La réaction allergique de type I est caractérisée par une réponse immunitaire inappropriée de type Th2, et /ou par l'absence d'une tolérance immunologique contre un antigène habituellement toléré par la plupart des individus : l'allergène. Des études récentes soulignent le rôle central joué par les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène dans le contrôle des réponses allergiques. Néanmoins, l'étude des mécanismes immunologiques impliqués se doit d'être approfondie. Elle pourrait ainsi fournir d'importants renseignements concernant l'induction de tolérance périphérique contre l'allergène observée chez les individus sains. L'examen de ces réponses spécifiques apparaît alors comme primordial pour améliorer les approches thérapeutiques actuelles, dans l'hypothèse que l'immunothérapie spécifique de l'allergène puisse reproduire une telle réponse immunitaire naturelle protectrice de l'allergène. Durant cette thèse, nous avons conçu et développé des tétramères MHC classe II afin d'analyser à l'échelle de la cellule les réponses lymphocytaires T CD4+ spécifiques de l'allergène à la fois chez les patients allergiques et les volontaires sains. Pour ce faire, nous avons déterminé les conditions expérimentales nécessaires pour s'assurer d'une détection efficace des cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène par cet outil. Ce travail a été réalisé dans le cadre d'une analyse des réponses T CD4+ induites d'une part contre l'allergène majeur du pollen de bouleau (Bet v 1) ou d'autre par contre les allergènes majeurs des acariens (Der p 1 et Der p 2). Nous avons ainsi démontré que la tolérance périphérique observée chez les sujets sains est associée à la présence et l'expansion de lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'allergène. Nous avons également développé des méthodes expérimentales permettant de caractériser fonctionnellement les cellules tétramères positives. Nous avons ainsi démontré que les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène des volontaires sains sécrètent principalement de l'IFN-γ et de l'IL-10 en réponse à l'allergène et expriment très fortement le marqueur CTLA-4, un marqueur associé aux cellules T régulatrices. A l'inverse, chez les patients allergiques, ces cellules sont clairement de type Th2 confirmant leur rôle dans l'induction et l'amplification des réponses allergiques. Le développement des tétramères MHC classe II dans le contexte de l'allergie fournit une approche pertinente pour définir clairement le rôle joué par les cellules T CD4+ spécifiques de l'allergène. Ce travail, réalisé à la fois chez les individus sains, allergiques ou en cours de désensibilisation, s'inscrit pleinement dans un projet d'entreprise. Ces outils faciliteront le développement de nouveaux candidats vaccins en permettant d'identifier des marqueurs biologiques associés à un bénéfice clinique.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l'initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l'immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l'activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d'envisager l'étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l'activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu'il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d'AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l'impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l'autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté

L'allergie de contact est une pathologie en constante augmentation et particulièrement répandue dans les pays industrialisés. Aucune thérapie n'existe actuellement et seule l'éviction totale de l'allergène permet d'éviter toute nouvelle réaction d'allergie. La base de l'allergie de contact est la formation d'une liaison entre l'allergène et les protéines épidermiques. C'est cette étape chimique clé qu' il est important de comprendre afin de développer de nouvelles méthodes dites« alternatives» dans le cadre de l'actuelle législation sur les cosmétiques. Le but de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité de différents allergènes connus face aux acides aminés et protéines d'épidermes reconstruits de type SkinEthic® par la technique RMN HRMAS dérivée de la RMN du solide. Six allergènes ont ainsi été étudiés et leur réactivité a été comparée a celle observée en solution face à une protéine modèle. / Contact dermatitis is one of the most common health problem and highly prevalent in industrialized countries. No therapy currently exists and only the total eviction of the allergen can prevent further allergie reaction.The key molecular event in skin sensitization is the formation of a bond between the allergen and the epidermal proteins. Due to the recent legislation on cosmetic and to help avoid the inappropriate use of new allergens, the understanding of this key step has to be expanded in order to develop new alternative metbods.The aim of this PhD work is to study the reactivity of some allergens towards amino acids and proteins presents in reconstructed human epidermis like SkinEthic® using the HRMAS NMR technique. Six allergens have been studied and their reactivity was compared to that observed ln solution with a model protein.

Les sensibilisants de contact sont des molécules réactives électrophiles qui ont la capacité de modifier des protéines de la peau pour former un antigène. Au delà de ce mécanisme d'hapténisation, le signal de danger induit par les sensibilisants conduisant à l'activation des cellules dendritiques (DC) est un élément déterminant dans l'induction de cellules T spécifiques de l'haptène. Dans le contexte du 7ième amendement à la directive cosmétique européenne, la mise en place d'une batterie de tests in vitro permettant de prédire le potentiel sensibilisant de molécules est indispensable pour l'industrie cosmétique. Tandis que la plupart des études in vitro étudient les signaux de danger induits par les sensibilisants dans des modèles homéostasiques, nous nous sommes intéressés à l'effet des sensibilisants sur la mise en place d'une réponse inflammatoire. Lorsque la lignée U937 est différenciée avec du PMA et stimulée avec du LPS, les facteurs de transcription NF-κB et Nrf2 sont activés et l'acide arachidonique (AA) est métabolisé au travers de la cascade cPLA2 / COX-2. L'ensemble de ces voies activées conduit à la production par les U937 d'un grand nombre de médiateurs inflammatoires (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-8, PGE2, PGD2, TxB2). Dans ce modèle, nous avons analysé l'effet de 6 sensibilisants de potentiels variés (DNCB, PPD, HQ, PG, CIN, EUG) et montré que de façon inattendue, tous les sensibilisants étudiés diminuent significativement et de façon spécifique la production de tous les prostanoïdes et en particulier de PGE2 induite par PMA/LPS. Nous avons de plus démontré que selon les sensibilisants, les cibles de cette inhibition au sein de la cascade métabolique de l'AA diffèrent, même si elles se focalisent la plupart du temps (sauf pour le DNCB) sur l'enzyme COX-2 (inhibition de son expression et/ou de son activité). Pour le DNCB, le mécanisme d'inhibition semble plutôt impliquer sa capacité à réagir fortement avec les groupements résidus thiols, ce qui se traduit en particulier par la déplétion du GSH intracellulaire et engendrerait l'inhibition des synthases dépendantes du GSH pour leurs activités. En parallèle de cette étude mécanistique, nous avons appréhendé la problématique du point de vue statistique et vérifié sur un set plus important et diversifié de molécules (160 molécules) que le paramètre « inhibition de PGE2 » pouvait être un bon test de prédiction de l'HSRC. L'étude statistique a permis de déterminer le modèle prédictif du test PGE2 et de mettre en évidence de bonnes performances (78%) par rapport aux prédictions du LLNA. Au-delà, une certaine complémentarité du test PGE2 avec d'autres tests in vitro (MUSST, Nrf2-HTS) a pu être mise en évidence. En conclusion, au travers de cette étude, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles propriétés biochimiques des sensibilisants. Même si la signification biologique de la diminution de PGE2 par les sensibilisants de contact demeure complexe d'interprétation, ce paramètre a permis le développement d'un test qui prédit avec de bonnes performances le caractère sensibilisant de molécules et dont la position au sein d'une batterie prédictive d'évaluation de l'allergie de contact reste à être précisée. / Contact sensitizers are defined as reactive molecules (electrophilic) which have the ability to modify skin proteins to form an antigen (hapten). In addition to the haptenation mechanism, danger signals, leading to the activation of dendritic cells, are described to be crucial for the effective induction of an hapten-specific T cell immune response. In the context of the 7th amendment to the Cosmetic Directive, the cosmetic industry is concerned by the challenge of finding non-animal approaches to assess the sensitizing potential of chemicals. While danger signals induced by sensitizers in steady-state conditions have already been analyzed, we chose to investigate the impact of sensitizers on the course of an inflammatory response. For this purpose we used the U937 cell line differentiated with PMA and activated with LPS. In these conditions, cells produce a large amount of inflammatory mediators (IL-β, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-8, PGE2, PGD2, TxB2) through the activation of pathways leading to the activation of the transcription factors NF-κB and Nrf2 and through AA metabolism by the cPLA2/COX-2 cascade. Interestingly, we showed that 6 contact sensitizers with various potential (DNCB, PPD, HQ, PG, CIN, EUG) significally and specifically decrease the production of prostanoïds and in particular of PGE2 induced by PMA/LPS. We further demonstrated that there is no unique inhibition profile of the sensitizers even if the majority (except for DNCB) of the effects applies on COX-2 (i.e. inhibition of the expression and/or activity). For DNCB, inhibition mechanism appears to be dependant of its capacity to react with thiols residues and in particular to deplete intracellular glutathione possibly leading to the inactivation of the PG-synthases. In parallel, we assess a statistical analysis on 160 molecules that allow us to define the test parameters (a molecule is a sensitizer if the PGE2 inhibition at 24h is more than 60%) and to calculate the test performance toward LLNA (78%). Moreover we demonstrated that the PGE2 test could be complementary to other already existing in vitro tests like MUSST or Nrf2-HTS. In summary, we add here a new insight into the multiple biochemical effects described so far for sensitizers. Even if the underlying biological relevance remains unclear, the parameter “PGE2 inhibition” is good test for skin sensitization evaluation. Further studies will precise how this parameter could be implemented into an alternative testing strategy for the evaluation of skin sensitization.

Le développement de l’allergie peut être influencé par le microbiote intestinal qui est impliqué dans la maturation du système immunitaire de l’hôte lors de la colonisation du tractus digestif dès la naissance. L’objectif de mon travail a été d’étudier l’impact du microbiote intestinal sur le développement d’une sensibilisation allergique à des protéines de lait de vache à l’aide d’un modèle de souris BALB/c gnotoxéniques. Dans une première étude, nous avons montré que les souris axéniques (Ax, sans germe) sont plus réactives que les souris conventionnelles (CV) au potentiel immunogénique et allergénique de la β-lactoglobuline (BLG) et de la caséine (CAS), lorsque ces deux protéines sont injectées intrapéritonéalement sans adjuvant. A l’aide d’un autre modèle de sensibilisation par voie orale au lait, nous avons confirmé que les souris Ax développent des réponses IgE contre la BLG plus fortes que celles des souris CV. Les mécanismes de sensibilisation contre la BLG et la CAS sont alors différemment affectés par la présence ou non d’un microbiote intestinal. Par ailleurs, une colonisation tardive du tractus digestif de souris Ax à l’âge de 6 semaines par le microbiote de souris CV induit chez les souris conventionnalisées (CVd) le développement, après sensibilisation, de réponses humorales toujours plus fortes que celles observées chez les souris CV. A l’inverse, une conventionnalisation des souris Ax au moment du sevrage à l’âge de 3 semaines, induit un niveau de sensibilisation plus faible que celui des souris CV. Dans ce cas, des différences de composition du microbiote intestinal entre souris CV et CVd pourraient jouer un rôle dans le faible niveau de sensibilisation des souris CVd. Nous avons enfin évalué l’impact de l’implantation dès la naissance d’une souche de Lactobacillus casei en monoxénie (souris Mx). La réponse humorale contre la CAS, mais pas contre la BLG, est alors significativement plus élevée chez les souris Mx que chez les souris Ax. Ces différentes études suggèrent que l’influence du microbiote sur le développement d’une sensibilisation aux protéines du lait de vache diffère selon les allergènes et selon le mode d’exposition aux allergènes. Ces résultats soulignent également qu’un retard de colonisation du tractus digestif peut perturber durablement la réactivité du système immunitaire à une sensibilisation contre des antigènes alimentaires. / The development of allergic responses can be influenced by the gut microbiota, which critically stimulates the maturation of the host immune system during colonization of the digestive tract at birth. We thus aimed to study the impact of the gut microbiota on the development of an allergic sensitization to cow's milk proteins by using a gnotobiotic BALB/c mouse model. First, we showed that germ-free (GF) mice are more responsive than conventional mice (CV) to the immunogenic and allergenic potential of β-lactoglobulin (BLG) and casein (CAS) when these proteins are injected intraperitoneally without adjuvant. With another model of oral sensitization to cow’s milk, the development of higher BLG-specific IgE responses in GF mice compared to CV mice was confirmed. We also observed that the mechanisms leading to oral sensitization to BLG and CAS are differentially affected by the absence of gut microbiota. Furthermore, a delayed colonization of the digestive tract of 6-week-old GF mice by a conventional microbiota was studied. The conventionalized mice (CVd) still developed, after sensitization, higher antibody responses than those measured in CV mice. In contrast, GF mice conventionnalized just after weaning, at 3 week of age, displayed a level of sensitization lower than that of CV mice. Differences in the gut microbiota composition evidenced between CVd and CV mice could also play a role in the lower level of sensitization of CVd mice. Finally, we evaluated the impact of the neonatal mono-colonization of mice by a strain of Lactobacillus casei. The antibody responses against CAS, but not against BLG, were then significantly higher in mono-associated mice than in GF mice. These studies suggest that the influence of microbiota on the development of sensitization to cow's milk proteins depends on the nature of the allergens and the mode of exposure. These results also underline that delayed bacterial colonization altered persistently the host immune response to oral sensitization against food antigens.

Les neutrophiles constituent une première ligne de défense contre les agents infectieux. En revanche, leur activation incontrôlée peut exacerber certaines pathologies inflammatoires telles que les allergies cutanées. Notre équipe a montré précédemment que le facteur de transcription Nrf2 connu pour son rôle anti-oxydant, régulait l’inflammation cutanée dans l’hypersensibilité de contact (HSC). Ainsi ce travail a été mené pour évaluer in vitro l’implication de la voie Nrf2 dans les fonctions des neutrophiles et pour identifier son rôle dans le recrutement et l’activation des neutrophiles dans l’HSC.In vitro, nous montrons que la protéine Nrf2 est fortement exprimée dans les neutrophiles de la moelle osseuse. Nrf2 est fonctionnelle dans les neutrophiles stimulés : il active la transcription de gènes cibles cytoprotecteurs et diminue celle des gènes de l’inflammation. Ainsi, le prétraitement des neutrophiles avec un activateur de Nrf2 tel que le sulforaphane, réduit la production des formes réactives de l’oxygène (FRO)en réponse à une stimulation. En parallèle, l’absence de Nrf2 ne semble pas affecter la phagocytose et la nétose, deux fonctions clés du neutrophile. Enfin, Nrf2 est indispensable pour une migration optimale des neutrophiles en réponse aux chimiokines.Au cours de l’HSC induite par le dinitrochlorobenzène (DNCB), Nrf2 régule indirectement le recrutement des neutrophiles, en contrôlant le stress oxydant cutané et les voies inflammatoires impliquées dans la production de chimiokines, notamment CCL2, CCL4 et CCL11. En outre, Nrf2 induit l’augmentation d’expression du scavenger CD36 dans les macrophages et augmente ainsi leur capacité à éliminer les neutrophiles apoptotiques pour initier la résolution de l’inflammation.En conclusion, l’activation de Nrf2 dans les neutrophiles participe au contrôle de la production des FRO et la migration. En outre, Nrf2 émerge comme un effecteur clé dans le contrôle du recrutement et de la clairance des neutrophiles au cours de la réponse inflammatoire cutanée aux molécules allergisantes. La mise en évidence de ces mécanismes protecteurs de Nrf2 nous permet de proposer cette protéine comme nouvelle cible thérapeutique dans le contrôle d’inflammations cutanées chroniques. / Neutrophils form the first line of defense against infectious agents. However, their uncontrolled activation may exacerbate certain inflammatory conditions such as cutaneous allergies. Our team has previously shown that Nrf2 transcription factor known for its antioxidant role, regulates skin inflammation in contact hypersensitivity (CHS). Thus, our work was carried out to evaluate in vitro the involvement of Nrf2 pathway in neutrophil functions and to identify Nrf2 role in neutrophil recruitment and activation in CHS.In vitro, we showed that the protein Nrf2 was highly expressed in bone marrow neutrophils. Nrf2 is functional in stimulated neutrophils: it activates the transcription of cytoprotective genes and downregulates that of inflammatory genes. Thus, pretreatment of neutrophils with an Nrf2 activator such as sulforaphane reduces the production of reactive oxygen species (ROS) in response to stimulation. In parallel, Nrf2 does not affect two key functions of neutrophil, phagocytosis and netosis.Finally, Nrf2 is essential for optimal migration of neutrophils toward chemokines. In CHS induced by the dinitrochlorobenzene (DNCB), Nrf2 indirectly regulates the recruitment of neutrophils, through regulation of skin oxidant stress and inflammatory pathways that are involved in chemokines production, including CCL2, CCL4 and CCL11. In addition, Nrf2 induces the up-regulation of scavenger CD36 in macrophages and thus increases their ability to eliminate apoptotic neutrophils leading to the resolution of inflammation.In conclusion, Nrf2 activation in neutrophils participates in the control of ROS production and migration. In addition, Nrf2 emerges as an important effector in the control of neutrophil recruitment and clearance during the skin inflammatory response to allergenic molecules. The demonstration of Nrf2 protective mechanisms leads us to suggest this protein as a new therapeutic target in the control of chronic skin inflammations.

Diabetes mellitus Typ 1 und Allergien vom Soforttyp gehören zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des Kindes- und Jugendalters. Diabetes mellitus Typ 1 wird verursacht durch eine autoimmune Zerstörung der Beta-Zellen des Pankreas. Aus immunologischer Sicht wird dieser Prozess durch TH1-Zellen dominiert. Im Gegensatz dazu wird vermutet, dass Allergien vom Soforttyp, wie die allergische Rhinitis, das allergische Asthma und die allergische Urtikaria mit TH2-Zellen assoziiert seien. Die Hypothese, dass TH1- und TH2-Zellen sich gegenseitig in ihrer Aktivität hemmen, ist immer noch gültig. Ziel unserer Fall-Kontroll-Studie war es, die Assoziation zwischen Typ 1 Diabetes und IgE-vermittelten Allergien zu untersuchen. Zur Prüfung unserer Forschungshypothese wurden ein standardisierter, evaluierter Fragebogen sowie verschiedene Laboranalysen herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass Diabetes mellitus Typ 1 mit einem erhöhten Risiko für das gleichzeitige anamnestische Vorliegen IgE-vermittelter allergischer Symptome assoziiert sein könnte. Somit konnten wir bestätigen, dass die noch heute weit verbreitete TH1/TH2-Hypothese eine Vereinfachung tatsächlich viel komplizierterer immunologischer Vorgänge darstellt. Um diese Assoziation im Detail zu prüfen, bedarf es jedoch weiteren populationsbasierten epidemiologischen Studien.:I. Bibliographische Beschreibung 7 II. Abkürzungsverzeichnis 9 1. Einführung 11 1.1 Epidemiologie und Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 1 11 1.2 Epidemiologie und Pathogenese von Allergien vom Soforttyp 13 1.3 Aktueller Forschungsstand zum Thema 14 2. Das Promotionsprojekt 17 2.1 Forschungshypothese und Fragestellung 17 2.2 Patienten und Methoden 17 2.3 Statistische Datenauswertung 19 2.4 Ergebnisse 20 2.5 Einordnung in den aktuellen wissenschaftlichen Diskurs 23 3. Publikationsmanuskript 29 4. Zusammenfassung der Arbeit 43 5. Literaturverzeichnis 47 III. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 55 IV. Curriculum Vitae 57 V. Liste der Veröffentlichungen 59 VI. Danksagung 61

Allergien sind häufige Erkrankungen in vielen industrialisierten Ländern. Ihre Entstehung beruht auf einem komplexen Zusammenspiel von genetischen und umweltassoziierten Einflüssen. Eine Vielzahl möglicher Faktoren ist beschrieben, die das Auftreten von AllerT gien beeinflussen können, etwa das Alter oder das Geschlecht. Es gibt allerdings nur sehr wenige Daten zur Verbreitung allergischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, eine Übersicht zur Prävalenz allergischer ErkranT kungen und Sensibilisierungen in einer Stichprobe der 40T79Tjährigen Bevölkerung Leipzigs zu geben. Hierzu wurden insgesamt 4088 Probanden der zweiten ZwischenausT wertung (1. November 2011 bis 12. Juni 2013) der LIFETStudie untersucht. LIFE (Leipziger Forschungskomplex für Zivilisationserkrankungen) ist eine Kohortenstudie zur Erfassung von lebensstilT und umweltassoziierten Erkrankungen, beispielsweise Allergien, und mögT lichen Einflussfaktoren. In der vorliegenden Arbeit werden allergische Erkrankungen (alT lergische Rhinitis, Asthma bronchiale, atopisches Ekzem, Urtikaria, Anaphylaxie, NahT rungsmittelT und Insektengiftallergien) anhand eines AllergieTInterviews erfragt; SensibiliT sierungen werden mittels IgETDiagnostik für InhalationsT (SX1T) und NahrungsmittelallerT gene (FX5TScreeningtest) bzw. mittels Hautpricktest (Birke, Wiesenlieschgras, Beifuß, Dermatophagoides pteronyssinus, Alternaria alternata und Ambrosia) erfasst, weiterhin wird das GesamtTIgE bestimmt. Als mögliche Einflussfaktoren werden das Geschlecht, das Alter, der sozioökonomische Status und die allergologische Familienanamnese unterT sucht, hierzu werden neben den Prävalenzen auch OddsTRatios berechnet. Allergien sind häufige Erkrankungen in vielen industrialisierten Ländern. Ihre Entstehung beruht auf einem komplexen Zusammenspiel von genetischen und umweltassoziierten Einflüssen. Eine Vielzahl möglicher Faktoren ist beschrieben, die das Auftreten von Allergien beeinflussen können, etwa das Alter oder das Geschlecht. Es gibt allerdings nur sehr wenige Daten zur Verbreitung allergischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, eine Übersicht zur Prävalenz allergischer Erkrankungen und Sensibilisierungen in einer Stichprobe der 40-79-jährigen Bevölkerung Leipzigs zu geben. Hierzu wurden insgesamt 4088 Probanden der zweiten Zwischenauswertung (1. November 2011 bis 12. Juni 2013) der LIFE-Studie untersucht. LIFE (Leipziger Forschungskomplex für Zivilisationserkrankungen) ist eine Kohortenstudie zur Erfassung von lebensstil- und umweltassoziierten Erkrankungen, beispielsweise Allergien, und möglichen Einflussfaktoren. In der vorliegenden Arbeit werden allergische Erkrankungen (allergische Rhinitis, Asthma bronchiale, atopisches Ekzem, Urtikaria, Anaphylaxie, Nahrungsmittel- und Insektengiftallergien) anhand eines Allergie-Interviews erfragt; Sensibilisierungen werden mittels IgE-Diagnostik für Inhalations- (SX1-) und Nahrungsmittelallergene (FX5-Screeningtest) bzw. mittels Hautpricktest (Birke, Wiesenlieschgras, Beifuß, Dermatophagoides pteronyssinus, Alternaria alternata und Ambrosia) erfasst, weiterhin wird das Gesamt-IgE bestimmt. Als mögliche Einflussfaktoren werden das Geschlecht, das Alter, der sozioökonomische Status und die allergologische Familienanamnese untersucht, hierzu werden neben den Prävalenzen auch Odds-Ratios berechnet. Insgesamt zeigt sich, dass allergische Erkrankungen und Sensibilisierungen in der untersuchten Stichprobe häufig sind. Die Einflussfaktoren zeigen unterschiedliche Effekte für das Risiko einer Allergie. Beispielsweise geht eine positive allergologische Familienanamnese mit einem erhöhten Risiko einher. Die möglichen Ursachen für Prävalenzunterschiede bei den allergischen Erkrankungen im Vergleich mit der Literatur und das Verhalten der Einflussfaktoren werden, ebenso wie die bestehenden Limitationen von LIFE, kritisch diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wird erstmalig der Status quo von allergischen Erkrankungen in einer Probandengruppe der älteren Leipziger Bevölkerung gezeigt. Allergien sind bei den älteren Teilnehmern weniger häufig als bei den jüngeren, aber immer noch weit verbreitet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um mögliche Prävalenzänderungen zu dokumentieren und weitere Einflussfaktoren zu untersuchen. LIFE und seine geplanten Nachuntersuchungen bieten hierfür passende Möglichkeiten.

Les allergies aux produits chimiques et aux médicaments constituent un problème majeur de santé publique. L’objectif de ce travail est de mieux comprendre l’interaction entre les cellules dendritiques (DC) et les lymphocytes T (LT) dans les allergies induites par les haptènes métalliques (nickel et cobalt) et les médicaments [benzylpénicilline (BP)]. En présence des signaux de danger, les DC acquièrent un phénotype dit « mature » et présentent l’antigène apprêté aux LT spécifiques de cet antigène. Les LT représentent les cellules effectrices responsables d’une manière directe ou non des symptômes observés lors des réactions allergiques. Dans un premier temps, nous montrons que le nickel est capable d’induire un ratio d’interleukines (IL) IL-23/IL-12p70 élevé dans les DC favorisant ainsi la polarisation Th17 qui est détectée chez la majorité des patients allergiques au nickel. Nous montrons aussi pour la première fois une production de l’IL-27 par les DC activées par le nickel. Nous avons ensuite montré l’implication du TLR4 et de la voie Jak-STAT dans la régulation des cytokines membres de la famille de l’IL-12. L’activation de la voie Jak-STAT est nécessaire pour la réponse Th1 en favorisant la production de l’IL-12p70 et en inhibant la production de l’IL-23 par les DC activées par du nickel. Par ailleurs, nous avons identifié et, pour la première fois, une activation du facteur de transcription NFIL-3, au sein des DC, par le nickel et le cobalt voire d’une manière plus intense avec ce dernier. D’autre part, nous avons mis en évidence l’existence d’un répertoire de LT naïfs CD4+ et CD8+, provenant de la population générale, spécifiques du nickel. L’activation de ces LT requiert les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et ils présentent un faible taux de réactivité croisée avec le cobalt. Simultanément, nous avons mis en évidence la possibilité de détecter des LT naïfs CD8+ spécifiques de la BP. L’activation de ces LT dépend des molécules du CMH de classe I et du protéasome. D’une manière générale, notre travail contribue à une meilleure compréhension des mécanismes des réactions allergiques d’une part, en montrant la fine régulation des cytokines membres de la famille de l’IL-12 dans les DC et d’autre part en élucidant les mécanismes de l’immunisation contre les molécules allergisantes. / Drug and chemical allergy is a major public health concern. The aim of this work is to understand the interaction between dendritic cells (DCs) and T-lymphocytes (LT) in allergic manifestations induced by metallic haptens (nickel and cobalt) and benzylpenicillin (BP). DCs capture the antigen, start maturation, migrate to the regional lymph node and activate hapten-specific T-cells. The latter will represent the effector cells responsible directly or not for the symptoms observed during allergic reactions. We showed that nickel induced a high ratio of interleukin (IL) IL-23 compared to IL-12p70 in DCs leading to Th17 polarization as seen in allergic patients. We also showed for the first time the production of IL-27 by nickel-activated DCs. Moreover, we showed the involvement of TLR4 and Jak-STAT pathways in IL-12 cytokine family regulation. The activation of the Jak-STAT pathway seems to maintain the IL-23/IL-12p70 balance by limiting IL-23 production and promoting Th1 polarization. Furthermore, we identified for the first time the activation of NFIL-3 in DC by nickel and cobalt, more intensely with the latter. In addition, nickel-recognizing CD4+ and CD8+ naïve T-cells repertoire was identified from the general population. These positive T-cells were shown to recognize nickel in the context of major histocompatibility complex (MHC) molecules. We also showed that a low frequency of nickel-recognizing CD4+ naïve T-cells cross-reacted with cobalt. Simultaneously, we showed the possibility of detecting a naïve CD8+ T-cells repertoire for BP. The activation of these specific T-cells requires MHC class I molecule and proteasome. In resume, our work contributes to a better understanding of allergic reactions, on one hand, by studying the fine regulation of the IL-12 cytokines family in DCs and on the other hand, by clarifying the mechanisms of immunization against drugs and chemicals.

Die Rolle der Dendritischen Zellen (DZ) bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Allergien ist schon lange Gegenstand der Forschung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten zur Erforschung dieser wichtigen Immunzellen, vor allem auch im Hinblick auf klinische Studien, auf die Spezies Pferd erweitert werden. Die Erkrankung des Sommerekzems bietet hierbei ein bereits bis auf Genebene analysiertes und identifiziertes Allergen, mit einem klinisch eindeutigen, vor allem beim Islandpferd häufig auftretenden Krankheitsbild. Der Idee, ausreichend DZ aus Vollblut beim Pferd ex vivo zu generieren, mit dem aufgearbeiteten Culicoidesprotein zu beladen, damit künftig solche DZ dem betroffenen Spendertier als Immuntherapie reinjiziert werden können, sollte hier näher nachgegangen werden. Die ausreichende und möglichst reine Generierung equiner DZ stellte die erste Hürde dar und konnte nach Vergleich und Verbesserung einiger unterschiedlicher Protokolle mit befriedigendem Ergebnis bewältigt werden. Funktionelle Analysen der so gewonnenen DZ zeigten die gewünschten, aus den humanen und murinen Studien bekannten Reaktionen der Zellen wie MHC-II-Hochregulierung, T-Zell-Stimulationsvermögen sowie Antigenaufnahme mittels Endozytose. Die angestrebte Aufnahme des markierten Culicoidesproteins in die Zellen konnte ebenso per Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie nachvollzogen werden. Eine äußerst wichtige Erkenntnis ergab sich aus der Zytokinuntersuchung auf RNA-Ebene, wo eine deutliche Erhöhung der RNA für IL-12 nach In-vitro-Stimulation mit LPS oder Culicoidesprotein nachgewiesen werden konnte. Dies ist ein Hinweis auf die eventuellen Nutzungsmöglichkeiten des hier beschriebenen DZ-Typs im Rahmen einer angestrebten Therapie der am Sommerekzem erkrankten Tiere. Denkbar wäre zum Beispiel die Initiierung einer Immuntherapie, abzielend auf Immundeviation. Die Culicoides-beladenen DZs sollten, repetitiv injiziert, über IL-12 dabei zu einer Unterdrückung der TH2-Immunantwort zu Gunsten von T-Helfer-1-Zellen (TH1) führen. Dieser erste Ansatz für eine klinische Anwendung der hier beschriebenen DZs soll zusätzlich auch die Forschungsbemühungen auf das Pferd und die hier noch im Verborgenen liegenden Erkenntnisse zum Verständnis von Allergien lenken.