As algas marinhas calcárias (AMC) e os óleos essenciais vêm sendo utilizados como aditivos em dietas para ruminantes. As AMC têm sido adicionadas às dietas com o objetivo de modularem o pH ruminal, enquanto os óleos essenciais, através de sua ação antimicrobiana, têm sido testados como alternativa aos aditivos antibióticos na produção animal. Os objetivos do presente estudo foram avaliar os efeitos de óleos essenciais e de algas marinhas calcárias (AMC), bem como a combinação de ambos, sobre desempenho e ambiente ruminal de vacas leiteiras em lactação. Foram realizados 2 experimentos com 32 vacas leiteiras sob sistema de pastejo rotativo com suplementação diária de 6 kg de alimento concentrado por vaca: o experimento 1 foi de desempenho e o experimento 2 de metabolismo ruminal. Em ambos os experimentos as vacas foram submetidas aos seguintes tratamentos: a) controle (CONT); b) óleos essenciais (OE); c) algas marinhas calcárias (AMC); d) AMC + OE. No experimento 1, as variáveis registradas foram consumo, produção e composição do leite, ganho de peso, condição corporal e parâmetros sanguíneos (glicose e ácidos graxos não esterificados [AGNE]). No experimento 2 foram utilizadas as mesmas 32 vacas em lactação para avaliação dos parâmetros ruminais. Os delineamentos utilizados foram: em quadrados latinos replicados (experimento 1) e em blocos inteiramente casualizados (experimento 2). No experimento 1 o CMS de pasto e os CMS e CMO totais foram maiores para o tratamento AMC em comparação com os tratamentos OE e OE+AMC. Os dados de consumo do tratamento CONT foram não diferiram dos demais tratamentos. As digestibilidades da MS e da MO foram maiores para os tratamentos OE e OE+AMC em comparação com o tratamento AMC. Os dados de digestibilidade do tratamento CONT não diferiram dos demais tratamentos. O escore de condição corporal médio foi maior para o tratamento OE em comparação com os demais, porém os aditivos testados não afetaram as concentrações sanguíneas de AGNE e de glicose. Os dados de produção e de composição do leite não foram afetados pelos aditivos testados, assim como os dados de concentração de energia das dietas, consumo de energia, secreção de energia no leite e eficiência de conversão da energia consumida em energia láctea. No experimento 2, a suplementação com OE aumentou a concentração molar de AGV totais e a de acetato em comparação com os tratamentos CONT e AMC, com valores intermediários e não diferentes para o tratamento OE+AMC. Houve aumento do pH ruminal no tratamento AMC em comparação com o tratamento OE. A inclusão de óleos essenciais e ou algas marinhas não alterou a resposta produtiva de vacas leiteiras, apesar do aumento na concentração de AGV e de pH ruminal respectivamente. / Essential oils (OE) and calcareous marine algae (AMC) are being used in ruminants diets. The AMC has been added to diets with the purpose of regulating the ruminal pH while the OE, due to their antimicrobial properties, had been tested as an alternative to the antibiotic additives used in animal production. The objectives of the current study were to evaluate the effects of OE and AMC as well as their interaction on performance and ruminal environment of lactating dairy cows. Two experiments with 32 cows were developed. The animals were in a rotational grazing system supplemented with 6 kg per cow of concentrate feed. Experiment 1 was designed to evaluate performance whereas experiment 2 for ruminal metabolism. During both experiments, cows were assigned to the followings treatments: a) control (CONT); b) blend of essential oils (OE); calcareous marine algae (AMC); d) AMC+OE. In experiment 1, the registered variables were intake, yield and milk composition, live weight, body condition score and blood parameters (glucose and non-esterified fatty acids, [NEFA]). In experiment 2 the same 32 lactating cows were used to evaluate ruminal parameters. The statistical designs used were: replicated Latin square (experiment1) and randomized complete block design (experiment 2). In experiment 1, grass and total DM and OM intakes were increased in AMC compared to OE and OE+AMC. The intakes observed for CONT did not differ from the other treatments. Digestibility of DM and OM were higher for OE and OE+AMC compared to AMC. Digestibility of CONT did not differ from other treatments. The average BCS was higher for OE, however the tested additives did not affect blood concentration of NEFA and glucose. Milk yield and composition were not affected by additives inclusion as well as energy concentration in diets, energy intake, secreted energy in milk and energy conversion efficiency. In experiment 2, OE increased molar concentration of acetate and total VFA when compared to CONT and AMC, but not differed from OE+AMC. The AMC increased ruminal pH when compared to OE. The inclusion of essential oils and/or calcareous marine algae did not alter the productive response of lactating dairy cows, even though there was an increase in VFA concentration and ruminal pH.

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente (Área de Tratamento de Águas e Águas Residuais), na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Professor Doutor Alfredo da Rocha Boaventura

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-30T20:49:07Z No. of bitstreams: 1 MarianaSantanaSantosPereiraDaCosta_TESE.pdf: 2604285 bytes, checksum: 563b33c5f5f7b6ae4ce07fe8a3655789 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-30T20:58:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MarianaSantanaSantosPereiraDaCosta_TESE.pdf: 2604285 bytes, checksum: 563b33c5f5f7b6ae4ce07fe8a3655789 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-30T20:58:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarianaSantanaSantosPereiraDaCosta_TESE.pdf: 2604285 bytes, checksum: 563b33c5f5f7b6ae4ce07fe8a3655789 (MD5) Previous issue date: 2016-04-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Contudo, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrado que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial anticoagulante de PS purificados da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) indicam que os PS FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Entretanto, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria. / Polysaccharides of seaweeds can have their synthesis, structure and pharmacological properties modified due to changes in environmental factors. But few algae have been analyzed in this light. The green seaweed C. cupressoides var. flabellata Børgesen is an abundant alga in the coast of Rio Grande do Norte and it was already shown that this seaweed collected at the same time in beaches with different degree of salinity synthesized sulfated polysaccharides (PS) with different properties, including anticoagulant activity. Therefore the objective of this study was to obtain and characterize PS of green seaweed of the coast of Rio Grande do Norte evaluating the influence of the collection period and environmental parameters in the chemical composition and anticoagulant activity of PS as well as purify, characterize and evaluate the anticoagulant potential of at least one PS of the seaweed C. cupressoides. Initially, extracts rich in sulfated polysaccharides (ERPS) were obtained by proteolysis followed by precipitation with methanol of the seaweed C. cupressoides collected monthly for one year on the beach in Búzios, Nísia Floresta/RN. It was noted that there were variations in performance of extraction, chemical composition and anticoagulant activity of ERPS C. cupressoides according to the month of collection, with the month of March being the one in which they obtained more anticoagulant potential of ERPS. It is worth noting that this activity was greater than that of Clexane®, a low molecular weight commercial heparin. When analyzing the influence of environmental factors in the collection site in regards to performance, chemical composition and anticoagulant activity it has been observed that there is a significant positive correlation (p < 0.05) between the performance of the extraction of ERPS and salinity of sea water and insolation; for the amount of sulfate it was observed a significant negative correlation (p < 0.05) with the salinity of the seawater. The amount of total sugars had a significant negative correlation (p < 0.05) with: total solids, sodium, chloride and insolation. Since the month of March was the month with ERPS with more anticoagulant potential, it was decided to purify, characterize and evaluate the PS anticoagulant potential extracted on that month. After proteolysis and fractionation with increasing volumes of acetone four fractions of polysaccharide C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB2.0) were obtained. Since the CCB-0.5 had higher anticoagulant activity, it was submitted to a chromatography ion-exchange column and eluted in two new fractions (FI and FII) after agarose gel electrophoresis, slide staining with toluidine blue and discoloration it was observed the appearance of a single band on both SP which indicates the presence of a single population of PS, which allows inferring that these PS were purified. Analysis by high-performance liquid chromatography (HPLC) indicate that SP FI and FII are glucogalactanas. These sulfated glucogalactans exhibited by the intrinsic pathway anticoagulant activity (APTT assay) the extrinsic pathway (PT test) and common pathway (TT test) of the coagulation cascade. An interesting result was that activity in the aPTT test of sulfated glucogalactans was similiar activity of Clexane®. In addition, these PS were able to partially inhibit thrombin. This is an indicative that the PS C. cupressoides may be acting on various proteases of the coagulation cascade. But more studies are needed to explain in detail which are the targets of action of these polymers. Finally, we analyzed the influence of the period of collection and environmental factors in ERPS of other green seaweeds RN coast (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides and Codium isthmocladum) also collected monthly for one year on the beach of Búzios, Nísia Floresta/RN; and it was observed that, like the C. cupressoides, there were variations in the performance, chemical composition and anticoagulant activity for ERPs green seaweeds C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides and C. isthmocladum. However, an interesting fact is that each alga responds differently to environmental conditions of the collection site. These data indicate that depending on the time of the year that the algae are collected, the PS extracted from these species of algae may have their chemical structures affected hence its biological activity may be different. These types of studies lead to the clarification of which would be the best conditions to obtain the PS with the structural and biological characteristics of interest, which is essential for the use of these polymers in the industry.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-26T09:56:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 848309 bytes, checksum: f73dc789b087c3df42f96258e81b0812 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T09:56:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 848309 bytes, checksum: f73dc789b087c3df42f96258e81b0812 (MD5) Previous issue date: 2015-02-19 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Microalgas têm atraído interesse como fonte potencial de matérias-primas para produção de biocombustíveis e de subprodutos de interesse (e.g., bioetanol e proteínas). Entretanto, a produção em escala comercial ainda é economicamente inviável, principalmente, pelo pouco conhecimento sobre a regulação do crescimento, a biossíntese e armazenamento de lipídios em microalgas.Neste estudo, avaliou-se o potencial de 10 cepas de algas coletadas na região de Viçosa – MG, com o objetivo de avaliar o crescimento e caracterizar o metabolismo em autotróficas de crescimento. Entre as cepas estudadas, duas cepas de Scenedesmus(BR003 e BR024) apresentaram os maiores valores para produtividade de biomassa, que associado a quantidades intermediárias de lipídios garantiram uma alta produtividade de lipídios em relação às outras cepas. Essas duas cepas também se destacaram entre as demais em relação ao perfil de ácido graxo, apresentando altos teores dos ácidos graxos C16:0 e C18:1 e baixos teores dos poliinsaturados. No entanto, o perfil graxo das cepas Chlamydomonas sp. BR020 e Chlorella vulgaris BR017 apresentou altos teores de ácido α-linolénico (C18:3) e esta cepa também apresentou maiores teores de proteínas, constituindo- se em importantes cepas para o conceito de biorefinária. Verificou-se também que a maioria dos metabólitos (aminoácidos e ácidos orgânicos) avaliados apresentaram correlação negativa com a biomassa produzida e positiva com o conteúdo de lipídios. Tomados em conjunto, esses resultados indicam que a baixa produção de biomassa esta relacionada com acúmulo de aminoácidos (isoleucina, leucina e valina), intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (citrato, succinato e fumarato), que frequentemente estão associados com acúmulo de óleo na célula. Entretanto, apesar da proximidade filogenética de algumas cepas em termos de gênero ou espécie, algumas cepas apresentaram comportamentos distintos o que não permitiu o agrupamento das mesmas, demonstrando, portanto, a necessidade de uma caracterização mais detalhada desses organismos. / Microalgae have attracted interest as a potential source of raw materials for biofuels and by-products of interest such as bioethanol and protein. However, the production on a commercial scale is still costly mainly by little knowledge about the regulation of growth, biosynthesis and lipid storage in microalgae. In this study, we evaluated the potential of 10 strains of algae collected in Viçosa region - MG, with the aim of evaluating the growth and characterize the metabolism in autotrophic conditions. Among the studied strains, two strains of Scenedesmus (BR003 and BR024) had the highest values for biomass productivity, which associated with intermediate amounts of lipids guaranteed high productivity of lipids compared to other strains. In addition these two strains differed among the others in relation to the fatty acid profile, with high levels of C16 and C18: 1 fatty acidsand low levels of the polyunsaturated fatty acids. However, the fatty acid profile of Chlamydomonas sp., BR020, and Chlorella vulgaris,BR017, showed high levels of α-linolenic acid (C18: 3) and this strain also exhibited higher protein levels, suggesting that these are important strains for the biorefinery concept. It was also observed that most of the evaluated metabolites (amino acids and organic acids) were negatively correlated with biomass and positively with lipid contents. Taken together, these results indicate that low biomass production is related to the levels of amino acids (isoleucine, leucine and valine),intermediates of the tricarboxylic acid cycle (citrate, succinate and fumarate), which are often associated with oil accumulation in the cell. However, despite the phylogenetic proximity in terms of genus or species showed, some of the strains displayed differential behavior which did not allow grouping of the strain in the same cluster, thus indicating the need for a deepercharacterizationof these organisms.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-01-27T13:32:41Z No. of bitstreams: 1 FabianaLimaBezerra_TESE.pdf: 4985146 bytes, checksum: ce1c1005e6775f052912c875b1d39910 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-01-31T13:32:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FabianaLimaBezerra_TESE.pdf: 4985146 bytes, checksum: ce1c1005e6775f052912c875b1d39910 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T13:32:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabianaLimaBezerra_TESE.pdf: 4985146 bytes, checksum: ce1c1005e6775f052912c875b1d39910 (MD5) Previous issue date: 2016-06-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A dengue ? a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui-se em um grave problema de sa?de p?blica. A doen?a ? end?mica em regi?es tropicais e subtropicais, abrangendo mais de 100 pa?ses, correspondendo ? metade da popula??o mundial. As epidemias s?o recorrentes e estima-se que os v?rus da dengue causem 390 milh?es de infec??es a cada ano, sendo uma importante causa de morbidade. Apesar desse cen?rio, atualmente, ainda n?o se disp?e de um antiviral contra a dengue. Neste contexto, diversos estudos relatam a atividade antiviral dos polissacar?deos sulfatados obtidos das algas marinhas contra v?rus envelopados, cuja a??o est? associada ? interfer?ncia nas etapas iniciais do processo de infec??o viral. Neste estudo, avaliou-se a potencial atividade antiviral de extratos brutos ricos em polissacar?deos sulfatados obtidos das algas marrons Dictyota menstrualis (EBDMens) e Dictyota mertensii (EBDM) e das algas verdes Codium isthmocladum (EBCI) e Caulerpa sertularioides (EBCS) contra o v?rus dengue 2 (DENV-2), em linhagem de c?lulas Vero, usando diferentes estrat?gias metodol?gicas (tratamento simult?neo, tratamento p?s-infec??o, pr?-tratamento da c?lula, pr?tratamento do v?rus, adsor??o, p?s-adsor??o e penetra??o). A citotoxicidade dos extratos foi analisada pelo ensaio de redu??o do MTT. O estudo da atividade antiviral foi determinado pela quantifica??o do n?mero de c?pias do RNA viral por RT-qPCR ap?s 120 h de infec??o. Nenhum extrato exibiu toxicidade para as c?lulas Vero no ensaio de redu??o do MTT na concentra??o de 100 ?g/mL. Todos os extratos exibiram atividade antiviral quando adicionados durante os primeiros 90 minutos de infec??o, demonstrando redu??o significativa no n?mero de c?pias do RNA viral ap?s 120 horas. Os extratos EBDMens e EBDM foram mais eficazes nos ensaios de pr?-tratamento da c?lula e do v?rus, e o primeiro exerceu atividade antiviral superior ao EBDM durante a adsor??o viral. Os extratos EBCI e EBCS apresentaram atividade antiviral semelhante no ensaio de pr?-tratamento da c?lula. O EBCI foi mais eficaz na redu??o da adsor??o do DENV-2 em c?lulas Vero. Por?m, o EBCS se mostrou mais eficiente nos ensaios de pr?-tratamento do v?rus e penetra??o. Dentre os extratos avaliados, o EBCS parece ser o mais efetivo no combate ao DENV-2. Estes resultados revelam o potencial desses extratos ricos em polissacar?deos sulfatados como compostos com a??o antiviral, sugerindo que eles atuam nos est?gios iniciais da infec??o por DENV-2. / Dengue is considered the most important human arboviruses, and is a serious public health problem. This disease is endemic in tropical and subtropical regions, reaching more than 100 countries, which means the half of world population, and those epidemies have been appellant. It is estimated that Dengue virus could cause 390 millions of infections each year, and is an important cause of morbidity. Although this scenario, actually doesn?t exist a dengue antivirals still. Sorts of studies have showed antivirus activity of seaweed sulfated polysaccharides against enveloped viruses, which action seems to be associated to initials steps of infection process. In this study, was evaluated the potential antiviral activity of crude extracts rich in sulfated polysaccharides obtained from the brown algae Dyctiota menstrualis (EBDMens) and Dyctiota mertensii (EBDM), and green algae Codium isthmocladium (EBCl) and Caulerpa sertularioides (EBCS), tested against Dengue virus 2 (DENV-2) in Vero cell line, by using different methodological strategies (simultaneous treatment, post-infection treatment, cell pre-treatment, virus pre-treatment, adsorption, post-adsorption and penetration). The extracts cytotoxicity was evaluated by MTT reduction assay. The study of antiviral activity was determinated by quantifying viral RNA load using RT-qPCR, after 120 hours of infection. None extract has showed toxicity against Vero Cells in MTT reduction assay with 100 ?g/mL concentration. All extracts have shown antiviral activity when added during the first 90 minutes of infection, and a significant reduction of viral RNA number of copies after 120 hours. The EBDMens and EBDM extracts were more efficient to cell and virus pretreatment assays, and the first has showed higher antiviral activity than EBDM during viral adsorption. The EBCI and EBCS extracts have presented antiviral activity very similar in cell pre-treatment assay. EBCI was more efficient in the reduction of DENV-2 adsorption in Vero cell. However, EBCS has showed more efficient in cell pre-treatment and penetration assays. Between the extracts evaluated, EBCS seems to be more effective against DENV-2. These results have showed potential action of extracts rich in sulfated polysaccharides with antivirus activity, suggesting that they act in the initials steps of infection process of DENV-2.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / As algas marinhas sÃo fontes abundantes de polissacarÃdeos sulfatados com vÃrias atividades biolÃgicas dessa forma suas biomolÃculas sÃo de grande interesse comercial principalmente nas indÃstrias farmacÃutica e alimentÃcia No presente trabalho investigou-se uma fraÃÃo polissacarÃdica sulfatada obtida da alga marinha verde Caulerpa racemosa (CrII) quanto aos seus efeitos na nocicepÃÃo e inflamaÃÃo Inicialmente a CrII (1,0 mg/kg i.v.) foi avaliada quanto a toxicidade em camundongos utilizando um modelo por dose repetida (sete dias) ApÃs o perÃodo experimental a CrII mostrou-se atÃxica A atividade antinociceptiva foi avaliada atravÃs dos ensaios de contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico teste da formalina e da placa quente Camundongos Swiss machos foram tratados com CrII (0,01 0,1 e 1,0 mg/kg i.v.) 30 min antes de receber os estÃmulos de dor (Ãcido acÃtico 0,8% ou formalina 2%) ou exposiÃÃo ao calor Nos ensaios de contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico CrII reduziu significativamente o nÃmero de contorÃÃes abdominais e no teste da formalina CrII tambÃm foi capaz de reduzir o tempo de lambedura da pata na segunda fase do experimento Em relaÃÃo ao estÃmulo tÃrmico CrII nÃo foi capaz de prolongar o tempo de reaÃÃo dos animais. Com relaÃÃo aos efeitos na inflamaÃÃo CrII (0,01 0,1 e 1,0 mg/kg i.v.) foi avaliada quanto seu potencial anti-inflamatÃrio utilizando-se ratos Wistar Foram utilizados ensaios de migraÃÃo celular para a cavidade peritoneal induzida por carragenana (Cg - 700 Âg/cavidade) de edema de pata induzido por Cg (700 Âg/pata) ou dextrana (300 Âg/pata) Com relaÃÃo a migraÃÃo celular para a cavidade peritoneal ocorreu uma reduÃÃo significativa de neutrÃfilos em todos os grupos tratados com a CrII No ensaio de edema de pata induzido por Cg ou dextrana CrII tambÃm foi capaz de reduzir significativamente o edema em todas as doses utilizadas O efeito anti-inflamatÃrio da CrII foi confirmado atravÃs da reduÃÃo dos nÃveis teciduais da mieloperoxidase do tecido das patas nos grupos com Cg AlÃm disso foi realizado um ensaio de inibiÃÃo da enzima Hemo-oxygenase-1 (HO-1) utilizando-se o inibidor ZnPP IX com o intuito de avaliar se o efeito anti-inflamatÃrio da CrII estava relacionado com a expressÃo dessa enzima Os resultados demonstraram que a inibiÃÃo da via HO-1 està associada à inibiÃÃo da resposta anti-inflamatÃria da CrII No intuito de avaliar se CrII tambÃm possui efeito prÃ-inflamatÃrio CrII (0,01 0,1 e 1,0 mg/kg i.pl) foi injetada na pata de ratos Wistar onde o resultado obtido demonstrou um processo inflamatÃrio apenas para animais que receberam a dose de 1,0 mg/kg Portanto os possÃveis mediadores que poderiam estar envolvidos com o processo inflamatÃrio da CrII foram avaliados utilizando-se o ensaio de edema de pata induzido por CrII Os resultados demonstraram que a aÃÃo prÃ-inflamatÃria da CrII pode estar relacionada com a liberaÃÃo de mediadores provindos da via da ciclooxigenase (COX-2 prostaglandinas e tromboxanos) A CrII quando utilizada como agente anti-inflamatÃrio nÃo foi capaz de inibir seu efeito prÃ- inflamatÃrio no ensaio de edema de pata em nenhuma das doses utilizadas (0,01 0,1 e 1,0 mg/kg i.v.) confirmando que sua aÃÃo anti-inflamatÃria està relacionada com a via da HO-1 / Marine algae are abundant sources of sulfated polysaccharides with various biological activities thereby altering its biomolecules are great of commercial interest especially in the pharmaceutical and food industries In this study we investigated a sulfated polysaccharide obtained from the green seaweed Caulerpa racemosa (CrII) as to its effects on nociception and inflammation Initially the CrII (1.0 mg/kg, i.v.) was evaluated for toxicity in mice using a repeated dose model (seven days) After the trial period the CrII proved to be nontoxic The antinociceptive activity was evaluated by the writings of abdominal constrictions induced by acetic acid formalin test and hot plate Swiss male mice were treated with CrII (0.01 0.1 and 1.0 mg/kg i.v.) 30 min before receiving pain stimuli (acetic acid 0.8% or 2% formalin) or heat exposure In trials of abdominal constrictions induced by acetic acid and the formalin test CrII significantly reduced the number of abdominal writhing and paw licking time in the second phase of the experiment respectively In relation to thermal stimulation CrII was unable to prolong the reaction time of animals With respect to effects on inflammation CrII (0.01 0.1 and 1.0 mg/kg i.v.) was evaluated for its potential antiinflammatory using Wistar rats We used assays of cell migration into the peritoneal cavity induced by carrageenan (Cg - 700 mg/cavity) paw edema induced by Cg (700 Âg/paw) or dextran (300 Âg/paw)With respect to cell migration into the peritoneal cavity there was a significant reduction of neutrophils in all groups treated with the CrII In the test paw edema induced by dextran or Cg CrII was also able to significantly reduce the swelling at all doses used The anti-inflammatory effect of CrII was confirmed by reducing the tissue levels of myeloperoxidase in the tissue of the paws Cg groups In addition we performed an enzyme inhibition assay Hemo-oxygenase-1 (HO-1) using the inhibitor ZnPP IX in order to assess whether the anti-inflammatory effect of CrII was related to the expression of this enzyme The results showed that the inhibition of the HO-1 is associated with inhibition of the inflammatory response of CrII In order to assess whether CrII also has pro-inflammatory effect CrII (0.01 0.1 and 1.0 mg/kg i.pl) was injected into the paw of the rats where the result demonstrated a process inflammation only for animals which received the dose of 1.0 mg/kg Therefore the potential mediators that could be involved in the inflammatory process of CrII were evaluated using the test paw edema induced by CrII The results showed that the pro-inflammatory effect of CrII may be related to the release of mediators emanating from the path of cyclooxygenase (COX-2 prostaglandins and thromboxanes) The CrII when used as anti-inflammatory agent was unable to inhibit pro-inflammatory effect in the paw edema test in any of the doses (0.01 0.1 and 1.0 mg/kg i.v.) confirming that its anti-inflammatory effect is related to HO-1

Algas marinhas sÃo seres classificados no reino protista, predominantemente aquÃticos e com grande capacidade adaptativa. Encontradas em todas as regiÃes do planeta, as algas desempenham importante papel ecolÃgico e econÃmico, representando um grande potencial de biorrecursos. A alga marinha vermelha Gracilaria birdiae, coletada durante doze meses, foi submetida à extraÃÃo aquosa a 100 ÂC de polissacarÃdeos e apresentou rendimento superior a 50 %, com exceÃÃo nos meses de fevereiro, setembro e novembro de 2007 ( 49,5%, 41,8% e 49,4% respectativamente). O teor de sulfato foi obtido por microanÃlise e nÃo variou significativamente ao longo dos meses analisados, apresentando valor mÃdio de 1,35%. O grau de sulfataÃÃo mÃdio encontrado foi de 0,15. O conteÃdo protÃico nas amostras tambÃm nÃo apresentou variaÃÃo considerÃvel, tendo mÃdia de 0,5%, entretanto, no mÃs de abril o conteÃdo protÃico aumentou cerca de 3 vezes do valor mÃdio encontrado. As doze amostras foram caracterizadas quimicamente por cromatografia de permeaÃÃo em gel (GPC), espectroscopia na regiÃo do infravermelho (FT-IR) e por ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN). Os cromatogramas de GPC das amostras apresentaram semelhanÃas e caracterÃsticas tÃpicas de polissacarÃdeos das algas vermelhas. Em geral, foram observados um pico principal, em aproximadamente 7,58 mL e um ombro em aproximadamente 9,2 mL de volume de eluiÃÃo, com exceÃÃo dos meses de agosto, outubro e novembro de 2007, que apresentaram cromatogramas com pico principal em aproximadamente 8,27 mL de volume de eluiÃÃo, detectados pelo Ãndice de refraÃÃo. Os polissacarÃdeos investigados apresentaram altas massas molares , variando de 0,11 x 104 a 8,51 x 105 g/mol. Os espectros de infravermelho das doze amostras de polissacarÃdeos apresentaram perfis semelhantes, com as bandas caracterÃsticas de agarocolÃides, mais especificamente, do tipo agarana. Espectros de RMN foram empregados para a caracterizaÃÃo estrutural das amostras ao longo do ano e, revelaram que a estrutura do polissacarÃdeo à composta por segmentos de (1&#8594; 3)-&#946;-D-galactopiranosil ligada a (1&#8594;4)-&#945;-L-anidrogalactopiranosil. O estudo da variaÃÃo sazonal da composiÃÃo centesimal, em geral, nÃo apresentou variaÃÃo acentuada. Com relaÃÃo à quantidade de proteÃnas solÃveis e a atividade hemaglutinante no extrato protÃico, o estudo da variaÃÃo sazonal revelou uma pequena variaÃÃo no teor de proteÃnas solÃveis, com valor mÃximo (0,94 mgP/mL) em novembro/06 e mÃnimo no mÃs de dezembro/06 (0,39 mgP/mL). Em geral, a atividade hemaglutinante observada em Gracilaria birdiae à fraca, porÃm, ela esteve presente em concentraÃÃes variÃveis ao longo de todo o perÃodo estudado, com exceÃÃo no mÃs de dezembro/06, independente do conteÃdo protÃico total e solÃvel encontrado. / Seaweeds are classified in the kingdom protist, predominantly aquatic and with great adaptive capacity. Found in all regions of the planet, algae play an important role ecological and economic, representing a great potential for bioresources. The red seaweed Gracilaria birdiae, collected during twelves months, was submitted to aqueous extraction of polysaccharides at 100ÂC, showed yield exceeding 50 %, except in February, September and November 2007 (49,5%, 41,8% and 49,4% respectively). The sulfate content was obtained by microanalysis and it not vary significantly over the months examined averaging 1,35%. The sulfate degree was 0.15. The protein content in the samples also showed no considerable variation, with average of 0,5%, howevwr in April, the protein content increased about 3 times the average found. The twelve samples were chemically characterized by Gel Permeation Chromatography (GPC), Infrared (FT-IR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. The GPC chromatograms of the samples showed similarity and typical characteristics of polysaccharides from red algae. In general, we observed a main peak, at approximately 9,2 mL volume of eluition, with the exception of August, October and November 2007, which showed chromatograms with main peak at approximately 8,7 mL volume of eluition, detected by a refractive index. The polysaccharides investigated showed hight molecular weight, ranging from 0.11 x 104 and 8.51 x 105 g/mol. The infrared spectra of the twelve samples of polysaccharides presented similar profiles, with bands characteristics of agarocolloids, more specifically agaran-like, with evidence of protein. NMR were employed to the structural characterization of the samples throughout the year and revealed that the structure of polysaccharides is composed by (1&#8594;3)-&#946;-D-galactopyranosyl linkage to (1&#8594;4)-&#945;-L-anhydrogalactopyranosyl segments. The study of seasonal variation in proximate composition, in general, showed no marked variation. Regarding the amount of soluble protein in the crude extract, the study of seasonal variation showed a small variation in the content of soluble protein, with maximum value (0,94 mgP/mL) in November/06 and minimum (0,39 mgP/mL) in December/06. The hemagglutinating activity during the period of one year, except in December/06.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As algas marinhas sÃo fontes de compostos bioativos para a indÃstria farmacÃutica e dentre esses compostos destacamos as lectinas. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio da lectina da alga marinha verde Caulerpa cupressoides (LCc) no modelo de artrite induzida por zymosan (Zy) na articulaÃÃo temporomandibular (ATM) de ratos. LCc foi extraÃda com tampÃo Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 e isolada por cromatografia de troca iÃnica em coluna de DEAE-celulose. Nos ensaios de artrite induzida por Zy, ratos Wistar machos receberam LCc (0,1; 1 ou 10 mg/kg; i.v.) ou salina estÃril, 30 min antes da injeÃÃo intra-articular (i.art.) de Zy (2 mg/art., 40 ÂL) na ATM esquerda. Grupos controles receberam salina estÃril (40 ÂL; i.art.), indometacina (5 mg/kg; s.c) ou morfina (5 mg/kg, s.c.). Grupos de animais receberam LCc (10 mg/kg, i.v.) associada à mucina (100 mg/kg, i.v.), um aÃÃcar inibidor, e outro grupo recebeu somente mucina antes dos estÃmulos. Para analisar o envolvimento da via da HO-1 na artrite, os animais foram prÃ-tratados (3 mg/kg, s.c.) com um inibidor especÃfico do grupo heme (zinco protoporfirina IX â ZnPP IX). Finalmente, para avaliar se o efeito antinociceptivo de LCc estava envolvido na ativaÃÃo do sistema opioide, grupo de animais receberam uma injeÃÃo i.art. (10 &#956;g/art.;15 ÂL) de um antagonista de receptores opioides (naloxona), 35 min antes da injeÃÃo de Zy. ApÃs 5 min, os animais foram prÃ-tratados com LCc (10 mg/kg). A hipernocicepÃÃo mecÃnica foi medida utilizando o mÃtodo de Von Frey elÃtrico no tempo basal e 4 h apÃs a injeÃÃo de Zy. Na 6a hora, os animais foram eutanasiados e suas ATM lavadas para coleta do lavado sinovial e realizaÃÃo da contagem total de cÃlulas e dosagem de mieloperoxidase (MPO). Posteriormente, as ATM foram removidas para as anÃlises histolÃgicas e imunohistoquÃmica (TNF-&#945;, IL-1&#946; e HO-1), alÃm da dosagem de IL-1&#946; no tecido periarticular e gÃnglio trigeminal. O prÃ-tratamento com LCc (0,1, 1 ou 10 mg/kg; i.v.) reduziu significativamente a hipernocicepÃÃo induzida por Zy (81, 83 e 89,5%, respectivamente) e inibiu o influxo de leucÃcitos (77,3, 80,7 e 98,5%, respectivamente) comparado ao grupo Zy, sendo confirmada pela atividade de MPO. O aÃÃcar inibidor (mucina) nÃo foi capaz de inibir o efeito anti-inflamatÃrio e antinociceptivo de LCc na artrite induzida por Zy. Observamos que durante a anÃlise histolÃgica da ATM, os animais tratados com LCc apresentaram uma reduÃÃo significativa do influxo celular na membrana sinovial. AlÃm disso, LCc reduziu significativamente a produÃÃo de IL-1&#946; no tecido periarticular e a expressÃo de IL-1&#946;, TNF-&#945; e HO-1 na membrana sinovial durante o ensaio de imunohistoquÃmica. O tratamento com ZnPP IX nÃo foi capaz de inibir os efeitos de LCc, mostrando que sua aÃÃo antinociceptiva e anti-inflamatÃria nÃo ocorre pela via da HO-1. AlÃm disso, o tratamento com naloxona nÃo reverteu o efeito de LCc. Portanto, LCc apresentou efeito antinociceptivo e anti-inflamatÃrio no modelo de artrite induzida por Zy, reduzindo a produÃÃo de citocinas primÃrias (TNF-&#945; e IL-1&#946;), porÃm sua aÃÃo antinociceptiva nÃo ocorre pelo mecanismo opioide perifÃrico. / Seaweeds are sources of bioactive compounds for the pharmaceutical industry and among these compounds include the lectins. The present study aimed to investigate the effects antinociceptive and anti-inflammatory of the lectin of the green seaweed Caulerpa cupressoides (CcL) on model of zymosan-induced arthritis in the temporomandibular joint (TMJ) of rats. CcL was extracted with 25 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 and isolated by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose column. In tests of arthritis induced by Zy, male Wistar rats received CcL (0.1, 1 or 10 mg/kg, i.v.) or sterile saline, 30 min before the intra-articular (i.art.) injection of Zy (2 mg/art.; 40 &#956;L) into the left TMJ. Control groups received saline (40 &#956;L; i.art.), indomethacin (5 mg/kg, s.c.) or morphine (5 mg/kg, s.c.). Groups of animals received CcL (10 mg/kg; i.v.) associated with mucin (8 mg/kg; i.v.), a sugar inhibitor, and another group received only mucin before stimulus. To analyze the involvement of HO-1 pathway in arthritis, animals were pretreated (3 mg/kg, s.c.) with a specific inhibitor of heme (zinc protoporphyrin IX-ZnPP IX). Finally, to evaluate the analgesic effect of CcL in the activation of the opioid system, group of animals received an injection i.art. (10 &#956;g/art.; 15 ÂL) of the opioid receptor antagonist (naloxone), 35 min before injection of Zy. After 5 min, the animals were pretreated with CcL (10 mg/kg). Mechanical hypernociception was recorded before the i.art. injections of Zy or saline and after 4h. After 6 hour, the synovial fluid was collected to perform cell counting and myeloperoxidase (MPO) assay. Also, TMJ tissues were excised to perform histopathological, immunohistochemistry (TNF-&#945;, IL-1&#946; e HO-1) and cytokine assays (IL-1&#946;) in the periarticular tissue and trigeminal ganglion. Pretreatment with CcL (0.1, 1 or 10 mg/kg; i.v.) inhibited (p<0.05) the nociceptive response (81, 83, and 89.5%, respectively) and reduced the influx of leukocytes (77.3, 80.7 and 98.5%, respectively) compared to Zy group, as demonstrated by MPO activity. Sugar inhibitor (mucin) did not inhibit the anti-inflammatory and antinociceptive effect of CcL in arthritis induced by Zy. We observed that during the histological analysis of ATM, animals treated with CcL showed a significant reduction of cell influx in the synovial membrane. Furthermore, CcL significantly reduced the production of IL-1&#946; in the periarticular tissue and expression of IL-1&#946;, TNF-&#945; and HO-1 in the synovial membrane during immunohistochemistry assay. Treatment with ZnPP IX was not able to inhibit the effect CcL, indicating that its antinociceptive and anti-inflammatory action did not occur HO-1 pathway. In addition, treatment with naloxone did not reverse the effect of CcL. Therefore, CcL showed antinociceptive and anti-inflammatory effect on model of Zy-induced arthritis, reducing the production of primary cytokines (TNF-&#945; and IL-1&#946;), however its antinociceptive action did not occur by peripheral opioid mechanism.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A grande diversidade biolÃgica das algas marinhas e sua ocorrÃncia em praticamente todos os ambientes do planeta demonstram a importÃncia desses seres para os ecossistemas. Um deles à a extraÃÃo de biomolÃculas potencialmente ativa como as lectinas, que sÃo proteÃnas que tÃm sido alvo de pesquisas no mundo inteiro. Isso se deve à sua impressionante capacidade de ligar-se especificamente a carboidratos ou a substÃncias que os contÃm, propiciando um imenso campo de aplicaÃÃo biolÃgica. O objetivo deste trabalho foi produzir a lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum (Lec), avaliar sua estrutura secundÃria a partir de tÃcnicas espectroscÃpicas e investigar as suas propriedades anti-inflamatÃrias em camundongos. Primeiramente a lectina foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio (0-60) e cromatografia de troca â iÃnica, sendo recolhido o primeiro pico (PI). Este pico foi selecionado atravÃs da atividade de hemaglutinaÃÃo obtendo assim a lectina pura a partir de Bryothamnion triquetrum, verificada por SDS-PAGE. A lectina foi analisada quanto a sua estrutura secundÃria por tÃcnicas espectroscÃpicas de dicroÃsmo circular, frente a extremos de pH (4,0 â 11,0) e comparada ao espectro da sua estrutura nativa, e fluorescÃncia frente a diferentes temperaturas que variaram de 25 a 75 em intervalo de 10Â. Na avaliaÃÃo das atividades biolÃgicas, grupos de animais foram submetidos ao prÃ-tratamento com a Lectina (1,5 e10mg/kg; i.p.) e indometacina (10mg/kg), 30 min antes do estÃmulo inflamatÃrio. A atividade anti-inflamatÃria em camundongos foi avaliada atravÃs dos ensaios de peritonite induzida por carragenina - Cg (500 &#956;g/cav) e de edema de pata induzidos por Cg (500 &#956;g/pata); dextrano (500 &#956;g/pata). Extremos do pH (4,0 e 11,0) nÃo alterou a estrutura secundÃria da proteÃna. Os dados de fluorescÃncia (280nm e 295nm), mostraram tambÃm uma estabilidade, alÃm da presenÃa de aminoÃcidos aromÃticos na sua estrutura. A Lectina inibiu a migraÃÃo celular na peritonite induzida por Cg e os edemas de pata induzidos por Cg e dextrano. Deste modo, conclui-se que a Lectina obtida do PI da DEAE de Bryothamnion triquetrum apresentou estrutura estÃvel em relaÃÃo a variaÃÃo de pH e temperatura. Em relaÃÃo Ãs propriedades biolÃgicas testadas, a Lectina apresentou efeitos anti-inflamatÃrios nos modelos empregados, podendo ser considerada uma molÃcula com potencial para estudos mais aprofundados de inflamaÃÃo. / The great biodiversity of seaweeds and their occurrence in almost all environments on the planet demonstrate the importance of such beings to ecosystems. One example is the extraction of potentially active biomolecules such as lectins, which are proteins that have been subject of research worldwide. This is due to its impressive ability to bind specifically to carbohydrates or substances containing them, providing an immense field of biological application. This work purpose was to produce lectin from the red seaweed Bryothamnion triquetrum (Lec), evaluate its secondary structure using spectroscopic techniques, and investigate their anti-inflammatory properties in mice. Initially, the lectin was purified by precipitation with ammonium sulfate (0-60) and ion exchange chromatography, and obtained the first peak (PI). This peak was selected by hemagglutination activity thus obtaining pure lectin from Bryothamnion triquetrum, verified by SDS-PAGE. The secondary structure of lectin was analyzed by circular dichroism spectroscopic techniques, against to pH extremes (4.0 to 11.0), and compared to the spectrum of its native structure, and fluorescence against different temperatures, ranging from 25 to 75Â, each 10 interval. In biological activities assessment, groups of animals were subjected to pretreatment with the lectin (1.5 and 10mg/kg, ip) and indomethacin (10mg/kg) 30 min before the inflammatory stimulus. The anti-inflammatory activity in mice was evaluated through the assays of peritonitis induced by carrageenan - Cg (500 &#956;g / cav) and paw edema induced by Cg (500 &#956;g / paw), and dextran (500 &#956;g / paw). Extremes of pH (4.0 and 11.0) did not alter the protein secondary structure. Fluorescence data (280nm and 295nm) also showed stability, and aromatic amino acids presence in their structure. Lectin inhibited cell migration in the induced peritonitis by Cg and induced paw edema by Cg and dextran. Thus, it is concluded that the lectin obtained from the Bryothamnion triquetrum DEAE PI shows stable structure related to pH and temperature variation. Regarding biological properties tested, the lectin showed anti-inflammatory effects in models used, and it can be considered a molecule with potential for further studies of inflammation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1331_1.pdf: 671351 bytes, checksum: 41621af34c87fd43a09a6cfb893dd91a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O polissacarídeo fucana extraído da alga Sargassum cymossum foi magnetizado e posteriormente usado como suporte para imobilização de enzimas coaguladoras do leite. A caracterização básica da enzima imobilizada foi realizada pela determinação da temperatura ótima, estabilidade térmica, influência do cloreto de cálcio na atividade coagulante do leite, re-uso e estocagem. O método de imobilização mostrou-se adequado, apresentando uma retenção em proteína de 80% e 78% para as duas enzimas testadas, quimosina bovina e quimosina bovina recombinante, respectivamente. A atividade coagulante do leite nestes DEIs (Derivados Enzimáticos Imobilizados) foi 11,8 U/mL e 1,33 U/mL, respectivamente para as quimosinas bovina e recombinante. As temperaturas ótimas encontradas foram 60ºC (36 U/mL) e 50ºC (3,53 U/mL) para as quimosinas bovina e recombinante imobilizadas, respectivamente. Experimentos de estabilidade térmica revelaram que ambas as enzimas imobilizadas foram mais sensíveis à temperatura quando comparadas as enzimas livres. A perda da atividade com relação à enzima livre foi 66,35% para quimosina bovina após 30 minutos a 35º C, e 16,54% para recombinante após 30 minutos a 35º C. A influência do CaCl2 na atividade coagulante do leite foi comprovada tanto para as enzimas livres quanto para as imobilizadas. Na ausência do cálcio, as enzimas livres perderam 91,85% e 71,43%, respectivamente para a quimosina bovina e recombinante, enquanto que as enzimas imobilizadas não exibiram nenhuma atividade coagulante do leite. Nos testes de reuso foi observada uma perda na atividade de 80% e 60%, respectivamente para as quimosinas bovina e recombinante, após o segundo reuso