Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-08-13T18:00:29Z : No. of bitstreams: 1 000758786.pdf: 2929334 bytes, checksum: 8f950f28035a7eb52265742b39b5b675 (MD5) / As condições ambientais existentes no Cerrado, como déficit hídrico e incidência solar, colaboram para o diversificado laboratório químico que sintetiza e seleciona os compostos produzidos por essas plantas. O contraste sazonal nas fitofisionomias do Cerrado entre a época seca e úmida é um dos fatores que podem alterar as concentrações de metabólitos secundários em plantas. Os compostos produzidos pelo metabolismo secundário podem ser fenilpropanoides, terpenos, alcaloides e esteroides que possuem atividade biológica e são responsáveis pela interação química entre as plantas. Os aleloquímicos são mediadores da comunicação química entre os vegetais e os mecanismos de ação estão relacionados com inúmeros processos bioquímicos e fisiológicos regulados por diferentes conjuntos de genes. Diversos processos biológicos relacionados com o desenvolvimento vegetal são regulados por genes específicos cuja expressão é controlada por microRNAs e outros RNAs regulatórios. O uso da Biologia Molecular pode elucidar os mecanismos de ação fitotóxicos responsáveis pelas respostas fisiológicas envolvidas na atividade alelopática e mostrar novos alvos bioquímicos e fisiológicos na alelopatia. A avaliação da atividade alelopática de frações enriquecidas e substâncias puras de extratos com reconhecida atividade alelopática pode elucidar mecanismos de ação e os efeitos a nível molecular associados às vias fisiológicas afetadas. O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil químico e o potencial alelopático de extratos orgânicos de folhas de Copaifera langsdorffii coletadas em épocas seca e úmida. Para tanto foram verificados o índice de velocidade de germinação (IVG), o crescimento radicular e o padrão de expressão gênica [SHORT- ROOT (SHR); miRNA166; FT HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPER (HD ZIP III) com os genes REVOLUTA (REV), PHABULOSA (PHB) e PHAVOLUTA (PHV)] e características fenotípicas de plântulas ... / The environmental conditions in the Cerrado, like drought and solar incidence, collaborate to diverse chemical laboratory that synthesizes and selects compounds produced by these plants. The seasonal contrast in the Cerrado vegetation types between dry and wet season is one of the factors that can alter the concentrations of secondary metabolites in plants. The compounds produced by secondary metabolism can be phenylpropanoids, terpenes, alkaloids and steroids that have biological activity and are responsible for the chemical interaction between plants. The allelochemicals are mediators of chemical communication between plants and mechanisms of action are related to numerous biochemical and physiological processes regulated by different sets of genes. Specific genes whose expression is controlled by microRNAs and other regulatory RNAs regulate several biological processes related to plant development. The use of molecular biology may elucidate the mechanisms of action responsible for phytotoxic physiological responses involved in allelopathic activity and show new targets in biochemical and physiological allelopathy. The evaluation of the allelopathic activity of enriched fractions of extracts and pure compounds with known allelopathic activity may elucidate mechanisms of action and effects at the molecular level associated with physiological pathways affected. The objective of this study was to evaluate the chemical profile and allelopathic potential of organic extracts of leaves collected Copaifera langsdorffii in dry and wet seasons. Therefore, we checked the germination speed index (GSI), root growth and the pattern of gene expression [SHORT- ROOT (SHR); miRNA166; FT HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPER (HD ZIP III) with genes REVOLUTA (REV), PHABULOSA (PHB) e PHAVOLUTA (PHV)] and phenotypic characteristics of seedlings of Sorghum bicolor. A comparison of phytochemical profile observed in the chromatograms indicates no qualitative changes in ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-31Bitstream added on 2014-06-13T18:44:29Z : No. of bitstreams: 1 moraes_spv_dr_jabo.pdf: 948711 bytes, checksum: 46e44d8c0ba3f6d9eccf238a5207cfc2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O lodo de esgoto tem sido utilizado como fertilizante orgânico em substituição ao fertilizante químico. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de lodo de esgoto, oriundo da Estação de Tratamento de Barueri em São Paulo, sobre a população bacteriana do solo através da análise de microarranjo de DNA. Os tratamentos foram sem adição e com adição de lodo de esgoto, sendo este adicionado em quantidades equivalentes a uma e a oito vezes a dose de Nitrogênio mineral recomendada para o cultivo de milho. As amostras de solo foram coletadas no Campo Experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguariúna (SP), em áreas que já vem sofrendo aplicações de lodo similar por 5 anos. As coletas foram feitas seis dias antes da aplicação do lodo, época referente ao final da primavera; e 67 dias após a aplicação do lodo, época referente ao final do verão e antecedente ao plantio do milho. Para a análise da comunidade bacteriana foi construído um microarranjo ambiental em lâmina de vidro contendo 1560 seqüências parciais do gene 16S rRNA de procariotos. Avaliaram-se também os teores totais P, Cu, Fe, Mn, Zn e S acumulados nos solos após a aplicação do lodo. A técnica de microarranjo foi eficiente para avaliar as alterações na comunidade bacteriana. E pode ser observada uma grande variação na população de bactéria, principalmente nos solos tratados com altas doses de lodo. / Sewage sludge has been used as organic fertilizers to replace in substitution chemical fertilizer. The objective of this study was to evaluate the effect of sewage sludge from the Station of Treatment of Barueri São Paulo State on the structure of the bacterial communities through DNA microarray analysis. The treatments were without addition sewage sludge and an N supply to one and eight times the dose of N recommended for mineral fertilization in maize. Soil samples were collected on Experimental Area of the Embrapa Environment, in Jaguariúna, São Paulo State, at the end of the spring, six days before sewage sludge application and at the end of the summer, 67 days after the treatment applications), before the maize plantation. In order to analyze bacterial communities it was constructed a glass slide microarray environmental with 1.560 partial sequences of the gene 16S rRNA from prokaryotes that have been the majority different and from bacteria. The total contents of Cu, Mn, Ni, Pb and Zn accumulated in the soil after sewage sludge application was evaluated through out chemical analyses. Great variation in the bacterial population was found, mainly in the soil treated with the higher dose of sewage sludge. The DNA microarray technique was efficient to evaluate the alterations on the bacterial communities.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-16Bitstream added on 2014-06-13T20:24:24Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_am_dr_rcla.pdf: 1319026 bytes, checksum: b6ad03694a53b696678fbabde842876e (MD5) / O presente trabalho teve por objetivo otimizar a autólise de levedura fresca de cervejaria (Saccharomyces cerevisiae), visando a extração máxima de ácido ribonucléico da biomassa na produção do extrato de levedura. As variáveis estudadas foram pH, temperatura, % de NaCl, % de NH3, tempo de processo e, métodos de recuperação de RNA do autolisado. Os experimentos foram realizados por meio de quatro ensaios delineados segundo Box & Benken (1989) e avaliado pela Metodologia da Superfície de Resposta, utilizando-se o Software Statística 5.1 e a análise estatística ANOVA. A otimização foi concluída por meio do quinto ensaio com a produção do extrato nas condições otimizadas (55,2ºC, 9,8% de NaCl em pH=5,1 por 24 horas e, 12,2% de NH3 a 60ºC sob agitação a 200 rpm/15minutos. Três métodos foram avaliados para recuperação do RNA e das frações de extrato e parede celular: 1) autólise/plasmólise; 2) choque térmico por 1 minuto a 68ºC seguido da autólise/plasmólise 3) hidrólise química alcalina. Pelo processo de autólise em combinação com 9,8% de NaCl, a taxa de extração de RNA em 24 horas foi de 89,7%, com um rendimento de 51,3% em massa de extrato com 57,9% de proteína e, 48,7% de parede celular desidratada com 21,7 % de proteína. A utilização de 12,2% de NH3 em base seca de levedura permitiu o aumento na taxa de extração de RNA de 89,7 para 93,6%, mas um forte escurecimento foi verificado no extrato obtido. Na recuperação do RNA após precipitação protéica em pH 4,3 com posterior uso de 2 volumes de etanol em pH=2, recuperou-se 15,47%, 13,80% e 7,42% de RNA respectivamente com purezas de 49,85%, 51,70% e 38,70%. As taxas de extração de RNA da biomassa foram de 87,45% para o método 1; 91,40% para o método 2 e 78,80% para o terceiro método, indicando uma boa alternativa para redução do teor de RNA da biomassa e produção do extrato rico... / The present work had for objective to optimize the autolysis of fresh brewery’s yeast (Saccharomyces cerevisiae), aiming the maximum extraction of ribonucleic acid of biomass in the yeast extract production. The studied variables were pH, temperature, % of NaCl, % NH3, processing time and RNA recovering methods from autolysed. The experiments were accomplished by mean of four delineated assays according to Box & Benken (1989) and evaluated by Surface Methodology of Answer, utilizing the software Statistica 5.1. and the analysis statistics “ANOVA”. The optimization was concluded by mean of the fifth assay with an extract production in the optimized conditions (55.2ºC, 9.8% of NaCl in pH 5.1 for 24 hours and, 12.2% of NH3 at 60ºC under agitation at 200 rpm/15 minutes. Tree methods were evaluated for RNA recovering and of the extract fractions and cell wall: 1) autolysis/plasmolysis; 2) thermic shock during 1 minute at 68ºC followed of autolysis/plasmolysis; 3) alkaline chemical hydrolysis. The process of autolysis in combination with 9.8% of NaCl, the RNA extraction yield in 24 hours was of 89.7%, with a yield of 51.3% in extract mass with 57.9% of protein and, 48.7% of dehydrated cell wall with 21.7% of protein. The utilization of 12.2% of NH3 in dried base of yeast allowed the increase in the RNA yield extraction from 89.7 to 93.6%, but a strong darkness was observed in the obtained extract. The RNA recovering after 4.3 pH proteic precipitation with posterior use of 2 ethanol volumes in pH 2.0, it was recovered 15.47%, 13.8% and 7.42% of RNA respectively with purities of 49.85%, 51.70% and 38.70%. The RNA extraction yields of biomass were of 87.45% for the method 1; 91.40% for the method 2 and 78.80% for the third method, indicating a good alternative for RNA content reduction of biomass and rich extract production in nucleotides. The extract fractions were evaluated... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290517.pdf: 1159098 bytes, checksum: 58a9d7baad568d225d6b7768c445df02 (MD5) / O câncer de colo uterino representa o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres. As estimativas mundiais sobre incidência e mortalidade por este câncer são de 493.000 casos/ano e 288.000 óbitos/ano, sendo a incidência maior em países em desenvolvimento. No Brasil, para o ano de 2010, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou-se 18.430 novos casos. O rastreamento do câncer cervical é baseado na citologia oncótica, entretanto este é um método subjetivo, com um grau variável de resultados falso-negativos e falso-positivos. Estudos epidemiológicos e experimentais demonstram importante associação entre o Papiloma Vírus Humano (HPV) e o câncer de colo uterino, observando que este agente está presente em 99,7% dos casos. Este estudo detectou o DNA do HPV pela PCR (PCRHPV) utilizando os iniciadores consenso MY09/MY11 e nested PCR com os iniciadores GP5+/GP6+, a expressão de E6/E7 RNAm dos tipos de HPVs de alto risco 16, 18, 31, 33 e 45 pela metodologia NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) e identificou os principais tipos virais: 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 45 pela PCR-HPVte. Os resultados foram comparados com a citologia oncótica para estimar o rendimento da PCR e a contribuição da expressão de E6/E7 RNAm ao diagnóstico precoce do câncer cervical na população do estudo. Foram estudadas 162 amostras cervicais de mulheres atendidas em Florianópolis. A sensibilidade encontrada para a detecção do DNA-HPV pela PCR foi de 90,6%, especificidade de 74,6%, VPP de 46,8% e VPN de 97%. O DNA do HPV pela PCR foi detectado em 38,3% (62/162) das amostras, em 90,6% (29/32) das citologias classificadas como positivas (ASC-US +) e em 25,4% (33/130) das citologias classificadas como negativas. A expressão de E6/E7 RNAm foi detectada em 13,6% (22/162) das amostras, dessas 6,9% (9/130) foram classificadas como citologia negativa. A PCR-HPVte identificou o tipo viral em 37,1% (23/62) das amostras. Os tipos de HPVs mais frequentes do estudo considerando-se a expressão de E6/E7 RNAm e a PCR-HPVte foram: HPVs: 16 (12,5%), 33 (10,9%), 18 (7,8%), 6 (6,3%), 31 (4,7%), 45 (4,7%) e 11 (1,6%). Das 22 amostras que expressaram E6/E7 RNAm 15 eram de pacientes com idade inferior a 30 anos. De acordo com os dados encontrados neste estudo, consideramos importante, no Brasil, a mudança das estratégias de rastreamento com a associação da PCR-HPV à citologia oncótica, pois esta parece ser uma alternativa economicamente viável. A identificação das pacientes com DNA HPV positivas seguidas da determinação do tipo viral pelo método da PCR HPVte, ou realização da expressão de E6/E7 RNAm poderá contribuir com o diagnóstico precoce do câncer cervical, assim como na elaboração e no desenvolvimento de vacinas anti-HPV. A possibilidade de intervenção precoce, além de salvar vidas pode ser uma medida de economia para o SUS. / The Cervical cancer is the second more frequent type of cancer in women worldwide. The majority of cases occur in the developing world and it is the leading cause of cancer mortality in women. In Brazil, was estimated the occurrence of 18.430 new cases for 2010. The cervical screening is based on cytology; however it is subject of a substantial degree of false-negative and false-positive results. Epidemiological and experimental studies have demonstrated an important association between Human Papilloma Virus (HPV) and cervical cancer, noting that this agent is present in 99.7% of cases. This study detected HPV DNA by PCR (PCR-HPV), the expression of mRNA E6/E7 by the NASBA method (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. The results were compared with cytology to estimate the yield of PCR and mRNA E6/E7 expression contribution to early diagnosis of cervical cancer in the study population. We studied 162 cervical samples of women from Florianopolis city, Brazil using the consensus primers MY09/MY11 and nested PCR with the primers GP5+/GP6+ to detect generic HPV, the oncogene expression of proteins E6/E7 mRNA to high-risk 16, 18, 31, 33 and 45 HPV types by NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-bioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18, 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. Our study found to PCR-HPV a sensitivity of 90.6%, a specificity of 74.6%, a PPV of 46.8% and a NPV of 97%. HPV DNA was detected in 38.3% (62/162) of samples, corresponding to 90.6% (29/32) of cytology positive (ASC-US +) and 25.4% (33/130) of cytology negative. The mRNA E6/E7 expression was detected in 13.6% (22/162), 6.9% (9/130) of these with negative cytology. The PCR-HPVte identified viral type in 37.1% (23/62) of samples. The most frequent HPV types found, considering the expression of mRNA E6/E7 and PCR-HPVte were: 16 (12.5%), 33 (10.9%), 18 (7.8%), 6 (6.3%), 31 (4.7%), 45 (4.7%) e 11 (1.6%). Of the 22 samples that expressed mRNA E6/E7 15 were from patients younger than 30 years. According to the data found in this study, we consider important in Brazil, change the screening strategies with the combination of PCR-HPV with the cytological analysis, as this seems to be an economically viable alternative. The identification of patients with positive HPV DNA followed by the determination of viral type by the CR-HPVte or detection of the E6/E7 oncogene expression may contribute to the early diagnosis of cervical cancer, as well as in formulating and developing strategies for vaccine#HPV. The possibility of early intervention, save lives and can be a cost-saving measure for the Brazilian Unified Health System.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-19Bitstream added on 2014-06-13T20:53:55Z : No. of bitstreams: 1 000749212.pdf: 2326147 bytes, checksum: b30560592085048dea18f80f7e336ca1 (MD5) / Os MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos não codantes de 20-22 nucleotídeos (nt) que regulam a expressão gênica de genes-alvos. Eles estão envolvidos em diversos aspectos de desenvolvimento da planta, tanto na parte aérea, quanto no sistema radicular. Os miRNAs e seus genesalvos tem uma complementariedade quase perfeita em plantas, sendo que esta complementaridade está relacionada à origem dos genes de miRNAs (genes MIRs). A hipótese mais aceita para a origem dos genes de miRNAs é a “hipótese de duplicação invertida”, a qual propõe que os genes de miRNAs surgiram a partir de duplicações invertidas do seus genes-alvos nos genomas vegetais. Muitos genes-alvos de miRNA em plantas codificam para fatores de transcrição, tais como os genes SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPLs). Alguns membros da família SPL são regulados por ambos os miRNAs, miR156 e miR529. O sítio de reconhecimento destes microRNAs em transcritos de genes SPLs é conservado e difere somente por sete nucleotídeos. Enquanto o miR156 é altamente conservado entre Angiospermas, incluindo arabidopsis, o miR529 aparentemente está presente somente em eudicotiledôneas basais, monocotiledôneas e no musgo Physcomitrella patens. Neste trabalho, foram realizadas duas abordagens para o estudo da via miRNAs/SPL. Na primeira abordagem, foi analisada a evolução e a possível função da via miR529/SPL em monocotiledôneas e eudicotiledôneas. Foi testado o sítio de reconhecimento do miR529b em dois genes SPLs (SPL9 e SPL15) de arabidopsis encontrados bioinformaticamente via geração de plantas transgênicas de arabidopsis superexpressando o precursor de arroz OsMIR529b. As linhagens transgênicas de arabidopsis (OsMIR529b-OE) apresentaram fenótipos vegetativos e reprodutivos similares aos de plantas duplo mutantes de perda de função para os genes SPL9 e SPL15 de arabidopsis (denominado spl9/spl15). Estes... / MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of 20-22 nucleotides (nt) in length that regulate the gene expression transcriptionally and posttranscriptionally. They are involved in many aspects of plant development, both in the shoot and in the root systems. MiRNAs and their target genes have an almost perfect complementarily in plants, and this is related to the complementarity of genes origin of miRNAs genes (MIR genes). The most accepted hypothesis for the origin of miRNA genes is the inverted duplication hypothesis, which proposes that genes of miRNAs arose from inverted duplications of their target genes in plant genomes. Many miRNA target genes in plants encode transcription factors such as SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPLs). Some SPL family members SPL are regulated by both miRNAs, miR156 and miR529. The recognition site for these microRNAs in SPL transcripts is conserved and only differs by seven nucleotides. While miR156 is highly conserved among Angiosperms, including Arabidopsis thaliana, miR529 is apparently present only in basal eudicots, monocots and in the moss Physcomitrella patens. In this work, were performed two approaches to study miRNA-direct SPL gene regulation. In the first approach, we analyzed the evolution and possible function of the miR529/SPL pathway in monocots and eudicotyledonous. We searched for miR529b recognition sites in SPL genes from core eudicots, such as Arabidopsis thaliana. Interestingly, we found two miR529b-targeted SPLs (SPL9 and SPL15) in Arabidopsis and showed that the recognition sites are functional via the generation of transgenic Arabidopsis plants overexpressing OsMIR529b. OsMIR529b-OE overpressors are phenotipically and molecularly similar to the double mutant spl9/spl15. Our data suggest that miR529b is processed and functional in core eudicots and that this microRNA was recently lost in the evolutionary history of the ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-03Bitstream added on 2014-06-13T20:53:59Z : No. of bitstreams: 1 costa_pr_me_botib.pdf: 664900 bytes, checksum: d4b731cf5ba2463de35082d25d1fdb1e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A transcrição realizada pela RNA polimerase (RNAP) é um processo cuidadosamente controlado no desenvolvimento e na manutenção das funções vitais dos organismos. O desenvolvimento de novas técnicas e equipamentos para seu estudo, como as técnicas de pinça ótica ou magnética, a microscopia de força atômica e a fiuorescência de molécula única, complementaram os resultados dos estudos bioquímicos tradicionais e nos levaram a um maior entendimento do processo. A ocorrência de pausas em sítios específicos durante o alongamento, já observadas na década de 80, passou a ser estudada com maior interesse devido a sua importância biológica: acredita-se que essas pausas assegurem que a transcrição e a tradução ocorram simultaneamente em bactérias, permitam o dobramento correto das estruturas secundárias e terciárias do R A, facilitem a ligação de reguladores de alongamento e precedam a etapa de terminação transcricional. Modelos teóricos baseados na estabilidade termodinâmica do complexo de alongamento transcricional foram bem sucedidos na previsão da cinética do alongamento. Seus resultados indicaram que a RNAP pode ser vista como um motor molecular e sua motilidade possui características do modelo de catraca browniana. Entretanto, esses modelos consideram a presença de apenas uma polimerase realizando a transcrição. Experimentos recentes mostraram que a ocorrência de colisões entre essas enzimas durante a transcrição múltipla de um mesmo gene altera seu comportamento. Baseados nesses resultados, propomos a generalização de um dos modelos estocásticos que consideram a sequência molde para o estudo desse fenômeno. Em nossa aproximação, colisões entre as moléculas RNAP modificam a taxa de ocorrência da transcrição. A implementação do modelo foi realizada em... / The transcription of the information encoded within the DNA to the RNA molecule is exquisitely controlled during the development of the organisms and to its vital functions and has as the protagonist the RNA polymerase enzyme (RNAP). The development of single-molecule techniques, such as the magnetic and optical tweezers, atomic-force microscopy and single-molecule uorescence, increased our understanding of the process, complementing traditional biochemical studies. The non-homogeneity of the RNAP movement due to the occurrence of \pauses at speci c sites during elongation was revealed using electrophoresis gels. It is believed that these pauses ensure concurrency between transcription and translation in bacteria, allow the correct folding of RNA secondary and tertiary structures, facilitate the binding of regulating factors during elongation and preceding the transcriptional termination step. Theoretical models have been proposed to explain and predict the RNAP kinetics during the polymerization. Models based on the thermodynamic stability of the transcription elongation complex recover much of the kinetics and indicate that its movement has a Brownian ratchet mechanism. However, experiments showed that if more than one RNAP molecule initiate from the same promoter, their behavior changes and new phenomenona are observed. We proposed and implemented a theoretical model that considers collisions between RNAP molecules and predicts their cooperative behavior during multi-round transcription. The model generalizes a stochastic sequence-dependent model. In our approach, collisions between elongating enzymes modify their transcription rate values. We performed the simulations in Mathematica and compared the results of the single and the multiple-molecule transcription with experimental... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-23Bitstream added on 2014-06-13T19:54:00Z : No. of bitstreams: 1 nachtigall_pg_me_botib.pdf: 1512670 bytes, checksum: c79b570dced4bdd72d93ec49ab217896 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / MicroRNAs são pequenas moléculas de RNA que regulam pós-transcricionalmente a expressão gênica em diversas vias celulares específicas. Recentemente, alguns miRNAs de ação músculo-específica, especialmente aqueles expressos no músculo estriado esquelético, têm sido associados à regulação da biologia muscular, com papel fundamental no controle de eventos como miogênese e crescimento muscular hipertrófico e hiperplásico, além de constituírem vias metabólicas extremamente conservadas entre os vertebrados. A tilápia do Nilo é considerada um excelente modelo biológico para o estudo de miRNAs em vertebrados devido à sua importância econômica e por apresentar o genoma completo sequenciado. Contudo, pouco é conhecido a respeito da dinâmica evolutiva de miRNAs e sua potencial atuação na regulação dos mecanismos moleculares promotores do desenvolvimento do tecido muscular na espécie. Assim, foram realizados dois estudos direcionados para a (i) avaliação do perfil de expressão de miRNAs músculo-específicos e seus alvos no tecido muscular de adultos da tilápia do Nilo, e para (ii) analisar o padrão de organização genômica desses miRNAs em diferentes espécies de peixes e estabelecer comparações com outros grupos de vertebrados. Os principais resultados obtidos na análise do perfil de expressão no tecido muscular esquelético de cinco miRNAs músculo-específicos (miR-1, -133a, -133b, -206 e -499) evidenciaram um alto nível de expressão do miR-499 no músculo vermelho em comparação aos níveis observados no músculo branco. Esses dados, corroborados pela hibridação in situ e análise da expressão de genes alvo do miR-499, sugerem sua participação como elemento central na regulação de vias metabólicas particularmente ativas no músculo de contração lenta (vermelho) na tilápia do Nilo. De modo geral, as análises genômicas... / MicroRNAs are small RNA molecules that post-transcriptionally regulate gene expression in various specific cell pathways. Recently, some miRNAs have been described to have a muscle-specific action and has been associated with regulation of muscle biology with fundamental roles in myogenesis. The Nile tilapia is considered an excellent biological model for the study of miRNAs in vertebrates due to their economic importance and to present the complete genome sequenced. However, little is known about the evolutionary dynamics of miRNAs and their potential role in regulating the molecular mechanisms that promote the muscle development on Nile tilapia. Thus, two studies were conducted: (i) a study to evaluate the expression pattern of muscle-specific miRNAs and their targets in different skeletal muscle types in adults of Nile tilapia, and (ii) a study to analyze the comparative evolutionary dynamics and genomic organization of these miRNAs in fish genomes. Our expression analysis by qPCR and in situ hybridization, carried out on five muscle-specific miRNAs (miR-1, -133a, -133b, -206 and -499), revealed a highly differential expression of miR-499 in red skeletal muscle (slow-twitch). These data evidenced the key role played by the miR-499 in the maintenance of the slow-twitch muscle type in Nile tilapia. The comparative genomic analysis performed on six species of fish showed a conserved dynamism for the muscle-specific miRNAs analyzed (miR-1-1/-133a-2, miR-1-2/133a-1, miR-206/133b, miR-214 e miR-499). However, a copy of miR-214 was detected in the genome of five species belonging to the superorder Acanthopterygii. Interestingly, this copy also has a high level of synteny over the species when it was detected. Thus, the obtained data may assist in the understanding of the role of muscle-specific miRNAs in muscle biological pathways... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-13Bitstream added on 2015-05-14T16:59:00Z : No. of bitstreams: 1 000829164.pdf: 1229097 bytes, checksum: c02b3e98095839e2ebc9ba29eeeeba97 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ...

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-29Bitstream added on 2015-05-14T16:58:45Z : No. of bitstreams: 1 000828932.pdf: 760604 bytes, checksum: c30674cef7dfc0506331193c0c9efe70 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido às diversas formas de apresentação clínica e aos sinais clínicos comuns com outras afecções, o diagnóstico laboratorial do CDV (Canine distemper virus) se torna necessário. A RT-PCR seguida da NESTED com amostras de urina é atualmente a técnica mais recomendada para o diagnóstico do CDV. No Capítulo 2, foi desenvolvida a técnica de One-Step-RT-qPCR utilizando o sistema de detecção Syber Green I. Foram testados e comparados três kits comerciais (Sigma®, Promega® e Qiagen®). Foi determinada a sensibilidade analítica de dois sistemas de detecção (Sistema A e Sistema B) utilizando uma curva padrão de RNA sintético. Os três kits comerciais testados detectaram o vírus em 100% das urinas provenientes de animais sintomáticos e o kit da Qiagen® mostrou melhores resultados de reação. O Sistema A detectou aproximadamente 10 cópias de RNA por microlitro e no Sistema B detectou 100 cópias de RNA por microlitro na RT-qPCR e 10 cópias por microlitro quando seguida da NESTED-qPCR. No Capítulo 3 foram desenvolvidos três imunoconjugados de microesferas de poliestireno (MP) utilizando anticorpos policlonais hiperimunes anti-CDV (IgY, IgG e Proteína A+IgG) para o preparo de RNA e aplicação na RT-qPCR. A aplicação dos conjugados foi comparada ao método convencional de extração de RNA por kit comercial. Os conjugados foram padronizados e a sensibilidade analítica foi determinada através de curva padrão de RNA sintético. A sensibilidade diagnóstica foi determinada utilizando-se conjugado com IgY, MP sem anticorpos conjugados e urina adsorvida diretamente nos tubos de qPCR / The diagnosis of canine distemper is usually based on clinical suspicion of the disease. However, due to the different clinical forms of the disease and other disorders common to clinical signs, the laboratory diagnosis is necessary. The RT-PCR followed by NESTED is currently the method used to diagnosis of CDV (Canine Distemper Virus). The Chapter 2 aimed to standardized the technique of One-Step RT-qPCR-using Syber Green I system. Three commercial kits (Sigma®, Promega® and Qiagen®) were tested and compared. Analytical sensitivity of two detection systems (System A and System B) was determined using a standard curve. The three commercial kits tested detected the virus in 100% of samples from symptomatic dogs and the kit of Qiagen® showed better results. The System A detected approximately 10 RNA copies/μL and System B detected approximately 100 RNA copies/ μL in RT-qPCR and 10 RNA copies/ μL when followed by NESTED-qPCR. In Chapter 3 three immunoconjugates were developed with polystyrene microspheres (PM) using polyclonal hyperimmune anti-CDV antibody (IgY, IgG and protein A+IgG) to prepare RNA to canine distemper molecular diagnosis and comparison with the conventional method of RNA extraction by commercial kit. Conjugates were standardized and the analytical sensitivity was determined by standard curve. The diagnostic sensitivity was determined using IgY-conjugated, PM without conjugated antibodies and urine adsorption directly qPCR in tubes / FAPESP: 2011/50889-9

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:49:13Z : No. of bitstreams: 1 000829952.pdf: 2186504 bytes, checksum: 0fe5b3ab3f81a06b3bdec5cf05d69c8a (MD5) / O Eucalyptus é um dos gêneros mais importantes no setor florestal mundial. Por esse motivo, programas de melhoramento genético florestal são desenvolvidos no intuito de aumentar a produtividade, introduzir características desejáveis e reduzir impactos ambientais. No entanto, características deletérias podem ser incorporadas em determinados cruzamentos nos ciclos de melhoramento, seja por endogamia biparental ou segregação de loci heterozigóticos. As anomalias são um exemplo deste efeito e podem acarretar perdas na produção de mudas, na produtividade e atrasos no desenvolvimento de genótipos elite. Portanto, a identificação e caracterização de genes relacionados às anomalias são muito importantes nos programas de melhoramento. Ao realizar um cruzamento controlado entre dois indivíduos de Eucalyptus grandis, a empresa Suzano Papel e Celulose detectou uma anomalia com segregação mendeliana de 3 (normais) :1 (anormais) na progênie. As plântulas anômalas morrem em poucos meses e diferem significativamente em algumas características morfológicas, como altura, diâmetro da base do caule, dimensões e forma do limbo foliar e número de ramificações laterais. Estudos prévios permitiram identificar uma marca molecular ligada à anomalia que apresentou identidade com genes da superfamília Bet v1, família PR10 (pathogenesis-related protein 10). No entanto, não era claro o envolvimento desta família gênica no desenvolvimento da anomalia. Neste cenário, o presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização dos genes envolvidos na anomalia detectada. Genes e vias metabólicas, diferencialmente expressos entre os fenótipos contrastantes, demonstraram elevada atividade em processos relacionados à resposta de defesa nas plantas anormais. Tais resultados sugerem que a anomalia é causada pela ativação inadequada do sistema imune da planta (resposta autoimune) associado à incompatibilidade ... / Eucalyptus is one of the most important genus in worldwide forestry culture. For this reason forest improvement programs are developed aiming the increase of productivity, the introduction of desirable traits and the reduction of environmental impacts. However deleterious traits can be incorporated in certain crossings through the recurrent improvement cycles either by biparental inbreeding or by segregation of the heterozygous loci. Anomalies are an example of this deleterious effect and they can cause losses in seedling production, productivity and delays in the elite genotypes development. Thus, the identification and characterization of genes related to the anomalies are very important in forest improvement programs. In a controlled cross between two Eucalyptus grandis individuals, the Suzano Papel and Celulose SA company has detected an anomaly with Mendelian segregation ratio of 3 (normal) :1 (abnormal) in the progeny. Abnormal seedlings die in a few months and show significant difference in some morphological characteristics, such as height, stem-base diameter, dimensions and shape of leaf lamina, and number of branches. Previous studies allowed the identification of a molecular marker related to the anomaly that showed identity with Bet v1 superfamily genes, PR10 family (pathogenesis-related protein 10). However, it was not clear the involvement of this gene family in the anomaly. In this scenario, the present study aimed to identify and characterize the genes involved in the detected anomaly. Genes and metabolic pathways, differentially expressed between the contrasting phenotypes, showed high activity of process related to defense response in abnormal plants. These results suggest that the anomaly is caused by the inappropriate activation of the immune system of the plant (autoimmune response) associated with genetic incompatibility. The gene families of thaumatin-like proteins, Bet v1 proteins, and chitinase class I proteins ...