Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l'enfant jeune chez qui l'allergie respiratoire et l'allergie alimentaire sont les principales pathologies. L'unique traitement curatif est l'immunothérapie spécifique d'antigène (ITA), largement développée dans l'allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l'allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l'allergie est indispensable et il n'existe actuellement pas d'examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d'IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l'intérêt d'un test fonctionnel, l'ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l'allergie aux acariens chez l'enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d'acariens sécréteur d'interleukine (IL)-4 ou d'IL-13 était associé à la présence d'une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d'une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d'une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l'année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l'intérêt de l'ELISpot dans le diagnostic de l'allergie au lait de vache chez l'enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d'IL-4 et d'IL-13 était associé à l'allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l'enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d'une ITA sub-linguale (SLIT) d'une part et sous-cutanée (SCIT) d'autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d'IL-4 et IL-13) spécifiques d'acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d'IL-10 (Tr1) spécifiques d'acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n'avons pas retrouvé de production accrue d'interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d'acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu'un test fonctionnel, l'ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l'allergie aux acariens et de l'allergie au lait de vache chez l'enfant. Par ailleurs, l'ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu'une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l'enfant allergique aux acariens.

Les effets anti-allergiques des bactéries lactiques sont suggérés par plusieurs études épidémiologiques, des essais cliniques et des modèles expérimentaux d’allergie. Cependant, les propriétés immunomodulatrices des bactéries lactiques sont sous-exploitées par les stratégies vaccinales développées pour combattre l’allergie et les mécanismes empruntés par ces bactéries pour moduler l’allergie restent peu caractérisés.<p>Dès lors, nous avons caractérisé les propriétés immunomodulatrices qu’exerce Lactobacillus plantarum NCIMB8826, une bactérie lactique modèle, sur la cellule dendritique étant donné le rôle déterminant de cette cellule sur la réponse allergique. Nous montrons que L. plantarum induit une forte sécrétion d’IL-12 p40, d’IL-12 p70, de TNF-a mais une faible production d’IL-10. Cette faculté à induire la sécrétion de cytokines polarisantes dépend de TLR2, de TLR9, de MyD88, de NF-kB, des MAPKs (en particulier JNK, p38 et ERK 1/2), de la composition de l’acide lipotéichoïque de L. plantarum et de CD14. Nous montrons aussi que l’ADN génomique de L. plantarum est un agoniste de TLR9 et que CD14 et CD36 facilitent la liaison de la cellule dendritique avec L. plantarum.<p>Ensuite, nous avons évalué le potentiel vaccinal d’une coadministration L. plantarum + Der p 1 dans un modèle murin d’allergie à Der p 1. Cette formulation vaccinale prévient la production d’IgE Der p 1-spécifique et atténue l’éosinophilie pulmonaire tout en stimulant une forte production d’anticorps IgG2a Der p 1-spécifiques et d’IFN-g par les cellules spléniques. Ces effets bénéfiques nous ont conduit à élaborer une bactérie lactique recombinante dérivée de L. plantarum produisant Der p 1 pour la vaccination contre l’allergie aux acariens. La forme antigénique que nous avons réussi à faire produire par L. plantarum correspond à une protéine de fusion entre la Maltose Binding Protein de E. coli et ProDer p 1 (le zymogène de Der p 1), la présence de ce partenaire de fusion étant indispensable à la production de ProDer p 1. En prophylaxie, la vaccination par cette bactérie recombinante prévient la production d’anticorps IgE-Der p 1-spécifiques et stimule la production d’anticorps IgG2a spécifiques, reproduisant les effets de la coadministration L. plantarum + Der p 1. Elle réduit de manière drastique la production d’IL-5 des cellules spléniques et des cellules ganglionnaires médiastinales et prévient l’éosinophilie pulmonaire mais n’a pas d’effet sur l’hyperréactivité bronchique. Der p 1 étant un des allergènes d’acarien les plus immunodominants, cet ensemble de données montre donc que cette bactérie recombinante constitue un vaccin prophylactique prometteur pour la prévention de l’allergie aux acariens. Des résultats préliminaires obtenus à partir de cellules dendritiques humaines et lymphocytes T autologues montrent la forte capacité de cette bactérie recombinante à induire le développement d’une réponse Th1 fortement polarisée (production d’IFN-g en l’absence de production d’IL-4 et d’IL-5), ce qui suggère que l’utilisation de cette bactérie recombinante pourrait être envisagée pour le traitement de l’allergie chez l’homme. <p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’allergie de type I, une réaction de type hypersensibilité immédiate (HIS), a considérablement augmenté au cours des dernières décades dans les pays industrialisés. Le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans le contrôle des maladies allergiques a été récemment apprécié. Cependant, il n’existe actuellement aucune connaissance précise si et comment les CD4+ Treg peuvent réguler l’allergie de type I. Le but du projet était d’étudier la contribution de cellules Treg dans le contrôle de l’allergie de type I chez la souris et chez l’homme. En utilisant un modèle murin d’HSI aux protéines de lait de vache, ß-lactoglobuline(BLG), nous avons montré que l’absence de Treg augmentait les réponses des cytokines Th1et Th2 et des anticorps IgE, IgG1 et IgG2a spécifique de la BLG. De plus, l’absence de Treg a augmenté la sévérité de l’anaphylaxie chez les souris sensibilisées lors de l’épreuve orale avec la BLG, avec une augmentation concomitante de la protéase des mastocytes muqueux 1(mMCP-1) dans le sérum. La contribution des cellules Treg dans un modèle murin d’anaphylaxie systémique passive (PSA) a été également étudiée. Une anaphylaxie plus sévère a été observée chez les souris déficientes en CHM de classe II ainsi que chez des souris B6 traitées avec un anti-CD4. En revanche, la déplétion sélective des Foxp3+ Treg chez des souris Tg DEREG n’a pas d’effet sur l’anaphylaxie.La capacité des Treg à contrôler la dégranulation des basophiles a été étudiée chez l’homme. Les données préliminaires ont montré que les Treg ont été incapables de contrôler la dégranulation des basophiles chez les donneurs sains. En revanche, une légère mais reproductible down-regulation de la dégranulation/activation des basophiles a été observée dans l’allergie induite par les médicaments chez l’homme. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence un nouveau rôle encore non identifié des Treg dans le contrôle de l’HSI et souligne que chez la souris et l’homme, les Treg peuvent dans certaines conditions, limiter la sévérité de l’HSI en agissant sur les mastocytes et/ou basophiles effecteurs / Type I allergy, an immediate type hypersensitivity reaction (ITH), has dramatically increased during the past decades affecting up to 30% of the population in industrialized countries. The role of regulatory T cells (Treg) in the control of allergic diseases has been recently appreciated. However, there is currently no precise knowledge of whether and howCD4+ Treg can regulate type I allergy. The aim of this project was to investigate the contribution of Treg in the control of type I allergy. Using a murine model of ITH to cow’s milk protein the ß-lactoglobulin (BLG), we showed that lack of Treg increased BLG-specific Th2 and Th1 cytokine response and BLG-specific IgE, IgG1 and IgG2a antibodies.Furthermore, absence of Treg enhanced the severity of the anaphylaxis with concomitant increase in serum mucosal mast cell protease 1 (mMCP-1) in sensitized mice upon oral challenge with BLG. Furthermore, we investigated the contribution of Treg in a murine model of passive systemic anaphylaxis (PSA). More sever anaphylaxis was observed in both MHCclass II KO mice and after anti-CD4 mAb treatment. Alternatively, selective depletion of Foxp3+ Treg in DEREG Tg mice did not show changes in anaphylaxis.The capacity of Treg to control basophils degranulation was investigated in humans. Preliminary data showed that Treg were unable to control basophils degranulation in healthy donors. In contrast, a slight butreproducible downregulation of basophils activation/ degranulation was observed in allergic individuals. Taken together, our work points out to a novel as yet unidentified role of Treg in the control of ITH and emphasizes that both mouse and human Treg can, in certain conditions, limit the severity of ITH by acting on mast cells and/or basophils effectors of ITH

Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. / Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules.

Untersuchungen der letzten Jahre deuten darauf hin, daß Virusinfektionen ein potentieller Modulator der menschlichen Allergieentstehung sind. Die folgende Studie untersucht, ob frühkindliche Infektionen mit CMV, EBV und VZV einen protektiven Effekt auf die Entstehung atopischer Erkrankungen im späteren Leben haben. Die Studie berücksichtigt sowohl die humorale, als auch die zelluläre Immunantwort auf Virusinfektion. Die humorale Immunantwort wurde serologisch im Verlauf bei 672 Kindern von Geburt bis zum 7. Lebensjahr untersucht (ELISA). Die Antikörper-Titer für CMV, EBV und VZV im Alter von 1 Jahr und 3 Jahren wurden mit den atopischen Manifestationen (atopische Dermatitis, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis, Gesamt-Serum-IgE und atopische Sensibilisierung) verglichen. Die TH1 Immunantwort (intrazelluläre IFN gamma Produktion) wurde bei 100 Kindern mit und ohne atopische Manifestationen im Alter von 1 Jahr bis 16 Jahren nach CMV Stimulation untersucht (Durchflußzytometrie). Signifikante Unterschiede in den Häufigkeiten atopischer Symptome zwischen Kindern mit positivem und negativem Antikörper-Titer gegen CMV, EBV und VZV konnten nicht gezeigt werden. Auf zellulärer Ebene zeigte sich, daß Kinder und Jugendliche ohne atopische Symptome auf Virus-Stimulation (CMV-Antigen bzw. Peptid) statistisch ebenso häufig mit einer IFN-gamma-Produktion (TH1-Immunantwort) reagieren wie Kinder und Jugendliche mit atopischen Krankheitszeichen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie können die Hypothese eines protektiven Effekts viraler Infektion, zumindest der Herpesgruppe, in den ersten Lebensjahren hinsichtlich einer späteren Allergieentstehung nicht bestätigen. Die Zusammenhänge der Entwicklung atopischer Erkrankungen sind bisher noch nicht vollständig geklärt. Es gilt weiterhin zu erforschen, in welchem Maße frühkindliche Infekte, neben Allergenexposition, Ernährung, Luftschadstoffen und familiärer Prädisposition die Allergogenese beeinflussen. / Studies of the last years indicated that virus infections are a potential modulator of the human allergogenesis. The following study analysed if infections with CMV, EBV and VZV in early childhood have a protective effect on the development of atopic disorders in later life. The study considered the humoral and cellular immuneresponse to virus infection. The humoral immuneresponse of 672 children were serologically followed up from birth to the age of seven years (ELISA). The antibody titres of CMV, EBV and VZV at the age of 1 year and 3 years were compared with the atopic manifestations (atopic dermatitis, asthma bronchiale, rhinoconjunctivitis, total serum IgE levels and atopic sensitiziation) at the age of seven years. The TH1 immuneresponse (intracellular IFN gamma production) of 100 atopic and nonatopic children at the age of 1 year to 16 years were analysed after CMV stimulation (flowcytometry). There was no significant difference in atopic manifestations between seven-year-old children with seropositivity and seronegativity (CMV, EBV, VZV) in early childhood. Nonatopic children showed the same T cell reactivity after CMV stimulation like atopic children. The study could not show a protective effect of herpesvirus infections in early childhood on the development of atopic disorders in later life. Further studies will help to understand the influence of virus infections on the human allergogenesis.

L’allergie alimentaire est un problème majeur de santé publique. Sa prévalence est estimée à 5 % chez l’adulte et à 8 % chez l’enfant dans les pays industrialisés. L’objectif de cette thèse est d’apporter une contribution à la diététique diagnostique et thérapeutique de l’allergie alimentaire. Nos travaux ont porté sur l’allergie alimentaire au pois jaune et au sésame. Le pois jaune est un allergène émergent à risque de réaction grave. Son seuil réactogène est bas, soit 0,13 g de protéines alors que la teneur des aliments peut atteindre 20 g/100g. L’étude de 35 personnes allergiques au sésame a permis de définir que le seuil réactogène pouvant déclencher une réaction chez 5% de la population allergique se situe entre 1,2 et 4,0 mg de protéines de sésame. Nous avons validé la progression optimale des doses de sésame pour le test de provocation orale en lien avec le consensus européen Europrevall. L’absence d’harmonisation internationale concernant les allergènes à déclaration obligatoire, nous a conduit dans une seconde partie, à étudier l’impact de l’allergie alimentaire sur la décision, l’organisation et le déroulement d’un séjour à l’étranger. Cette étude réalisée en collaboration avec l’Observatoire Régional de Santé et des Affaires Sociales de Lorraine et les associations française et belge pour la prévention des allergies montre, sur un panel de 102 répondants, que l’allergie alimentaire contraint 14 % des répondants à ne pas voyager à l’étranger et que 30% des personnes ayant voyagé ont présenté une réaction allergique. Les accidents sont survenus principalement dans les restaurants. Ces résultats soulignent la nécessité de développer un système d’information et de formation des personnes allergiques et des professionnels de l’alimentation pour mettre en oeuvre des stratégies de prévention du risque. / Food allergy is a major public health problem. Its prevalence is estimated at 5% in adults and 8% in children in industrialized countries. The objective of this thesis is to bring a contribution to the diagnostic and therapeutic dietetics in food allergy. Our work focused on yellow pea and sesame food allergies. Yellow pea is an emerging allergen with risk of a severe reaction. Its reactogenic threshold is of 0.13 g of protein while the content of food can reach 20 g / 100g. The study of 35 people allergic to sesame has enabled the identification of the reactogenic threshold that can trigger a reaction in 5% of the allergic population. It is estimated between 1.2 and 4.0 mg of sesame protein. We validated optimal progression dosing scheme for sesame for oral challenge test taking in account the European consensus Europrevall. Lack of international harmonization on mandatory allergens, led us in a second part of this thesis, to study the impact of food allergy on the decision, trip organization and a stay abroad of an allergic person. This study, conducted in collaboration with the regional health observatory and Social Affairs of Lorraine and the French and Belgian associations for allergy prevention shows, on a panel of 102 respondents, that food allergy forced 14% of respondents do not travel abroad and that 30% of people who have traveled had an allergic reaction. The accidents occurred mainly in restaurants. These results highlight the need to develop an information system and training of allergies and food professionals to implement risk prevention strategies.

Parasitische Würmer wie Filarien können das Immunsystem ihres Wirtes modulieren. Diese Immunmodulation schützt nicht nur den Parasiten, sondern kann auch den Wirt vor allergischen Reaktionen schützen. In der vorliegenden Arbeit konnte belegt werden, dass Filariencystatin, ein sezernierter Proteinaseinhibitor des Fadenwurms Acanthocheilonema viteae Th2-assoziierte Entzündungen und die daraus resultierende Atemwegserkrankung im murinen Asthmamodell supprimiert. Diese Effekte von Cystatin beruhen wahrscheinlich auf der Induktion von IL-10 sezernierenden Makrophagen. Dafür spricht, dass sowohl die Depletion von Makrophagen, als auch die Blockierung von IL-10 den schützenden Effekt von Cystatin aufhoben. In einem murinen Dermatitismodell konnte durch Cystatinapplikation die Entzündung der Haut ebenfalls unterbunden werden. Die Verbesserung der atopischen Dermatitis führte zu einem Anstieg von TGF-Beta in den Ekzemregionen. Zusammenfassend belegen die Daten, dass ein einzelnes rekombinantes Helminthenprotein den anti-allergischen Effekt einer Gesamtwurminfektion nachahmen kann. Des weiteren wurde untersucht, ob die Immunmodulation von Helminthen an die Biologie des Wurmes gebunden ist. Der Einfluss einer gastrointestinalen Wurminfektion mit Heligmosomoides polygyrus wurde in Modellen mucosa-assoziierter allergischer Atemwegsentzündung und nicht-mukosa-assoziierter, kutanen Dermatitis untersucht. Im Asthmamodell konnte eine Reduzierung der Inflammation beobachtet werden, im Dermatitis Modell keinerlei Verbesserung des klinischen Bildes. Die Wurminfektion führte zu erhöhten Werten von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) in peribronchialen Lymphknoten, im Gegensatz dazu konnten keine Treg Zellen in ekzematöser Haut nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind ein wichtiger Aspekt beim Einsatz von Helminthen zur Behandlung allergischer Erkrankungen, da die Lokalisation des Wurmes ein entscheidender Faktor in Richtung Verbesserung oder Verschlimmerung allergischer Erkrankungen zu sein scheint. / Parasitic worms, like filariae, have the intriguing capacity to modulate immune responses directed against them. This immunomodulation protects the parasite and was found to mediate a negative correlation between parasite infections and the prevalence of allergic disease. In the present study filarial cystatin (Av17), a secreted protease inhibitor of the filarial nematode Acanthocheilonema viteae, was found to suppress Th2-related inflammation and allergic airway responsiveness in mice. These effects of Av17 on allergic airway inflammation were probably due to induction of IL-10 secreting macrophages. Depletion of macrophages as well as blocking of IL-10 by application of anti-IL-10 receptor antibodies, prevented the curative effects and restored allergic airway inflammation. Treatment with cystatin in a model of allergic skin disease, suppressed inflammation, too. The protective effect on atopic dermatitis was accompanied by an increase of TGF-Beta in the eczema region. Hence, the data demonstrate that treatment with a single recombinant helminth protein can exert the anti-allergic effects of helminth infections. Furthermore this study investigated if immunomodulation by helminths is dependent on the biology of the worm. Infection with the gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus, was analyzed in models of mucosa-associated airway disease and non-mucosal, cutaneous atopic dermatitis. Infected mice showed reduced signs of allergic airway inflammation but no differences in phenotypical signs of dermatitis. Worm infection was associated with elevated numbers of Foxp3+ regulatory T cells (Treg) in peribronchial lymph nodes in the asthma model, whereas Treg cells were basically absent in eczematous skin. These findings might be an important aspect for future considerations of helminths for treatment of allergic diseases, as localisation of the parasites might be a crucial factor leading to amelioration or aggravation of allergic disease.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l’immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l’activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d’envisager l’étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l’activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu’il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d’AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l’impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l’autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté / Mast cells are cells with ubiquitous tissue distribution, derived from CD34 + multipotent hematopoietic cells. These cells play a fundamental role in the initiation of innate and adaptive immune response and in IgE-dependent allergic reactions or in various inflammatory reactions.Mastocytosis is defined as a myeloproliferative neoplastic disorder, caused by an abnormal accumulation of mast cells in one or more organ systems. Mastocytosis presents in cutaneous and systemic forms. In patients with systemic mastocytosis, the most frequent point mutation is KIT D816V, whereas in pediatric patients, where the disease is usually restricted to the skin, different KIT defects have been detected, mostly in the extracellular portion of KIT.In a primary culture of mast cells made from precursors of one cord blood, we have successfully isolated a new human mast cell line called ROSA KIT WT with a phenotype and reactivity comparable to those of normal mast cells. This cell line is dependent on SCF for growth and expresses the KIT receptor wild. It is easy to grow in large quantities, to freeze and to activate by IgE-anti IgE couple or a couple of allergen and corresponding specific IgE. This cell line can be used to study pathophysiologic mechanisms of allergy and to develop and use high-throughput screening tests of molecules in search of anti-allergic properties.In addition, we transfected these cells by lentiviral vectors providing constructs encoding the mutated KIT D816V or the mutated KIT Delta 417-419 insY, two KIT abnormalities encountered in the course of mastocytosis. This allowed us to establish two new cell lines independent of SCF for proliferation, ROSA KIT D816V and ROSA KIT Delta417-419 insY, which are particularly easy to grow in large quantities, and whose phenotype is similar to that of abnormal mast cells during mastocytosis. These two cell lines can be used for pathophysiologic studies on mastocytosis and for high throughput screening of molecules in search of antiproliferative effects specifically directed against the mutated KIT or against one or other of the intracellular molecules involved in signal transduction induced by mutant KIT.

Les travaux présentés dans cette thèse concernent le développement de nouveaux outils d'analyse multiparamétrique de type biopuce ou puce électrochimique, appliqués au diagnostic et au contrôle environnemental. Le premier axe de recherche a pour objectif le diagnostic, par la détection de panels d'anticorps marqueurs d'un état pathologique dans le sérum de patients. Dans cette optique, deux systèmes d'immunotests ont été développés, permettant la détection multiparamétrique d'anticorps spécifiques grâce à l'analyse automatisée et haut-débit d'échantillons de sérum. Cette approche s'est basée sur la capture des anticorps cibles par des sondes antigéniques immobilisées selon une matrice de plots sur des membranes constituant les fonds de puits de micro-plaques. La détection des interactions est effectuée par colorimétrie à l'aide d'un marqueur enzymatique. Ces outils ont permis l'analyse de 96 échantillons en moins de trois heures, et ont été mis au point pour deux applications. La première consiste en le diagnostic d'allergies, et la seconde s'intéresse au diagnostic du cancer. La seconde partie des travaux est appliquée au contrôle environnemental par surveillance de l'eau. Des pesticides, toxines et explosifs ont été définis comme composés cibles du test multiparamétrique. Afin de les intégrer dans une matrice de plots, des conjugués sondes ont été synthétisés à partir de ces haptènes. Après criblage et optimisation des conjugués en fonction de leur réactivité et réactivité-croisée avec les anticorps spécifiques, l'outil développé a démontré ses performances analytiques en termes de sensibilité et de sélectivité pour la détection des cibles. Un autre capteur pour la surveillance de l'eau a été développé dans le cadre du projet Européen BONAS. Ce test électrochimique vise à détecter des précurseurs d'explosifs utilisés dans la préparation de systèmes explosifs improvisés, pour la localisation de fabriques de bombes artisanales. La puce mise au point consiste en un réseau d'électrodes sérigraphiées, modifiées par électrodépôt de différents métaux / The work reported in this thesis focuses on the development of new multiplex analytical devices on biochip or electrode microarray format, dedicated to diagnosis and environmental monitoring. The objective of the first research axis is diagnosis, thanks to the detection in patients’ serum of a panel of antibodies, biomarkers of a pathological state. For that purpose, two immunotests have been developed, enabling the multiparametric detection of specific antibodies by automated and high-throughput analysis of serum samples. This approach is based on the antibodies capture by antigens probes immobilized in a matrix of spots on a membrane surface composing the wells bottom of a micro-titer plate. Enzyme-labeled antibodies have been used, providing a colorimetric detection. This device enabled the achievement of the analysis of 96 samples in less than three hours and has been applied to different applications. The first one consists of allergy diagnosis, and the second focuses on cancer diagnosis. The second part of this work is applied to environmental monitoring, through water analysis. Different types of pollutants have been defined as targets: pesticides, toxins and explosives. In order to integrate them in a matrix of probes, different conjugates have been synthesized with these haptens. After screening and optimization of the conjugates through their reactivity and cross-reactivity with the specific antibodies, the developed device demonstrated his analytical performances in terms of sensitivity and selectivity. Finally, for the European Project BONAS, a last sensor based on water analysis has also been developed. This electrochemical microarray aims to detect explosives precursors, used in improvised explosive devices, for the localization of hidden bomb factory. The chip was designed as a screen-printed electrode network, which was modified by different metals electrodeposition

Chez des patients allergiques, il est possible de retrouver dans leur sérum desanticorps spécifiques du médicament (IgE) et dans leur sang des lymphocytes T spécifiquesdu médicament. La présence de LT spécifiques du médicament chez des patients allergiquessuggère la présentation du médicament par des cellules présentatrices d'antigène telles queles cellules dendritiques.Nous nous sommes alors intéressés à mieux comprendre l'implication deslymphocytes T et des cellules dendritiques dans le développement des allergies auxantibiotiques comme la pénicilline G (ou Benzyl-Pénicilline) ou le sulfaméthoxazole.Ce travail de thèse a permis: i) de démontrer la présence de lymphocytes Tspécifiques de la pénicilline G dans le sang périphérique de donneurs non allergiques à unefréquence mesurable, ii) de développer deux approches expérimentales et de modélisationpour l'identification des épitopes potentiellement présentés aux lymphocytes T et iii)d'étudier l'effet des médicaments sur les cellules dendritiques.Les perspectives de ce travail sont de mieux comprendre les mécanismes impliquésdans les allergies médicamenteuses au niveau des lymphocytes T et des cellules dendritiqueset de développer des tests de prédiction du " potentiel allergique " des médicaments, afinde mieux prédire les allergies médicamenteuses lors du développement des médicaments.