Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlessandrodosSantos_D.pdf: 4349733 bytes, checksum: 319c7b608b0ec53ed2bab3d2bbb43a23 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Esclerose múltipla (EM) é a mais comum doença neurológica crônica que acomete adultos jovens. Apesar da etiologia da EM ser desconhecida, está bem descrito que a doença é resultante da combinação de uma pré-disposição genética associada a fatores ambientas. Nos últimos anos, tem sido evidenciada a hipótese da participação da vitamina D na evolução da EM e do modelo experimental, a encefalomielite experimental auto-imune (EAE). No presente estudo, fomos capazes de mostrar que a administração da vitamina D3 in vivo na EAE, assim como a transferência de células dendríticas tolerogênicas, induzidas pela vitamina D3 in vitro, aumentam significativamente a porcentagem das células reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ e a expressão de IL-10 nos linfonodos, resultando na redução dos sinais clínicos nesses animais. Simultaneamente, há uma diminuição do numero de células nos infiltrados inflamatórios no sistema nervoso central, acompanhada da diminuição das citocinas proinflamatórias como a IL-17A, IFN'gama' e TNF'alfa'. Ainda, os animais tratados apresentam uma maior quantidade de IL-10 e TGF'beta'1 liberados no soro, quando comparados aos animais não tratados. Esses mecanismos contribuem ativamente para a criação de um microambiente no linfonodo que é capaz de suprimir a ativação das células auto-reativas, diminuindo a resposta inflamatória no sistema nervoso central. Ainda, fomos capazes de demonstrar que a maioria das mudanças neurológicas que acontece durante a fase aguda da EAE desaparecem quando a resposta inflamatória é controlada. No presente estudo avaliamos a expressão diferencial de proteínas no SNC em diferentes fases da EAE. Nossos resultados demonstram que várias proteínas estão diferencialmente expressas na fase aguda da doença em comparação aos animais naive como: as proteases e proteínas estruturais e metabólicas, que estão envolvidas na neurodegeneração. Essas alterações retornam aos níveis normais durante a fase de remissão da doença / Abstract: A growing body of evidence supports the hypothesis that vitamin D is an environmental factor important in the etiology of T-cell-mediated autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS). In the present study, evidence is provided that the in vivo administration of vitamin D3, as well as the adoptive transfer of vitamin D3-induced immature/tolerogenic dendritic cells lead to a significant increase of the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the lymph nodes but, not in the blood or spleen, in the rat model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Simultaneously with the increase of this cell population the treatment with Vitamin D3 induced is a significant decrease in the number of auto-reactive T cells in the central nervous system, as well as the reduction of the expression of pro-inflammatory cytokines. Moreover, the treatment increases the level of IL-10 and TGF'beta'1 in the serum and in the lymph nodes. The adoptive transfer of vitamin D3-induced DC also induces a significant increase in the expression of IL-10 in the lymph nodes, with no change in the expression of TGF'beta'1. These mechanisms contribute actively to the generation of a microenvironment in the lymph nodes that suppress the activation of encephalitogenic T cells, which result in the downregulation of the inflammatory response in the central nervous system. Moreover, we provide evidence that most of neurological changes that take place during the clinical phase of EAE disappear when inflammatory response is controlled. We have identified protein expression in different phase of the EAE. The result demonstrated various proteins which are regulated during the acute phase of the disease, such as some enzymes and proteins from the neurodegenerative process, return to normal levels in the remission phase of the disease / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Sandra Regina M. Fernandes, Manoel Barros Bertolo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freire_AlzirtondeLira_D.pdf: 2046365 bytes, checksum: 7caf510992e59ec21c00856d2d31ff02 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O presente estudo avaliou a freqüência dos alelos HLA-DR em um grupo de 29 pacientes brasileiros caucasóides com PAN ou poliangiíte microscópica e investigou uma possível relação entre os alelos HLA-DR, os índices de atividade e gravidade e as manifestações clínicas de doença. O diagnóstico de cada paciente baseou-se nos critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ACR) para a PAN e da Conferência Internacional de Consenso de Chapel Hill (CHCC) para poliangiíte microscópica. A atividade e a gravidade da doença foram mensuradas retrospectivamente, por ocasião do diagnóstico, utilizando-se, respectivamente, o Birmingham Vasculitis Activity Score (BVAS) e o Five-Factors Score (FFS). De acordo com o BVAS, os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles com BVAS < 22 e outro com BVAS ³ 22. De acordo com o FFS, dois grupos foram definidos: 0, quando nenhum fator de pior prognóstico foi notado e ³ 1 quando 1 ou mais fatores estavam presentes. As manifestações clínicas presentes por ocasião do diagnóstico foram avaliadas de acordo com o sistema orgânico acometido. Cinquenta e nove indivíduos caucasóides, saudáveis, da mesma população, formaram o grupo controle. A tipagem dos alelos HLA-DR foi realizada através da técnica de amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando-se sequências específicas de primers DR de baixa resolução. No grupo total de casos, encontrou-se uma maior frequência estatisticamente significativa de HLADRB1* 16 (p=0.023) e DRB4*01 (p=0.048) nos pacientes com BVAS ³ 22. Os pacientes com FFS=0 apresentaram uma maior frequência estatisticamente significativa de HLA-DRB1*03. A frequência de HLA-DRB1*11 e/ou B1*12 (p=0.046), B1*13 (p=0.021) e B3 (p=0.008) foi significativamente maior nos pacientes com envolvimento do trato gastrintestinal e a de DRB1*15 e/ou DRB1*16 (p=0.035) e B5 (p=0.035) nos pacientes com acometimento renal. Nossos resultados sugerem que os alelos HLA-DRB1*15/B1*16, B4*01, B1*03, B1*11/B1*12, B1*13, B3 e B5 podem influenciar a expressão clínica da PAN e da poliangiíte microscópica na nossa população. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the frequency and clinical associations of HLA-DR alleles in Brazilian Caucasian patients with polyarteritis nodosa (PAN) or microscopic polyangiitis (MPA). We evaluated 29 Caucasian patients with vasculitis classified as PAN or MPA according to the American College of Rheumatology (ACR) 1990 Criteria and Chapel Hill Consensus Conference (CHCC) nomenclature for vasculitis. HLA-DR alleles were typed using polymerase chain reaction-amplified DNA, hybridized with sequence specific low resolution primers. DNA obtained from 59 Caucasian healthy blood donors were used as control. In order to evaluate if a specific HLA may have influence on the clinical profile of those diseases, we also divided the patients according to Birmingham vasculitis score (BVAS) and Five-Factors Score (FFS) at the time of diagnosis. Increased frequency of HLA-DRB1*16 (p=0.023) and DRB4*01 (p=0.048) was found in patients with higher disease activity at the time of diagnosis (BVAS ³ 22). Patients with less severe disease (FFS=0) had a higher frequency of HLA-DRB1*03 (p=0.011). Patients with gastrointestinal tract involvement had significantly increased frequency of HLA-DRB1*11 or B1*12 (p=0.046), B1*13 (p=0.021) and B3 (p=0.008). In contrast, patients with renal disease, had higher frequency of DRB1*15 or DRB1*16 (p=0.035) and B5 (p=0.035). Our results suggest that HLA-DR alleles may influence PAN and MPA clinical expression and outcome. / Doutorado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Introdução: Os pênfigos vulgar (PV) e foliáceo (PF) são dermatoses autoimunes vésico-bolhosas que apresentam anticorpos da classe IgG dirigidos contra desmogleínas 1 (Dsg) 1 e 3, cuja consequência é a clivagem intraepitelial (acantólise). Objetivo: Caracterizar o perfil clínico e imunológico dos doentes de PF ou PV com envolvimento umbilical. Métodos: Dez pacientes de pênfigo (vulgar ou foliáceo) com manifestação umbilical, acompanhados no Hospital das Clínicas, Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foram analisados no período entre agosto de 2008 e janeiro de 2010, segundo suas características clínicas, histopatológicas e imunológicas (imunofluorescência direta, indireta e ELISA utilizando Dsg1 e Dsg3 recombinantes). Resultados: Os dados demográficos identificaram que, dos 10 pacientes incluídos, sete eram mulheres, e três homens; a idade variou entre 2470 anos, e a duração da enfermidade entre três e 16 anos. Cinco pacientes foram diagnosticados como PV e cinco como PF. Eritema, erosões, crostas e lesões vegetantes foram as características clínicas mais relevantes presentes nas regiões umbilicais. A imunofluorescência direta (IFD) da região umbilical mostrou depósitos de IgG e C3 intercelulares intraepiteliais em oito doentes, e IgG isolada em dois indivíduos. A imunofluorescência indireta (IFI) com conjugado IgG mostrou padrão típico intercelular de pênfigo em todos os 10 pacientes, com títulos variando entre 1 : 160 e 1:2560. ELISA Dsg1 recombinante mostrou índices de 24 a 266 no PF, e de 0 a 270 no PV. A reatividade contra Dsg3 recombinante foi positiva em todos os pacientes com PV (ELISA 2298), e mostrou-se negativa em todos os soros de PF. Conclusões: Todos os 10 pacientes com pênfigo com manifestação umbilical demonstraram perfil clínico e imunológico compatíveis com PF ou PV. Esta apresentação peculiar, ainda não bem elucidada, é raramente descrita na literatura. Uma possível explicação para esta apresentação distinta pode ser atribuída à presença de novos epítopos, ou uma associação com vestígios embrionários ou de cicatrizaçào, localizados na região do cordão umbilical / Background: Pemphigus vulgaris (PV) and pemphigus foliaceus (PF) are autoimmune vesicobullous disorders with IgG autoantibodies directed against desmoglein (Dsg)1 and 3, which lead to intraepidermal acantholysis. Aim: To characterize the clinical and immunological profile of patients with PF or PV with umbilical involvement. Methods: Ten patients from the Outpatient Clinic, Hospital das Clínicas, Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, diagnosed with either PV (n = 5) or mucocutaneous PF (n = 5) with umbilical lesions were assessed according to their clinical features, histopathology and immunological findings [direct and indirect immunofluorescence (DIF and IIF) and ELISA with recombinant Dsg1 and Dsg3]. Patients were evaluated from August 2008 to January 2010. Results: Demographic data showed that from 10 patients, seven were women, and three men; age ranged from24 to70 years-old, disease duration was from 3 to 16 years). Erythema, erosions, crusts and vegetating skin lesions were the main clinical features of the umbilical region. DIF of the umbilical lesion gave positive results for intercellular epidermal IgG and C3 deposits in eight patients and for IgG alone in the other two. Indirect immunofluorescence with IgG conjugate showing the typical pemphigus pattern was positive in all 10 patients, with titres varying from 1: 160 to 1:2560. ELISA with recombinant Dsg1 gave scores of 24266 in PF and 0 270 in PV. Reactivity to recombinant Dsg3 was positive in all five patients with PV (ELISA 2298) and was negative in all PF sera. Conclusions: All 10 patients diagnosed as pemphigus with umbilical presentation had the clinical and immunopathological features of either PF or PV. This peculiar presentation, not yet completely elucidated, has been rarely reported in the literature. A possible explanation for this unique presentation may be the presence of either novel epitopes or an association with embryonic or scar tissue located in the umbilical-cord region

Atualmente, ainda é incerto se a hidrólise de L-arginil-&beta;-naftilamida (ArgNA) e do leucotrieno (LT) A4 pela LT-A4-hidrolase (LT-A4-H) (EC 3.3.2.6) e pela aminopeptidase básica (APB) (EC 3.4.11.6) tem influência no desenvolvimento da artrite induzida por colágeno (CIA). O objetivo deste estudo foi investigar a inter-relação entre LT-A4-H, APB e LT-B4 em ratos submetidos à CIA. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), ensaio imunoenzimático (EIA), espectrofluorimetria e reação quantitativa em tempo real em cadeia da polimerase (qPCR) foram usados como metodologias. A existência dos genes para as proteínas EC 3.3.2.6 e EC 3.4.11.6 foi confirmada no tecido sinovial (TS) de ratos controles sadios. A hidrólise de ArgNA aumentou na fração solúvel (FS) dos animais submetidos à CIA que desenvolveram a doença (artríticos-CIA) em comparação com aqueles que não desenvolveram a doença (resistentes-CIA) e com os controles sadios. No líquido sinovial (SY) e no plasma sanguíneo houve menor hidrólise de ArgNA em resistentes em comparação aos artríticos e controles. Nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), os níveis de hidrólise de ArgNA aumentaram na FS de controles e na fração de membrana (FM) dos resistentes em comparação aos artríticos. Em comparação com controles sadios, a hidrólise de LT-A4 aumentou no SY e na FS de PBMCs de artríticos e resistentes. A hidrólise de LT-A4 também aumentou na FM do TS de resistentes e diminuiu na FM de PBMCs em artríticos e resistentes. Em todos estes compartimentos a hidrólise de ArgNA permaneceu inalterada ou relacionou-se inversamente com a hidrólise de LT-A4, comparativamente aos controles sadios. A hidrólise de ArgNA diferiu entre os artríticos e resistentes em FM-TS, FS-TS, FM-PBMCs, SY e no plasma sanguíneo. Uma relação no mesmo sentido foi encontrada entre alterações na hidrólise de LT-A4 e nos níveis de LT-B4 apenas em SY e FM-PBMCs dos artríticos e resistentes e em FM-TS dos resistentes, comparativamente aos controles sadios. Em conclusão, a atividade APB é um novo marcador que distingue ratos artríticos e resistentes no modelo CIA. Os níveis de LT-B4 em ratos não são controlados somente pela LT-A4-H. Alterações na atividade LT-A4-H e nos níveis de LT-B4 são indistinguíveis entre artríticos e resistentes, mas tais alterações marcadamente distinguem essas duas condições da condição saudável. LT-A4-H e APB estão relacionadas de uma forma compartimento-dependente, atuando como enzimas independentes, com modulação diferencial das suas especificidades, eficiências e/ou afinidades catalíticas sobre os substratos epóxi e peptídico, ou como enzimas bifuncionais, cujas atividades são inversamente relacionadas devido à inibição concorrente de uma destas atividades / Whether L-arginyl-&beta;-naphthylamide (ArgNA) and leukotriene (LT)-A4 hydrolyses by LT-A4 hydrolase (LT-A4-H) (EC 3.3.2.6) and basic aminopeptidase (APB) (EC 3.4.11.6) influence the development of collagen-induced arthritis (CIA) is presently uncertain. The objective of this study was to investigate the interrelationship among LT-A4-H, APB and LT-B4 in CIA rats. High-performance liquid chromatography (HPLC), enzyme immunoassay (EIA), spectrofluorometry and quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) were used as methodologies. The existence of genes for EC 3.3.2.6 and EC 3.4.11.6 proteins were confirmed in the synovial tissue (TS) of healthy control rats. ArgNA hydrolysis was higher in soluble fraction (FS) in rats submitted to CIA that developed the disease (CIA-arthritic) than in those that did not develop the disease (CIA-resistant) or healthy control. Synovial fluid (SY) and blood plasma had lower ArgNA hydrolysis in CIA-resistant than in CIA-arthritic or control. In the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) the levels of ArgNA hydrolysis increased in FS of control and in membrane-bound fraction (FM) of CIA-resistant in comparison with CIA-arthritic. Compared with healthy control, LT-A4 hydrolysis increased in SY and in FS from PBMCs of CIA-arthritic and CIA-resistant. LT-A4 hydrolysis also increased in FM from TS of CIA-resistant and decreased in PBMCs-FM of CIA-arthritic and CIA-resistant. In all these locations hydrolysis of ArgNA remained unchanged or it was inversely related with LT-A4 hydrolysis, comparatively to healthy control. ArgNA hydrolysis differed between CIA-arthritic and CIA-resistant in TS-FM, TS-FS, PBMCs-FM, SY and blood plasma. A same-sense relationship was found between changes on LT-A4 hydrolysis and LT-B4 levels only in SY and PBMCs-FM of CIA-arthritic and CIA-resistant and in TS-FM of CIA-resistant, comparatively to healthy control. In conclusion, the APB activity is a novel distinctive marker of CIA-arthritic and CIA-resistant statuses. The levels of LT-B4 in rats are not controlled only by LT-A4-H. Changes on LT-A4-H activity and LT-B4 levels are indistinguishable between CIA-resistant and CIA-arthritic, but such variations markedly distinguish these two statuses from healthy status. LT-A4-H and APB are related in a compartment-dependent manner acting as independent enzymes with differential modulation of their specificity, efficiency and/or catalytic affinity on the aminoacyl and epoxy substrates, or as bifunctional enzymes which activities are inversely related due to the concurrent inhibition of one of these

A artrite induzida por pristane (PIA) em camundongos HIII (resistentes) e LIII (suscetíveis) foi usada para estudar mecanismos inflamatórios e imunes atuantes na fase pré-clínica da doença, os quais são pouco conhecidos. Estudos anteriores mostraram diferenças significativas na produção de citocinas nos animais HIII e LIII na fase pré-clínica da PIA, sugerindo forte influênica no fenótipo de PIA. A PIA foi induzida apenas por via intraperitoneal nos animais LIII, com intensa infiltração de neutrófilos, linfócitos, monócitos e macrófagos, altos níveis de IL-12p40 e maior expressão de genes de citocinas inflamatórias após a injeção de pristane. Por outro lado, na linhagem HIII houve aumento de eosinófilos e neutrófilos, mas redução de monócitos e linfócitos. Não observamos diferenças nos níveis de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-12p70, IL-17, IL-10. Concluímos que a intensidade e o tipo de resposta inflamatória na fase inicial da PIA podem ser mecanismos envolvidos na diferença de resistência/ susceptibilidade entre as linhagens HIII e LIII. / Pristane-induced arthritis (PIA) in HIII (resistant) and LIII (susceptible) mice was used in this work to characterize the cellular and molecular alterations of the pre-clinical phase of the disease, of which little is known. Previous reports showed significant differences in cytokine production of HIII and LIII mice in the pre-clinical phase of PIA, suggesting a strong influence on PIA phenotype. PIA was induced only by the intraperitoneal route in LIII animals, which showed intense infiltration of neutrophils, lymphocytes, monocytes and macrophages, with high levels of IL-12p40 after pristane injection. Inflammatory cytokine genes were also upregulated in LIII mice. On the other hand, HIII strain had increased eosinophils and neutrophils, but reduced monocytes and lymphocytes. No significant differences were found in TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-12p70, IL-17, IL-10 levels. We conclude that the intensity and type of inflammatory response in the initial phase of PIA may be different mechanisms involved in resistance / susceptibility between HIII and LIII mice.

Encefalite auto-imune experimental (EAE) é o modelo animal da doença humana esclerose múltipla. Foi demonstrado que as estatinas podem ter efeitos benéficos na EAE. Diversos mecanismos de ação foram descritos para explicar esses efeitos, entre eles: estímulo a expressão de HO-1, inibição da expressão de Toll-like receptors (TLR) e inibição da produção de citocinas de padrão Th1. Estudamos o efeito de uma estatina, a sinvastatina, na evolução clínica da EAE e seus mecanismos de ação. Também avaliamos o papel do TLR4 na EAE. O tratamento com sinvastatina melhorou a evolução clínica da EAE nas doses de 1 e 5 mg/kg/dia. A análise do infiltrado celular no SNC mostrou mudança do padrão de diferenciação dos linfócitos com menor porcentagem de células produtoras de IL-17 nos grupos tratados em relação aos controles. Os animais TLR-4 -/- apresentaram melhor evolução da doença. Concluímos que o tratamento com sinvastatina melhora a evolução clínica da EAE através da inibição da produção de IL-17 e que animais TLR-4 -/- têm melhor desfecho clínico na EAE que os controles. / Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is considered the experimental model for the human multiple sclerosis disease. It has been demonstrated that statins, used as lipid-lowering agents, can have beneficial effects on EAE. Several actions have been described to explain these effects: enhancement of HO-1 expression, inhibition of Toll-like receptors expression and inhibition of Th1 cytokines. We have investigated the effect of a statin, simvastatin, on EAE clinical development and the mechanisms behind those effects. Simvastatin treatment ameliorated EAE clinical outcome at doses 1 and 5 mg/kg/day. SNC cellular infiltrates analysis showed altered pattern of differentiation with decreased percentage of IL-17-producing T lymphocytes in treated group comparing with controls. TLR4 -/- mice showed better clinical development. We concluded that simvastatin treatment ameliorates EAE clinical outcome through inhibition of IL-17 production. Mice TLR4 -/- have better EAE clinical outcome than WT controls.

O presente estudo discute o papel dos miRNAs na fisiopatologia molecular de Esclerose Múltipla Recorrente Remitente (EMRR). O estudo demonstrou que em linfócitos T CD4+ de pacientes com EMRR em surto ocorre a diminuição da expressão do miR-15a e do miR16-1 em contraposição ao aumento de seu gene alvo BCL-2, um importante gene regulador da apoptose. Esses achados sugerem a participação desses miRNAs no controle da apoptose na EM. Para explorar essa associação, foi analisado a expressão global de miRNAs nas subpopulações de linfócitos T de pacientes com EMRR no estágio de remissão. O resultado dessa análise determinou de forma inédita o aumento significativo da expressão de 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) nos linfócitos T CD8+ de memória central. A análise in silico dos alvos desses miRNAs indicou que três vias canônicas, relacionadas à ativação da apoptose, eram enriquecidas com alvos preditos e validados experimentalmente desses miRNAs. Desse modo sugerimos a forte relação desses miRNAs no controle da apoptose nos linfócitos T dos pacientes com EMRR. A fim de aprofundar nossos estudos, selecionamos os miRNAs miR-21 e miR-24, para a realização de experimentos funcionais in vivo. Foi verificada a indução da expressão miR-21 somente nos linfócitos T CD4+ de modelo experimental da EM. Adicionalmente, experimentos in vitro demonstraram que a expressão do miR-21 e restrita as populações de células Th2 e Th17. Nesse caso, miR-21 parece ser regulado pelo fator de transcrição STAT3, sugerindo assim que o aumento da expressão do miR-21 verificada no modelo animal possa estar relacionada com a presença de linfócitos T CD4+ de perfil Th17 nesse tecido. Em resumo, o conjunto desses resultados demonstra a relevância dos miRNAs na fisiopatologia da EMRR, principalmente no controle da apoptose. / This study discusses the role of miRNA in the Molecular Pathophysiology of Relapse Remitting Multiple Sclerosis (RRMS). The study has shown that CD4+ lymphocytes from relapsed RRMS patients had lower expression of miR15a and miR-16-1 in contraposition of higher expression of the target gene BCL-2, a key regulator of apoptosis. These findings suggest the role of those on the control of apoptosis in MS. In order to explore this association, the global expression of miRNAs was analysed in T lymphocyte subpopulations from remission RRMS patients. The result of this analysis has demonstrated for the first time a significant higher expression of 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) in central memory T CD8+ lymphocytes. In silico analysis of the miRNAs targets indicates that three canonical pathways related to the activation of apoptosis were enriched with predicted and experimental validated gene targets for those miRNAs. In this way, we suggest the strong relation of these miRNAs in the control of apoptosis in the lymphocytes from RRMS patients. In order to intensify our studies we selected miR-21 and miR-24 to perform in vivo functional experiments. It was verified miR-21 induction only in T CD4+ lymphocytes from MS animal model. Additionally, in vitro experiments have demonstrated that miR-21 expression was restricted to Th2 and Th17 cell populations. In this way, miR-21 seems to be regulated by the STAT3 transcription factor, thereby suggesting that the increase of miR-21 expression observed in vivo could be related with Th17 CD4+ present in this tissue. In summary, this set of results showed the relevance of miRNAs in the RRMS pathophysiology, mainly in the control of apoptosis.

Die vorliegenden Ergebnisse belegen eine essentielle Rolle der Beseitigung von intrazellulären DNA-Metaboliten aus der DNA-Reparatur für die Aufrechterhaltung von Immuntoleranz. So führt eine unangemessene Akkumulation körpereigener DNA im Zytosol, über die Erkennung durch Nukleinsäuresensoren, zu einer Aktivierung des angeborenen Immunsystems. Dies weist auf einen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen DNA-Schäden, der DNA-Schadensantwort und einer Typ 1-IFN-vermittelten Aktivierung des angeborenen Immunsystems bei der Pathogenese von Autoimmunität hin.

Alopecia areata (AA) is a chronic inflammatory disease of hair follicles manifesting as patchy areas of hair loss on the scalp and body. Development of AA is associated with pen- and intra-follicular inflammation of anagen stage hair follicles, primarily by CD4+ and CD8+ cells. We hypothesized that if cell-mediated cytotoxicy against hair follicles is to be a component of the hair loss disease mechanism, increased expression of genes and products typical of cytotoxic cells, as well as increased apoptosis activity within affected hair follicles, would be expected to occur in the lesional skin compared to the normal skin. Furthermore, we studied gene expression levels of multiple cytokines and characteristic chemokines, using the C3FI/HeJ mouse model of AA. mRNA expression levels of granzyme A, granzyme B, perform Fas, Fas ligand, TNF-cL, TNF-aRl and R2, TRAIL, TRAILR, TRAMP, Thi-, Th2-, and Th17-associated cytokines, as well as multiple chemokines were compared between the skin, draining lymph nodes, thymus and spleens of normal and AA-affected mice using quantitative reverse transcriptase PCR. FasL, granzyme A, granzyme B, pro- and anti-inflammatory cytokines were all highly up-regulated in the skin of AA-affected mice. Immunohistochemical studies of the skin revealed that, although greater numbers of granzyme B and FasL expressing cells were present in AA affected skin, the cells were morphologically diffusely distributed and not exclusively located within the focal pen- and intrafollicular infiltrate. The majority of these cells were further characterized as mast cells, which were also found in substantially greater numbers in the skin of mice with AA compared to their normal haired controls. Almost no perform expressing cells were identified in AA affected mouse skin and TUNEL staining suggested relatively limited apoptosis activity in hair follicle keratinocytes. In conclusion, while granzymes and FasL may play important roles in disease development, the profiles and patterns of expression are not consistent with direct cell-mediated cytotoxic action against the follicular epithelium in chronic mouse AA. Potentially, hair growth inhibiting cytokines may play a more dominant role in AA development than previously thought. Furthermore, mast cells, with their increased presence around hair follicles in the AA affected mouse skin and their ability to express granzyme B and FasL, are suggested as potential key players in the pathogenesis of AA. / Medicine, Faculty of / Medicine, Department of / Experimental Medicine, Division of / Graduate

La pemphigoïde bulleuse (PB) est la plus fréquente et la plus grave des dermatoses bulleuses auto-immunes caractérisée par une cascade inflammatoire impliquant plusieurs cytokines et cellules inflammatoires, avec la libération de protéases (MMP-9, élastase) conduisant à la formation de la bulle. L’objectif de cette étude est de caractériser cette cascade inflammatoire en analysant la contribution de la chimiokine CXCL10 et des cellules inflammatoires comme les macrophages dans le mécanisme physiopathologique associé à la maladie. Nos résultats ont montré que CXCL10 est présent à des taux importants dans le sérum des patients et dans le liquide de bulle, de plus cette chimiokine reste fortement présente dans le sérum des patients qui rechutent. D’autre part nous avons montré pour la première fois que l’orientation des macrophages dans la PB est contrôlée dans un premier temps par les sérums de patients, qui préactivent les macrophages dérivés de monocytes, puis par le liquide de bulle qui différencient les macrophages vers une polarisation M2. Nous avons également montré que seulement les neutrophiles et les monocytes isolés de patients atteints de PB, mais pas leur lymphocytes, répondaient à une stimulation par CXCL10 par une augmentation de leur sécrétion en MMP-9 via l’activation des voies de signalisation ERK1/2, P38 et PI3K. Cette expression de la MMP-9 a été associée à une polarisation de type M2 dans les macrophages issus de monocytes de patients. Enfin, nous avons montré l’importance des activateurs sélectifs des récepteurs des glucocorticoïdes, tels que le composé A, qui était aussi efficace que le traitement avec la méthylprénisolone dans l'inhibition de la MMP-9, mais avec des effets distincts sur l'expression des marqueurs phénotypiques de macrophages. / Bullous pemphigoid (BP) is the most common and serious autoimmune bullous dermatosis characterized by inflammatory cascade involving many cytokines and inflammatory cells, with the release of proteases (MMP-9, HLE) leading to the formation of the blister. The objective of this study is to characterize the inflammatory cascade by analyzing the contribution of the CXCL10 chemokine and inflammatory cells such as macrophages in the pathophysiology associated with the disease. Our results showed that CXCL10 is present at significant levels in the serum of patients and in the blister fluid, this chemokine remains strongly present in the serum of patients who relapse. On the other hand we have shown for the first time that macrophages polarization in BP is controlled by the sera of patients, which activate macrophages derived from monocytes, and then blister fluid differentiate macrophages in an M2 polarization. We also showed that only neutrophils and monocytes isolated from patients, but not the lymphocytes responding to stimulation by CXCL10 by an increase in secretion of MMP-9 via the activation of signaling pathways ERK1 / 2, P38 and PI3K. This expression of MMP-9 has been associated with an M2 macrophages polarization derived from monocytes of patients. Finally, we have demonstrated the importance of selective glucocorticoid receptor activators, such as Compound A, which was as effective as treatment with methylprednisolone in inhibiting MMP-9, but with distinct effects on the expression of phenotypic markers of macrophages.