Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T20:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270312.pdf: 1276526 bytes, checksum: df4944e102b03f66313ae4454f115adf (MD5) / Embora adenovírus (Ad) humano do sorotipo 5 tenha sido utilizado como vetor vacinal contra inúmeras doenças infecciosas, a população humana apresenta imunidade pré-existente contra estes vírus. Para transpor este problema, Ad de outras espécies animais, tal como o Ad isolado de chimpanzés do sorotipo 6, denominado AdC6, tem sido utilizado. No entanto, existem poucos estudos sobre a resposta imune induzida por AdC6 em tecidos de mucosas. Este estudo avaliou células T ?/d e células NK das mucosas do trato genital de camundongos BALB/c após imunização intravaginal com o vetor AdC6 expressando a proteína Gag do HIV-1 (AdC6gag37). Análises de citometria de fluxo demonstraram que imunização com 1010 partículas virais de AdC6gag37 aumentou a frequência e o número de células T ?/d nas mucosas do trato genital. O número de células T ?/d atingiu seu pico três dias após a imunização, uma resposta que decresceu no sétimo dia. Além disso, detectou-se aumento relevante da expressão do marcador de ativação CD69 em células T ?/d do trato genital. Entretanto, não houve alteração na expressão da molécula CD25. Adicionalmente, para investigar o perfil de expressão gênica após exposição ao vetor adenoviral, células T ?/d do trato genital de camundongos imunizados foram isoladas magneticamente e avaliadas através de PCR em tempo real. Observou-se que AdC6gag37 foi capaz de aumentar a expressão de genes (1) relacionados com mecanismos de citotoxicidade mediado por células, tais como perforina e granzima B, (2) citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e IL-12 e (3) quimiocinas CXCL-10, CCL5, CCL3 e CCL4. Demonstrou-se também que imunização com AdC6gag37 (105 e 107 partículas virais) foi capaz de induzir aumento expressivo na freqüência e no número de células NK do trato genital. Estes resultados indicam que AdC6gag37 modula a freqüência e o número de células T ?/d e células NK nas mucosas do trato genital e sugerem que estas células podem influenciar a resposta imune durante a imunização.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T10:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 288452.pdf: 18421548 bytes, checksum: 1fce1ff2624a6da0c4283042fc679586 (MD5) / AIDS é um dos principais problemas de saúde pública atuais e acredita-se que a epidemia somente será controlada com uma vacina capaz de impedir ou controlar a infecção causada pelo HIV. Inúmeras estratégias vacinais têm sido investigadas experimentalmente, dentre elas o uso de vírus recombinantes como vetores vacinais, para indução de resposta imune no trato genital, uma das mais importantes portas de entrada do HIV. Neste estudo avaliou-se a indução de células T no trato genital feminino de camundongos BALB/c mediante a administração de vetores adenovirais expressando a proteína Gag de HIV-1. Diferentes protocolos de imunização utilizando vetores adenovirais símios foram avaliados quanto à indução de resposta imune celular Gag-específica em tecidos sistêmicos e de mucosas. A imunização por via intranasal induziu baixa frequência de células T CD8+ Gag-específicas no trato genital e em tecidos sistêmicos. A imunização por via intramuscular foi capaz de induzir frequência de células T CD8+ Gag-específicas de maior magnitude do que a administração por vias de mucosa, sendo esta resposta detectada em diversos tecidos, inclusive no trato genital feminino, por ao menos um ano após a administração da vacina. As células T CD8+ Gag-específicas de origem genital apresentaram elevada expressão de diversos marcadores de ativação celular e secretaram IFN- . A administração intramuscular do vetor adenoviral alterou também a frequência e o fenótipo de células T CD4+ e CD8+ de origem genital. Foi observado que apesar de anticorpos neutralizantes representarem a principal forma de interferência da imunidade pré-existente ao vetor vacinal na indução de células transgene-específicas em tecidos sistêmicos e sangue, no tecido mucoso esta situação é provavelmente também mediada por mecanismos celulares. Em conjunto, estes resultados sugerem que a administração intramuscular de vetores adenovirais símios expressando a proteína Gag de HIV-1 induz resposta imune celular transgene-específica capaz de residir no trato genital feminino por longos períodos, sendo que esta resposta pode ser alterada pela presença de imunidade pré-existente contra o vetor vacinal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223442.pdf: 486908 bytes, checksum: 416277d8611ae8789a29052571a0b516 (MD5) / Os produtos naturais constituem uma fonte inesgotável de compostos com atividades farmacológicas promissoras, incluindo ação antiviral. Os materiais protéicos são encontrados em abundância na natureza e têm atividades biológicas como antibacteriana, antifúngica, antitumoral e antiviral comprovadas. Neste trabalho, a citotoxicidade (CC50) e a atividade antiviral (CE50) de peptídeos antimicrobianos (PAM) e hemolinfa de ostras (Crassostrea gigas e C. rhizophorae), foram avaliadas, em células VERO, HEp-2 e MA104 e contra os vírus herpes simplex tipo 1(HSV-1/KOS), adenovírus sorotipo 5 (AdV-5), rotavírus símio SA-11 (RV-SA11), pelo ensaio colorimétrico do MTT, utilizando diferentes estratégias. Para a hemolinfa das ostras também foi realizado o estudo da ação virucida. Dentre os PAM testados, a peneidina apresentou o maior índice de seletividade (IS= CC50/ CE50) para o HSV-1/KOS (IS = 64). A hemolinfa de ostras apresentou ação virucida contra os três vírus avaliados neste estudo, também apresentando atividade anti-herpértica (IS = 19,76/C. rhizophorae) e antiadenovírus (IS = 5,33/C. gigas), sem, no entanto, exibir ação antiviral contra o rotavírus. Foram observados, em alguns casos, baixos IS, associados a altas porcentagens de inibição da replicação viral, mais evidente no grupo dos PAM. Estudos adicionais devem ser realizados a fim de se confirmar a atividade antiviral e prováveis mecanismos ação.

The central aim of this thesis was to develop strategies to improve the manufacture of the group B chimeric oncolytic adenovirus, ColoAd1, which rapidly kills and lyses host cells. In attempting to improve the cellular yield of ColoAd1, this thesis therefore sought to identify host infection-related factors that limited ColoAd1 production. In the widely-used manufacturing cell line, HEK293, ColoAd1 replication depleted intracellular ATP earlier than Ad11p and activated the intracellular energy sensor, AMPK. This might have reflected earlier ATP depletion, or possibly the absence of the E4orf4 protein from ColoAd1 compared to Ad11p. Despite this difference in AMPK activation, both viruses appeared able to maintain mTORC1 activity, which may be essential particularly for protein synthesis in the early stages of virus infection. For production purposes, preventing intracellular ATP depletion was seen as an attractive mechanism of maintaining ColoAd1 infected host cell viability and was hypothesised to lead to increased virus yield. A range of strategies were explored to enhance depleting ATP levels. Even though none of these were dramatically successful, they indicated that perhaps the anabolic building blocks required for viral replication were more important than cellular energy levels. Finally, a screening methodology based on siRNA knockdown was used to identify kinases that affected ColoAd1 replication. Many hits were identified, and several candidate kinases indicated a role for intracellular calcium signalling limiting virus particle production. Overall, data presented in this thesis supports the manufacture of ColoAd1 in HEK293 cells and suggest that enhancing glycolysis may increase ColoAd1 yield. It also provides mechanistic insights into the replication of ColoAd1 and Ad11p that may inform the improved design of group B oncolytic adenoviruses.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326890.pdf: 1550379 bytes, checksum: 4467973ef072bbc92664ef0a80daa810 (MD5) Previous issue date: 2014 / A depuração de moluscos bivalves é um processo utilizado que resulta na expulsão de patógenos humanos presentes em seus tecidos. Durante a depuração, a etapa de desinfecção da água do mar é de extrema importância, sendo a luz ultravioleta (UV) o principal desinfetante utilizado. Modelos virais são geralmente empregados para substituir vírus fastidiosos em estudos de viabilidade. O adenovírus recombinante que expressa a proteína verde fluorescente (rAdV-GFP) oferece uma potencial aplicação no campo da virologia ambiental. Assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência na desinfecção viral de um tanque de depuração de moluscos com sistema fechado acoplado a um tratamento de luz UV utilizando os modelos rAdV-GFP e norovírus murino (MNV-1). Primeiramente, foi estabelecido o tempo de pós-infecção em que era possível detectar a fluorescência em células infectadas com o adenovírus recombinante. Em seguida, foi avaliado o limite de detecção das técnicas de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência e comparados com o ensaio de placa de lise. Para avaliar a eficiência da depuração na água do mar foram utilizados dois tanques, sendo um com tratamento com luz UV (36W) e outro sem tratamento. Para aferir a influência da água do mar na estabilidade viral, a água foi inoculada com rAdV-GFP e MNV-1 e foram feitas amostragens de um litro no tempo inicial (0h) e após 24h e análise por microscopia de fluorescência. Como resultados, o tempo de pós-infecção estabelecido para detecção de células fluorescentes infectadas por rAdV-GFP foi de 24h. A citometria de fluxo mostrou baixa sensibilidade, ao contrário da microscopia de fluorescência, que foi semelhante ao ensaio de placa de lise. Em ambas as técnicas a água do mar não influenciou na detecção da fluorescência de células infectadas por rAdV-GFP. No ensaio de desinfecção da água do mar nos tanques de depuração, o MNV-1 foi completamente inativado após 24h em ambos os tanques. A viabilidade do rAdV-GFP decaiu 99,99% após 24h de depuração com UV e 48h no tanque sem tratamento. Neste trabalho, concluiu-se que o rAdV-GFP se mostrou um eficaz modelo viral para estudos de estabilidade e desinfecção de adenovírus humanos, sendo de fácil cultivo e replicação, de baixo custo, fornecendo resultado rápidos e com alta sensibilidade, principalmente pela técnica de microscopia de fluorescência. Além disso, o processo de depuração foi eficiente para inativação dos vírus estudados na água do mar, com maior eficiência quando aplicado o tratamento com luz UV.<br> / Abstract : Shellfish depuration is a process that results in the elimination of pathogens from their tissues. During purification, the disinfection of the seawater is of utmost importance for the inactivation of human pathogens and ultraviolet (UV) light is the main disinfectant used. Viral models are usually employed as surrogate of fastidious viruses in viability studies. The recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP- rAdV) offers a potential application in environmental virology. This study aimed to evaluate the efficiency of viral disinfection on depuration that used closed system coupled with UV light treatment using rAdV-GFP and murine norovirus (MNV-1) as models. First, the time post infection at which it was possible to detect fluorescence in cells infected with the recombinant adenovirus cells was established. Next, we evaluated the detection limit of flow cytometry and fluorescence microscopy techniques compared with the plaque assay (PFU). To evaluate the efficiency of the seawater purification, two tanks were used, one coupled with UV light (36W) and one without UV light treatment. To assess the influence of seawater in the viral stability, water was inoculated with rAdV-GFP and MNV-1 and one liter sample was analyzed by fluorescence microscopy at the initial time (0h) and after 24h post seeding. The time post-infection established for the detection of infected GFP- fluorescent cells rAdV was 24h. Flow cytometry showed low sensitivity, when compared with fluorescence microscopy, which was similar to plaque assay. In both techniques the sea water matrix did not shown influence on the detection of fluorescence of GFP-rAdV infected cells. In the disinfection tests of sea water in the purification tanks, the MNV-1 was completely inactivated after 24 h in both tanks. rAdV-GFP declined 99.99% after 24 h in the tank coupled with UV and 48h in the tank without UV treatment. We concluded that the rAdV-GFP showed to be a effective viral model for stability studies and disinfection as surrogate for human adenoviruses, being easy to replicate in vitro, at low cost, giving quick results with high sensitivity, especially fluorescence microscopy method. Moreover, depuration process was effective to inactivate viruses in seawater with its efficiency improved when applying UV light for the water treatment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191325.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225389.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Orientador: Clarice Weis Arns, Marvin J. Grubman / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caron_Luizinho_D.pdf: 1219328 bytes, checksum: a478f21f170a75258c560038bbb4da1e (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A febre aftosa é uma das doenças mais temidas nos rebanhos em todo o mundo. A vacinação tem sido uma arma eficiente no controle da doença, no entanto há preocupações com as vacinas atualmente utilizadas incluindo a necessidade de instalações de alta segurança para a produção dessas vacinas e a falta de um teste de diagnóstico aprovado que faça distinção precisa entre animais vacinados. Varias vacinas têm sido testadas contra a febre aftosa e uma dessas utiliza como vetor um vírus defectivo para replicação, derivado do adenovírus humano tipo 5 (Ad5), o qual contém as proteínas que compõe capsídeo do vírus da febre aftosa (P1-2A) e a protease 3C que protegeu suínos completamente contra o desafio de uma cepa homóloga (A12 e A24). Uma vacina com o Ad5-P1-2A+3C proveniente da cepa O1 Campos (Ad5-O1C), induziu um baixo título de anticorpos neutralizantes específicos em testes de potência vacinal em suínos. O fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) tem sido utilizado com sucesso na formulação de vacinas para estimular a resposta imune contra inúmeras doenças, incluindo HIV, Hepatite C e B entre outros. Na tentativa de melhorar a resposta imune específica contra a febre aftosa induzida pelo Ad5-O1C, suínos foram vacinados com Ad5-O1C juntamente com Ad5-pGM-CSF. Entretanto, nas condições utilizadas nesse teste, o uso do Ad5 expressando o gene do pGM-CSF (fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos de suíno) não melhorou a resposta imune do Ad5-O1C e adversamente afetou o nível de proteção de suínos desafiados com o vírus homólogo da febre aftosa / Abstract: Foot-and-mouth disease (FMD) is one of the most feared diseases of livestock worldwide. Vaccination has been a very effective weapon in controlling the disease, however a number of concerns with the current vaccine including the inability of approved diagnostic tests to reliably distinguish vaccinated from infected animals and the need for high containment facilities for vaccine production, have limited its use during outbreaks in countries previously free of the disease. A number of FMD vaccine candidates have been tested and a replication-defective human adenovirus type 5 (Ad5) vector containing the FMDV capsid (P1-2A) and 3C protease coding regions has been shown to completely protect pigs against challenge with the homologous virus (FMDV A12 and A24). An Ad5-P1-2A+3C vaccine for FMDV O1 Campos (Ad5-O1C), however, only induced a low FMDV-specific neutralizing antibody response in swine potency tests. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) has been successfully used to stimulate the immune response in vaccine formulations against a number of diseases, including HIV, hepatitis C and B etc. To attempt to improve the FMDV-specific immune response induced by Ad5-O1C, we inoculated swine with Ad5-O1C and an Ad5 vector containing the gene for porcine GM-CSF. However, in the conditions used in this trial, pGM-CSF did not improve the immune response to Ad5-O1C and adversely affected the level of protection of swine challenged with homologous FMDV / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Cancer är idag en vanlig sjukdom som uppstår på grund av okontrollerad celltillväxt och kan visa sig som cirka 200 olika sjukdomar beroende på vilken celltyp som drabbas. Trots dagens standardterapier med kirurgi, strålning och kemoterapi så dör årligen runt 23 000 människor av cancer i Sverige. Dödsfallen beror ofta på svåråtkomliga metastaser som bildats från ursprungstumören och sedan spridits med blod och lymfa ut i kroppen. En långt gången cancer kan även visa upp resistens mot vissa terapier, vilket försvårar behandling ytterligare.  Det är därför viktigt att nya effektiva läkemedel och behandlingsmetoder utvecklas. Ett alternativ är onkolytisk virusterapi. Onkolytiska adenovirus är modifierade till att selektivt replikera i och lysera tumörceller, samtidigt som friska celler lämnas opåverkade. Genom att armera det onkolytiska adenoviruset med cytokinet granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) kan den terapeutiska effektiviteten ökas ytterligare. GM-CSF kommer då uttryckas i infekterade tumörceller och stimulera kroppens immunförsvar till ökad antitumoral immunrespons. Syftet med detta arbete var att undersöka om behandling med onkolytiskt adenovirus armerat med GM-CSF kan fungera som behandling mot cancer. För att svara på frågeställningen analyserades fem vetenskapliga studier som rörde frågeställningen. Två av dessa var av fas I-typ och hade därför som främsta syfte att undersöka säkerheten hos olika doser. Den antitumorala effekten studerades dock också och därför inkluderades de i arbetet. Antitumorala effekter sågs hos vissa patienter i form av minskning av tumörstorlek, densitet och tumörmarkörer i blodet. I studier där CD8+ T-celler mättes sågs ofta en ökning av nivån vilket kan tyda på ökad immunrespons.  Patientgrupperna var små i samtliga studier vilket gör det svårt att dra några slutsatser om behandlingens effektivitet. I tre av fem studier hade patienterna även olika cancersjukdomar, vilket försvårar analysen ytterligare. Resultaten från behandlingen ser lovande ut med milda biverkningar, men för att med säkerhet kunna säga att det finns en antitumoral effektivitet hos onkolytiskt adenovirus armerat med GM-CSF krävs större studier på mer specifika patientgrupper.

El avance en la investigación en terapia génica durante los últimos años ha generado interés en la construcción y producción de vectores virales, siendo actualmente los adenovirus los más utilizados en ensayos clínicos de terapia génica. Para satisfacer la demanda de estos vectores, es necesaria su producción a gran escala. Debido a esto, la caracterización del crecimiento de las células de riñón de embrión humano (HEK293) es de gran importancia para la identificación de factores que permitan la optimización de las condiciones de producción y una mejora en el rendimiento en la producción de adenovirus. En este trabajo se realizó una comparación del estado metabólico y del nivel de proteínas para cultivos de células HEK293 durante el crecimiento y producción de adenovirus. Se determinaron los parámetros de crecimiento para células creciendo adheridas en medio suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y para células adaptadas a crecer en un medio bajo en suero, suplementado con 0,5% de SFB, 40 [mg/L] de albúmina de suero bovino (BSA) e intralípidos al 0,01 [%v/v]. Las células adaptadas a crecer en el medio bajo en suero alcanzaron una concentración celular de 2x106 [cel/mL], comparable al caso base, logrando un crecimiento uniforme usando placas cebadas. En el caso de células creciendo adheridas, se observó que al consumirse completamente la glucosa éstas comenzaban a consumir lactato como fuente alternativa de carbono. Esto significó una extensión en la mantención del cultivo tanto en medio bajo en suero como en medio suplementado con 10% de SFB. Se adaptaron células a crecer en suspensión en spinners con medio bajo en suero suplementado con Pluronic F-68 y antiaglomerante, alcanzando una concentración de 1x106 [cel/mL]. Esta concentración es un 48% inferior a la obtenida creciendo adheridas, presentando además tasas de consumo de glucosa y producción de lactato un 71% y 76% menores, respectivamente. Durante la producción de adenovirus se registraron mayores tasas de consumo de glucosa y producción de lactato que las alcanzadas en el crecimiento, sin presentar un aumento de biomasa. Esto indica un cambio en el metabolismo celular durante la producción de adenovirus. Al mismo tiempo se observó una disminución de la viabilidad celular producto de la acción lítica del adenovirus. La mayor producción de virus se alcanzó en células creciendo adheridas en medio con 10% de SFB con un título de 1,6x1013 [pfu/mL] a las 48 [hpi]. A través de un ensayo de ELISA intracelular se cuantificaron enzimas claves del metabolismo del carbono, siendo las enzimas estudiadas: Fosfofructoquinasa (PFK), Piruvato deshidrogenasa (PDH), Lactato deshidrogenasa (LDH), y α-Ketoglutarato deshidrogenasa (α-KGD). Se comparó la cantidad de enzimas entre células creciendo en medio suplementado con 10% y 0,5% de SFB, tanto para el estado de crecimiento como para la producción de adenovirus. Se obtuvo diferencias significativas sólo en caso de la LDH, siendo el nivel de esta enzima mayor durante el crecimiento en el cultivo suplementado con 10% de SFB, siendo también el nivel de LDH mayor en la producción de adenovirus en comparación al crecimiento con 0,5% de SFB. Estos resultados fueron contrastados con los obtenidos a través del Análisis de Flujo Metabólico (MFA), para las vías en que participan dichas enzimas, encontrando una concordancia en el comportamiento en las condiciones comparadas, ya que el aumento en la producción de lactato en el crecimiento en medio con 10% de SFB responde a una mayor cantidad de LDH. En la producción de adenovirus el aumento del lactato sería producto de la lisis celular y no de un aumento de la LDH. Finalmente los resultados obtenidos permitirán un mejor entendimiento del comportamiento de células HEK293, y de sus requerimientos nutricionales en cultivo y producción de adenovirus.