiotensin-Systems beschrieben. Neuere Studien ergaben, dass der (P)RR mit der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase) assoziiert sein kann, weshalb er auch V-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2) genannt wird. In Osteoklasten befinden sich V-ATPase hauptsächlich an der zur Knochenoberfläche gerichteten Plasmamembran und transportieren Protonen in den extrazellulären Raum. Mäuse mit genetischer Deletion verschiedener V-ATPase-Untereinheiten charakterisiert durch einen Anstieg von Knochenmasse (Osteopetrose). In der vorliegenden Arbeit fanden wir heraus, dass (P)RR stark in reifen Osteoklasten in vitro und in vivo exprimiert wird. Mäuse mit genetischer Deletion des (P)RR in Osteoklasten wurden durch einen komplexen Knochen-Phänotyp mit reduzierter Knochendichte charakterisiert. (P)RR-defiziten Osteoklasten wiesen vermehrte Differenzierung und/oder Aktivität in vitro und in vivo auf. Wir postulieren deshalb, dass der (P)RR die in der Plasmamembran lokalisierten V-ATPase nicht direkt reguliert, sondern mit der physiologischen Aktivität der Osteoklasten durch andere Mechanismen interferiert. Macrophagen sind speziell auf die Immunabwehr ausgerichtete Fresszellen (Phagozyten). Phagozytose ist ein wesentlicher Zellprozess der die V-ATPase in Lysosomen braucht um die eingeschlossenen Pathogen zu zerstören. Wir generierten transgene Ratten mit konditionellen knockdown von (P)RR unter Nutzung eines Doxyzyclin-induzierten shRNA-Expressionssystems. Eine effiziente (P)RR-Depletion in Makrophagen wurde durch Behandlung mit Doxyzyclin in vivo im Trinkwasser und in vitro im Kulturmedium erreicht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Verschiebung des vesikulären pHs erst ziemlich spät nach (P)RR-Depletion auftritt. Wir fanden heraus, dass (P)RR-Depletion weder Phagozytose noch Endozytose beeinträchtigte, sondern für das Recycling des Transferrin-Rezeptors zur Plasmamembran wichtig ist. / A decade ago, the (pro)renin receptor [(P)RR] was discovered and depicted as a new component of the renin-angiotensin system. However, recent studies have put in evidence that the (P)RR associate with and regulate the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase), hence its other name vacuolar H+-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2). In osteoclasts, V-ATPases are mainly located at the plasma membrane facing the bone surface and extrude protons into the extracellular space. Mice with genetic deletion of various V-ATPase subunits are characterized by an increase of bone mass (osteopetrosis). In this work, we found that the (P)RR is highly expressed in mature osteoclasts in vitro and in vivo. Mice with genetic deletion of the (P)RR in osteoclasts developed a complex bone phenotype characterized by a reduced bone density. Osteoclasts lacking (P)RR displayed increased differentiation and/or activity in vitro and in vivo. We therefore suggest that the (P)RR does not directly regulate V-ATPases located at the plasma membrane but rather interferes with osteoclast physiology through other mechanisms. Macrophages are professionalized phagocytes crucial for immune response. Phagocytosis is an essential cellular process, which requires lysosomal V-ATPases for degradation of engulfed pathogens. We generated transgenic rats with a conditional depletion of the (P)RR with the use of a doxycycline-induced shRNA expression system. Efficient (P)RR depletion in macrophages was accomplished by doxycycline treatment in vivo in drinking water and in vitro in culture medium. In this work, we found that the impairment of vesicular pH occurs lately after (P)RR deletion. Also, we found that (P)RR deletion did not impair neither phagocytosis nor endocytosis but rather perturbed the recycling of the transferrin receptor to the plasma membrane.

Die Umkehrung von Lipiden und die asymmetrische Verteilung in Membranbilayern sind häufige Phänomene bei Eukaryoten, katalysiert durch P4-ATPasen. Ihr Auftreten und ihre Bedeutung bei apikomplexen Parasiten sind jedoch wenig erforscht. Wir zeigen, dass Toxoplasma gondii Phosphatidylserin (PtdSer) und Phosphatidylethanolamin (PtdEtn) aus seiner Umgebung aufnehmen kann, jedoch keine Phosphatidylcholin (PtdCho)-Sonden. Die flusszytometrische Quantifizierung bestätigte die Selektivität des Phospholipidtransports und dessen Abhängigkeit von Energie (ATP) und Protein.Wir identifizierten fünf P4-ATPasen (TgP4-ATPase1-5) und ihre Untereinheiten - das Ligandeffektormodul (TgLem1-3) im Genom von T. gondii. TgP4-ATPase1 ist in der apikalen Plasmamembran mit TgLem1 vorhanden; TgP4-ATPase3 und TgLem3 sind im Golgi-Netzwerk lokalisiert, während TgP4-ATPase2 und TgP4-ATPase5 in der Plasmamembran und den Endo-/Zytomembranen vorkommen. Die Depletion von TgP4-ATPase1-3 beeinträchtigte das Wachstum des Parasiten in humanen Wirtszellen und offenbarte deren entscheidende Rolle. Zusätzlich zeigten unsere Arbeiten, dass TgP4-ATPase1 und TgLem1 zusammenarbeiten, um PtdSer über die Plasmamembran zu translozieren. Ein genetisches Ausschalten von P4-ATPase1 und eine bedingte Depletion von TgLem1 in Tachyzoiten störten die asexuelle Reproduktion und die Translokation von PtdSer erheblich. Die phänotypische Analyse einzelner Mutanten zeigte, dass die Lipidumkehrung für die Motilität, den Ausbruch und die Invasion der Tachyzoiten notwendig ist. Biotinylierungsbasierte Nähe-Assays und reziproke Immunpräzipitationsexperimente zeigten die physische Interaktion von P4-ATPase1 und Lem1. Unsere Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der Lipidumkehrung während des lytischen Zyklus eines Modellpathogens und identifizieren P4-ATPase1 als potenzielles Wirkstoffziel in T. gondii. / Lipid flipping and asymmetric distribution in membrane bilayers is a common eukaryotic phenomenon catalyzed by various P4-ATPases. However, its occurrence, mechanism, and significance in apicomplexan parasites are not well understood. We demonstrate that Toxoplasma gondii, a clinically relevant intracellular parasite, can salvage phosphatidylserine (PtdSer) and phosphatidylethanolamine (PtdEtn) but not phosphatidylcholine (PtdCho) probes. Flow cytometric quantitation of NBD-lipid probes confirmed the selectivity of phospholipid transport and its dependence on energy (ATP) and protein. We identified five P4-ATPases (TgP4-ATPase1-5) and their subunits—ligand effector module (TgLem1-3) in the T. gondii genome. During the lytic cycle, TgP4-ATPase1 is located in the apical plasmalemma with its partner TgLem1; TgP4-ATPase3 and TgLem3 are in the Golgi network, while TgP4-ATPase2 and TgP4-ATPase5 are found in the plasmalemma and endo/cytomembranes. Depletion of TgP4-ATPase1-3 impaired parasite growth in human host cells, revealing their crucial roles. Further work showed that TgP4-ATPase1 and TgLem1 cooperate to translocate PtdSer across the plasma membrane. Genetic knockout of P4-ATPase1 and conditional depletion of TgLem1 in tachyzoites disrupted asexual reproduction and translocation of PtdSer. Additionally, phenotypic analysis of mutants indicated that lipid flipping is essential for the motility, egress, and invasion of tachyzoites. Proximity-dependent biotinylation and reciprocal immunoprecipitation assays confirmed the physical interaction of P4-ATPase1 and Lem1. Our findings highlight the significance of lipid flipping during the lytic cycle of a model pathogen and identify P4-ATPase1 as a potential drug target in T. gondii.

In großen Teilen der Welt verursachen intrazelluläre Parasiten der Spezies Leishmania schwerwiegende Infektionen beim Menschen. Die Exposition eines Phospholipids (Phosphatidylserin, PS) steht unter Verdacht Fresszellen zur Aufnahme der Parasiten zu stimulieren. Bisher ist die Regulation der Phospholipidverteilung in der Plasmamembran dieser Parasiten kaum erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein lipidtransportierender Proteinkomplex identifiziert, der einen wesentlichen Beitrag zur asymmetrischen Lipidverteilung in der Plasmamembran von Leishmania donovani leistet. Die Zerstörung des Komplexes führte zum Verlust des einwärts gerichteten Lipidtransports und zur Anreicherung von Phosphatidylethanolamin (PE) auf der Zelloberfläche des Parasiten. Diese veränderte Lipidasymmetrie hatte jedoch keinen Einfluss auf die Phagozytose durch Makrophagen. Darüber hinaus brachte die Untersuchung des Insektenstadiums (Promastigote) verschiedener Leishmania Spezies zu Tage, dass die Menge an PS unterhalb des Detektionslimits modernster Nachweisverfahren liegt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Parasit über einen Scramblase-Mechanismus verfügt, der durch intrazelluläres Kalzium stimulierbar ist. Die Scramblase-Aktivität ist, im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen einwärts gerichteten Lipidtransport, energieunabhängig und ermöglicht die bidirektionale Translokation von fluoreszenzmarkiertem Phosphatidylcholin (PC), PE, PS und Sphingomyelin (SM). Dementsprechend konnte nach Kalziumstimulierung endogenes PE auch in der äußeren Lipidschicht der Plasmamembran detektiert werden, wobei deren Barrierefunktion nicht beeinträchtigt wurde. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die dynamische Regulation der Lipidverteilung über die Plasmamembran des Parasiten und verdeutlichen, dass die Exposition von PS und PE nicht essentiell für das Eindringen der Leishmanien in die Wirtszellen ist. / The protozoan parasite Leishmania causes severe infections in humans throughout the world. Following the transmission via sand flies to its mammalian host the extracellular parasite has to gain entry into phagocytic cells to initiate a successful infection. Specific surface exposed phospholipids have been implicated in Leishmania macrophage-interaction, but the mecha-nisms controlling and regulating the plasma membrane lipid distribution remains to be eluci-dated. In the present work a lipid transporting protein complex was identified in Leishmania dono-vani which plays an essential role in maintaining an asymmetric lipid distribution across the plasma membrane. Loss of the protein complex abolishes the inward-directed lipid transport and thus e.g. to an increased cell surface exposure of phosphatidylethanolamine (PE). In spite of this altered lipid asymmetry the uptake by macrophages is unaffected. Moreover, Leishma-nia promastigotes of different species lack detectable amounts of phosphatidylserine (PS) although being infective. Furthermore, a scramblase activity following a cytosolic calcium signal was demonstrated. This scramblase mechanism facilitated, in contrast to the previous described inward directed lipid transport, the bidirectional movement of fluorescent lipid analogues of PC, PE, PS and SM in an energy-independent manner. In accordance with these findings endogenous PE was exposed to the outer plasma membrane leaflet following the Ca2+-signal, while the plasma membrane itself remained intact. These results provide novel insight into the dynamic regulation of the transbilayer lipid distri-bution across the parasite plasma membrane and reveal that exposure of PS and PE is not cru-cial for invasion of the host cell by Leishmania donovani promastigotes.

Die Zebrafischmutation heart and mind (had), welche die alpha1B1-Untereinheit der Na+,K+ ATPase betrifft, verzögert die Streckung des Herzschlauches und führt zu weiteren Entwicklungsanomalien, die an andere Zellpolaritätsmutanten wie nagie oko (nok) und heart and soul (has) erinnern. In dieser Arbeit habe ich die Funktion und Regulation von Had/Na+,K+ ATPase während der Herzmorphogenese des Zebrafisches und seine möglichen Interaktionen mit Has/Prkci und Nok/Mpp5 untersucht. In konnte nachweisen, dass genetische Interaktionen zwischen had und nok in der Aufrechterhaltung von Zonula-Occludens-1-(ZO-1)-positiven Adhäsionsbändern Adhäsionsbändern in myokardialen Zellen während der Herzentwicklung nachweisen. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen Nok/Mpp5 und Had/Na+,K+ ATPase zur Aufrechterhaltung der myokardialen ZO-1-Adhäsionsbändern die Funktion der Na-Pumpe erfordert und dass die korrekte Ionengradienten zur Aufrechterhaltung der myokardialen Integrität beiträgt. Meine Ergebnisse zeigen eine Phosphorylierung des N-terminalen Endes von Had/ Na+,K+ ATPase durch PKCs. PKCs wurden bereits mit der Regulation der Na-Pumpen-Funktion durch Phosphorylierung von N-terminalen Resten in Verbindung gebracht. Meine Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass dieser Mechanismus im Zebrafisch konserviert ist. Die Analyse der subzelluläre Lokalisation einer Phosphorylierungs-defizienten Form von Had/Na+,K+ ATPase legt nahe, dass während Herzschlauch-elongation die Had/Na+,K+ ATPase-Aktivität an der Zellmembran durch die Phosphorylierung an einer amino-terminalen Amino-säure reguliert wird. Frühere Studien legen nahe, dass die Herzmorphogenese durch direkte Phosphorylierung von Has/Prkci-Zielen gesteuert wird. Die Identifikation von Has/Prkci-Phosphorylierungs-Zielen könnte dazu beitragen, Herzmorphogenese besser zu verstehen. Aus diesem Grund wurde ein chemisch-genetischer Ansatz entwickelt, um direkte Phosphorylierungs-Ziele von Has/Prkci zu identifizieren. / The zebrafish heart and mind (had) mutation which disrupts the alpha1B1 subunit of Na+,K+ ATPase causes heart tube elongation defects and other developmental abnormalities that are reminiscent of several epithelial cell polarity mutants including nagie oko (nok) and heart and soul (has). In this work, I investigated the function and regulatory mechanisms of Had/Na+,K+ ATPase during zebrafish cardiac morphogenesis, as well as its´ possible interactions with Has/Prkci and Nok/Mpp5. In this study, I demonstrate genetic interactions between had and nok in maintaining Zonula occludens-1 (ZO-1) positive junction belts within myocardial cells during heart development. My results strongly suggest that the interaction between Nok/Mpp5 and Had/Na+,K+ ATPase in the maintenance of myocardial ZO-1 junction belts requires the Na pump function and that the correct ionic balance contributes to the maintenance of myocardial integrity. My results show phosphorylation of the N-terminal intracellular tail of Had/Na+,K+ ATPase by PKCs. PKCs have previously been implicated in the regulation of the Na pump function via phosphorylation of N-terminal residues. Therefore, my results raise the possibility that this mechanism is conserved in the zebrafish embryo. The analysis of the subcellular distribution of a phosphorylation-deficient form of Had/Na+,K+ ATPase suggests that, during heart tube elongation, Had/Na+,K+ ATPase activity is regulated at the membrane via phosphorylation at an amino-terminal site. Previous studies suggest that heart morphogenesis is driven via direct phosphorylation of Has/Prkci targets. Therefore, identification of Has/Prkci phosphorylation targets would contribute to better understand cardiac morphogenesis. For this purpose, a chemical genetic approach was designed to identify Has/Prcki direct phosphorylation targets.

DNA is susceptible to various types of damage as a result of normal cellular metabolism or from environmental sources. In order to maintain genome stability a number of different, partially overlapping DNA repair pathways have evolved to tackle specific lesions or distortions in the DNA. Nucleotide excision repair (NER) is highly conserved throughout eukarya, bacteria and archaea and predominantly targets lesions that result from exposure to UV light, for example cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 photoproducts. The majority of archaea possess homologous of the eukaryotic repair genes and this thesis describes the isolation and the characterization of two XPB homologues identified in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus, SsoXPB1 and SsoXPB2. Human XPB is one of 10 proteins that make up the TFIIH transcription complex. The activity of XPB is tightly controlled by protein interactions, in particular with p52, which stimulates the ATPase activity of XPB. Rather than a conventional helicase, human XPB is thought to act as an ATP dependent conformational switch. Consistent with human XPB, however, the S. solfataricus proteins were unable to catalyse strand separation and the identification of an archaeal protein partner, Bax1, for SsoXPB2 was one of the focuses of this project. In order to maintain genome stability, the DNA must be replicated accurately with each cell cycle. When the advancing replication fork stalls at a lesion or a DNA break, it is crucial that the fork is reset and that replication continues to completion. The helicase Hel308 is thought to clear the lagging strand template of a stalled replication fork in order for replication restart to proceed via homologous recombination (HR). Although the specific function of Hel308 is not well understood, the possibilities are described in this thesis. Strand exchange proceeds to form a D-loop, followed by branch migration to increase regions of heterology during the synapsis stage of HR. No motors for branch migration have previously been recognised in archaea, although the identification of a possible candidate was investigated during this project.