O consumo lícito e ilícito de derivados anfetamínicos tem aumentado significativamente nos últimos anos, acentuando a necessidade de métodos analíticos adequados para a determinação dessas substâncias pelos laboratórios de toxicologia forense. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de métodos cromatográficos para a análise simultânea de anfepramona (DEP), femproporex (FEM), metilfenidato (MPH), 4-bromo-2,5-dimetoxi-anfetamina (DOB) e 4-bromo-2,5-dimetoxi-fenetilamina (2-CB) em amostras não-biológicas. Foram desenvolvidos métodos de detecção por cromatografia a gás com detector de ionização de chama (CG/DIC), de confirmação por cromatografia a gás com detector de espectrometria de massas (CG/EM) e de detecção e quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta (CLAE/UV). Os derivados anfetamínicos estudados foram identificados e quantificados simultaneamente através do método CLAE/UV utilizando uma coluna C-18, comprimento de onda 206 nm e modo isocrático. DEP, FEM, MPH e DOB foram detectados simultaneamente por CG/DIC e CG/EM utilizando colunas capilares, sem derivatização e com um tempo de corrida inferior a 10 minutos. Os métodos desenvolvidos foram validados através da avaliação dos parâmetros de linearidade, especificidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Os métodos desenvolvidos são de fácil execução, rápidos e adequados para a utilização na rotina laboratorial. / The consumption of both licit and illicit amphetamine derivatives has grown increasingly in recent years, emphasizing the need for analytical methods suitable for identification and quantification of these substances by forensic toxicology laboratories. This aim of this work was to develop and validate methods for the simultaneous chromatographic analysis of amfepramone (diethylpropione, DEP), fenproporex (FEM), methylphenidate (MPH), 4-bromo-2,5-dimethoxyamphetamine (DOB), and 4-bromo-2,5 dimethoxyphenetylamine (2-CB) in non-biological samples. Methods of detection by gas chromatography with flame ionization detector, (GC/FID), confirmation by gas chromatography with mass spectrometry detection (GC/MS), and detection and quantification by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC/UV) were developed. The amphetamine derivatives studied were identified and quantified simultaneously by HPLC/UV using a RP-C18, 206 nm wavelength and isocratic conditions. DEP, FEM, MPH and DOB were detected both by GC/FID and GC/MS using capillary columns, without derivatization and running times lower than 10 minutes. The validation parameters accessed were linearity, specificity, precision, accuracy, limit of detection, limit of quantification and robustness. The developed methods are easy to implement, fast and suitable for use in routine laboratory analysis.

O presente estudo teve como objetivos: determinar o teor dos polifenóis: flavonóides e antocianos totais presentes nos extratos de mirtilo (Vaccinium ashei) e amora preta (Rubus sp) por espectrofotometria; desenvolver e validar uma metodologia analítica para a caracterização dos extratos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), identificar, isolar e quantificar os principais compostos; avaliar a atividade anticolinesterásica, antioxidante frente à difenilpicrilhidrazol (DPPH) e anti-quimiotática in vitro; realizar a dosagem de aminas biogênicas no cérebro, investigar as possíveis atividades antinociceptiva, antiinflamatória, antiepiléptica, cognitiva e neuroprotetora do extrato de Vaccinium ashei, e o efeito neuroprotetor de um composto isolado a partir de Rubus: a cianidina, em vários modelos experimentais in vivo, em ratos e camundongos. Os perfis cromatográficos apresentaram compostos comuns às duas amostras; onde foram identificados 4 flavonóides, sendo hiperosídeo, quercitrina e isoquercitrina comuns a ambos extratos, e a rutina confirmada apenas em Rubus. Cinco antocianidinas foram identificadas em Vaccinium: delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina e malvidina, e a cianidina em Rubus. Os resultados demonstraram, diferenças nas quantidades totais de polifenóis, flavonóides e antocianos. Todos os extratos, apresentaram atividade seqüestradora do radical DPPH in vitro. A atividade antiquimiotática in vitro foi comprovada para a fração flavonoídica. Os ensaios biológicos realizados in vivo demonstraram que o extrato preparado a partir de uma mistura de diferentes cultivares de Vaccinium ashei apresentou efeitos antinociceptivos nos testes da formalina sub-plantar, contorções abdominais, placa quente e tail flick. Produziu também efeito neuroprotetor, avaliado pelo ensaio cometa e pelo método de TOSC. Também causou aumento da atividade locomotora, assim como exerceu um efeito ansiolítico em roedores adultos. Facilitou a memória de curta duração e a Memória de longa duração e produziu um aumento de 5-HT no estriado e hipocampo de ratos adultos. Foi observado também que a cianidina isolada exerceu atividade neuroprotetora conforme avaliado pelo método de TOSC em ratos adultos. Não foram observadas diferenças significativas no modelo de epilepsia, entre o grupo tratado e o grupo controle, assim como não foram detectadas alterações no sistema dopaminérgico. Em síntese, os dados analisados em conjunto, permitem sugerir que o extrato de Vaccinium ashei e compostos isolados a partir de Rubus sp., como a cianidina, apresentam importante efeito neuroprotetivo, antinociceptivo e cognitivo, e nesta ação está envolvida a participação direta ou indireta dos receptores serotonérgico, acetilcolinérgicos, opióides e de citocinas pró-inflamatórias. Neste sentido, foram obtidos avanços significativos acerca dos mecanismos de ação de ambos gêneros o que torna o seu extrato e seus princípios ativos interessantes para o aproveitamento e desenvolvimento de novos alimentos funcionais e/ou nutracêuticos. / The objectives of this study were: comparing total phenolics, total anthocyanins and antioxidant capacity in appropriate berry samples from selected cultivars of the Vaccinium ashei and Rubus. A reliable HPLC procedure for determining the profile, quantifying and isolating of major compounds present in the extracts have been developed. The potential effects of the extracts were observed by chemotaxis assay, by acetilcholinesterasic inhibition, and their antioxidant properties evaluated using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) in vitro. Otherwise, we examined the antinociceptive, antiinflammatory, cognitive, anti-epileptic and neuroprotective effects of the extract of Vaccinium ashei in several experimental models in vivo, as well as biogenic amine concentration, in specific brain regions in rats and mice. In addition, it was tested the efficacy of oral administration of cyanidin-3-glucoside extracted from Rubus sp. in lipid peroxidation in brain rats (TOSC). An HPLC method for the analysis of anthocyanidins and flavonoids in berries extracts have been developed. The data obtained show that various compounds are common in the fruits analyzed, and four flavonoids were identified: hyperoside, quercetrin and isoquercitrin occurring in both fruits, and rutin occurring only in Rubus. Five anthocyanidins were identified in Vaccinium: delphinidin, cyanidin, peonidin, petunidin, and malvidin, and in Rubus cyanidin 3-glucoside was the major anthocyanin. We found that the flavonoids fractions significantly have inhibited migration celullar and acetilcholynestarase, and both total extract and fractions exhibited strong antioxidant activity. The extract (a mixture from the different cultivars) significantly enhanced short and long-term memory in the inhibitory avoidance task, induced an increase in the number of crossings during open field habituation, and had an anxiolytic effect in the elevated plus-maze task. These processes are accompanied by alterations in serotonin (5-HT) in the striatum, and the hippocampus. Cyanidin 3-glucoside isolated significantly reduced lipid peroxidation in hippocampal tissue in rats. In conclusion, the data from the current study show that the Vaccinum extract produce an important neuroprotective, cognitive and antinociceptive effect, which could be related with a direct or indirect interaction with the serotonergic, cholinergic, opioids receptors and pro-inflammatory cytokines. On the other hand, the extract don’t have protected the pentilenotetrazole-induced convulsions in mice, or influenced the memory retention in old rats when accessed in the step-down inhibitory avoidance, and showed no anxiolytic action in an elevated plus maze. The Vaccinium ashei extract did not alter locomotor activity, and the dopamine concentration in adult or old rats.

Um método confiável e eficiente por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido para o controle de qualidade de extratos de P. incarnata. O método desenvolvido inclui uma estratégia original para identificação preliminar da espécie e operação simples baseada no modo de eluição isocrático. Este método foi validado para os flavonoides C-glicosilados vitexina e isovitexina, considerados marcadores da espécie e, aplicado na análise qualitativa e quantitativa de quatorze formulações comerciais com insumo vegetal composto exclusivamente de P. incarnata As análises foram realizadas com uma coluna C18 e à temperatura ambiente. Os comprimentos de onda de detecção foram 330 (vitexina e isovitexina) e 254 nm (rutina, marcador de contaminação). O método analítico foi linear para vitexina no intervalo de 5 - 40 ug/mL e para isovitexina no intervalo 5 - 60 ug/mL. Das quatorze amostras analisadas, oito eram em forma farmacêutica líquida (FFL) e seis em forma farmacêutica sólida (FFS). Seis amostras comerciais em FFL e seis amostras em FFS apresentaram perfil compatível com P. incarnata. As concentrações obtidas para as FFL foram vitexina 17,87 - 29,13 ug/mL e isovitexina 27,47 - 65,07 ug/mL, respectivamente. As FFS apresentaram concentração de vitexina entre 10,0 - 32,26 ug/mL e isovitexina 36,16 - 100,83 ug/mL. O método demonstrou ser confiável e eficiente para análise qualitativa e quantitativa de vitexina e isovitexina nos extratos; por esta razão foi considerado viável para a prática diária do controle de qualidade. A análise por cromatografia de líquida de alta eficiência acoplada com detector de espectroscopia de massas (CLAE-EM) foi realizada para investigar os principais fitoconstituintes, sete picos do extrato puderam ser resolvidos; e, forneceram fortes evidências sobre a composição química do extrato de P. incarnata. / A reliable and efficient method of high-performance liquid chromatography was developed for the quality control of Passiflora incarnata extracts. The quality control includes an original preliminary identification of this species and simple operation process based on isocratic elution. This method was validated for vitexin and isovitexin, C-glycoside flavonoids, considered markers of this species and applied to qualitative and quantitative analysis of fourteen commercial herbal medicines of P. incarnata extracts. Analysis was achieved on reversed-phase C18 column at ambient temperature. The wavelengths used for detection were 330 nm (vitexin and isovitexin) and 254 nm (rutin, a marker of contamination). Method was linear over vitexin concentration range of 540 g/mL and isovitexin 560 g/mL. Among of fourteen samples, eight were in liquid dosage form (LDF) and six in solid dosage form (SDF). Six commercial samples in LDF and six samples in SDF showed profile compatible with P. incarnata. Concentrations were determined for LDF vitexin 17.87  29.13 g/mL and isovitexin 27.47  65.07 g/mL. While SDF samples showed vitexin concentration range 10.00  32.26 g/mL and isovitexin 36.16  100.83 g/mL. The method demonstrated to be reliable and efficient for assay and qualitative analysis of vitexin and isovitexin in P. incarnata extracts; for that reason for practical application on quality control. Analysis were performed through high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometer detector (LC/MS) to investigate the main phytoconstituents, seven peaks from P. incarnata extract could be resolved; and provided strong evidences about the chemical composition of extracts.

Hoy en día, las técnicas espectrométricas basadas en plasma de acoplamiento inductivo están reemplazando progresivamente a otras técnicas anteriores para el análisis elemental de rutina. Esta categoría incluye la espectrometría de emisión óptica por plasma de acoplamiento inductivo (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry, ICP OES) y la espectrometría de masas por plasma de acoplamiento inductivo (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS). De hecho, el uso de estas técnicas es muy recomendable para la determinación de elementos a niveles traza y ultratraza en muestras de matriz compleja. A pesar de ser cada vez más interesantes en el análisis químico, ambas técnicas presentan todavía ciertas limitaciones cuando se aplican al análisis de este tipo de muestras. La determinación del analito en este caso es especialmente complicada cuando se encuentra a niveles de concentración traza o inferiores. En primer lugar, una importante limitación de las técnicas basadas en plasma (i.e., ICP OES e ICP-MS) radica en la baja eficiencia de transporte de los sistemas de introducción de muestras líquidas convencionales. Su función es transferir una parte representativa de la muestra al plasma. Para ello, estos sistemas incorporan un nebulizador que transforma la muestra líquida en un aerosol. Posteriormente, el aerosol es transportado hasta el plasma por medio de una corriente de gas. Sin embargo, el porcentaje del aerosol que finalmente llega al plasma es muy bajo. Por lo tanto, una forma de mejorar los parámetros analíticos de calidad es aumentar la eficiencia de transporte del analito al plasma. Por otro lado, un cambio en las propiedades físicas de la muestra modifica la distribución de tamaño de gota del aerosol de la muestra, provocando un cambio en la eficiencia de transporte. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se nebuliza una muestra con matriz orgánica. En segundo lugar, otra limitación significativa proviene de las interferencias causadas por las especies concomitantes en la matriz de la muestra. En la mayoría de los casos, la complejidad de la matriz de la muestra interfiere en el análisis y, por tanto, afecta a la calidad de los resultados obtenidos. Los efectos de la matriz pueden eliminarse, o al menos minimizarse, utilizando una metodología de calibración apropiada en el análisis. Sin embargo, las metodologías que se utilizan habitualmente para reducir los efectos de la matriz son lentas, tediosas y consumen un gran volumen de reactivos y de muestra. Una alternativa muy prometedora para eliminar, o al menos reducir, las mencionadas limitaciones de forma práctica y económica es la utilización de sistemas de nebulización múltiples, que permiten la introducción simultánea de varias corrientes líquidas. Estos sistemas no solo presentan una tecnología de nebulización altamente eficiente en términos de la generación del aerosol, sino que suponen un avance hacia la automatización dado que permiten realizar mezclas y/o reacciones químicas en línea. Como resultado de estas características, los sistemas de multinebulización son muy interesantes para múltiples aplicaciones, siendo la más extendida la generación de vapor químico. Esta metodología consiste en transformar el analito en fase gas para aumentar su transferencia al plasma. También es interesante para la reducción de los efectos de la matriz mediante metodologías de calibración en línea, que son más rápidas, simples y económicas que las metodologías convencionales. Una última limitación general del análisis de muestras de matriz compleja, independientemente de la técnica utilizada, es la escasez de materiales de referencia certificados que reproduzcan de forma aproximada las condiciones de la muestra que se va a analizar, de modo que resulten una referencia fiable. En resumen, el principal objetivo de esta tesis es mejorar la capacidad analítica de las técnicas basadas en plasma de acoplamiento inductivo (ICP OES e ICP-MS) y simplificar el proceso analítico en el análisis elemental de muestras con matriz compleja. Esto se consigue mediante el desarrollo y aplicación de metodologías analíticas basadas en el uso de sistemas de nebulización múltiple.

[pt] O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de métodosespectrofluorimétricos e de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa(RP-HPLC, reversed-phase liquid chromatography) para análise de óleosessenciais cítricos (OEC). Para este fim, microemulsões livres de surfactante(SFMEs, surfactante-free microemulsions) foram utilizadas como uma abordagempara o tratamento das amostras.Primeiramente, a região de formação das SFMEs foi avaliada para diferentesproporções água:OE (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, m/m) na presença de propano-1-ol eoctan-1-ol (10:3 m/m). Titulações condutométricas indicaram agregados micelarescontendo OE (microemulsão do tipo óleo-em-água) para a proporção 4:1 (compartículas dispersas de raio hidrodinâmico de 95,7 ± 5,3 nm). Nessas condições, afluorescência aumentou, permitindo o uso da espectroscopia de fluorescência 3Dpara obtenção de padrões de impressão digital que foram utilizados para análisediscriminante de nove marcas brasileiras, juntamente com análise de componentes principais com desdobramento dos dados (UPCA, unfold principal components analysis). Uma variância cumulativa de 96,7 por cento foi obtida para os três primeiros componentes principais e os gráficos de pontuação mostraram uma localização distinta para cada grupo. Um estudo preliminar também mostrou a capacidade desses sistemas em avaliar condições de armazenamento e adulteração. O impacto das condições de armazenamento foi realizado ao longo de 21 dias expostos à luz, com resultados mostrando grandes diferenças espectrais em comparação com uma amostra armazenada em frasco âmbar a 22 graus C. A adulteração de OEs por fortificação com óleo de canola e óleo mineral foi detectada em diferentes níveis (1, 5, 10 e 20 por cento, m/m) e, além das diferenças espectrais, observou-se uma mudança na estabilidade da micro emulsão. Em uma segunda etapa do estudo, esses sistemas foram replicados para diferentes OEC, incluindo laranja doce e azeda, tangerina, limão e grape fruit. Estudos foram empregados para avaliar condições ótimas para a formação do sistema, visando abranger todos os OECs avaliados sem comprometer a reprodutibilidade da medição. A nova condição SFME adotada foi de 15 microL da fase oleosa contendo OE e octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL de água e propan-1-ol até o volume final de 25 mL. Além do baixo consumo de amostra, obteve-se um aumento significativo na fluorescência, apesar da menor proporção da fase oleosa. Os dados da matriz de excitação-emissão foram utilizados para análise de agrupamento. OUPCA foi aplicado com sucesso, com uma variância cumulativa de 99,5 por cento para os três primeiros componentes principais. A decomposição dos auto vetores revelou uma influência significativa dos comprimentos de onda de excitação/emissão de336/436 nm. Análises complementares por HPLC confirmaram a relação entre fluoróforos e a fração não volátil, característica dos OECs. A combinação de baixo consumo de amostra e alto teor de água torna a aplicação desses sistemas vantajosa para a diferenciação de OECs. A transparência e a baixa viscosidade também são consideradas aspectos positivos. Em uma terceira e última etapa, o efeito do meio de amostragem na análise de polimetoxiflavo nas (PMFs) no OE de laranja doce por RP-HPLC foi avaliado, utilizando o conhecimento adquirido nas etapas anteriores em relação à formação de sistemas SFMEs. Este estudo teve como foco a análise de PMFs presentes na fração não volátil do OE de laranja doce, que inclui tetra-O-metil-scutelareína, sinensetina, tangeretina, nobiletina e heptametoxiflavona. Dois métodos utilizando eluição isocrática com diferentes fases móveis, (A) água/metanol e (B)água/acetonitrila, foram empregados usando detecção absorciométrica e fluorimétrica. O meio de amostragem influenciou significativamente a eluição cromatográfica, afetando potencialmente a largura dos picos e o tempo de retenção, especialmente para tangeretina, onde um aumento de 300 e 103 por cento na intensidade de pico foi obtido para as fases móveis A e B, quando misturas com octan-1-ol foram utilizadas. Devido à coeluição entre nobiletina e tetra-O-metil scutelareína observada com a fase móvel A, o método foi validado utilizando a fase móvel B(acetonitrila/água, 50:50 por cento, v/v). A detecção de fluorescência forneceu valores delimites de detecção e quantificação mais baixos para sinensetina (1 e 3 microg mL-1) enobiletina (13 e 44 microg mL-1) do que os relatados na literatura. O método foi aplicado a amostras comerciais de OE de laranja doce, fornecendo resultados consistentes para todas as PMFs. / [en] The main goal of this work was the development of spectrofluorimetric and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) methods for citrus essential oils (CEO) analysis. For this purpose, surfactant-free microemulsions (SFMEs) were used as an approach for sample treatment. First, the SFME formation region was studied at different water:EO weight proportions (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 w/w) in the presence of propan-1-ol and octan-1-ol (10:3 w/w). Conductometric titrations indicated micellar aggregates containing EO (oil-in-water microemulsion) for the 4:1 proportion (droplets of hydrodynamic radius of 95.7 ± 5.3 nm). In such conditions, fluorescence increased allowing the use of 3D fluorescence spectroscopy to obtain spectroscopic fingerprint pattern that was used aiming discriminant analysis, considering nine EO Brazilian brands, along with unfold principal component analysis(UPCA). A cumulative variance of 96.7 percent was obtained for the first three principal components and score plots showed distinct location for each group. Preliminary study showed the capability of these systems in evaluating storage conditions, and adulteration. The impact of storage conditions was made over 21 days exposed to light with results showing large spectral differences compared to a sample stored in amber flask at 22 degrees C. Adulteration of EOs by canola and mineral oil fortification was detected at different levels (1, 5, 10 and 20 percent, w/w) and, in addition to the spectral differences, a change in microemulsion stability was observed. In a second stage of the study, these systems were replicated for different CEOs, including sweet and sour orange, tangerine, lemon, and grapefruit. Studies were employed to assess optimal conditions for system formation, aiming to encompass all evaluated CEOs without compromising measurement reproducibility. The new SFME condition adopted was 15 microL of the oily phase containing EO and octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL of water, and propan-1-ol up to the 25 mL final volume. In addition to low sample consumption, a significant increase in fluorescence was achieved, despite the lower proportion of the oily phase. Excitation-emission matrix data were utilized for clustering analysis. UPCA was successfully applied, with cumulative variance of 99.5 percent for the first three principal components. Eigenvectors decomposition revealed a significant influence of the 336/436 nm excitation/emission wavelengths. Complementary analyses by HPLC confirm the relationship between fluorophores and the non-volatile fraction, characteristic of CEOs. The combination of low sample consumption and high-water content makes the application of these systems advantageous for CEO differentiation. Transparency and low viscosity are also considered positive aspects. In a third and final stage, the effect of the sampling medium on the analysis of polymethoxyflavones (PMFs) in sweet orange EO by RP-HPLC was evaluated, utilizing the knowledge acquired in previous stages regarding the formation of SFME systems. This study was focused on analyzing PMFs present in the non-volatile fraction of sweet orange EO, which includes tetra-O-methyl-scutellarein, sinensetin, tangeretin, nobiletin, and heptamethoxyflavone. Two methods utilizing isocratic elution with different mobile phases, (A) water/methanol and (B) water/acetonitrile, were employed using absorciometric and fluorimetric detection. The sampling medium significantly influenced chromatographic elution, potentially affecting peak width and retention time, especially for tangeretin, where a 300 percent and 103 percent increase in peak intensity was obtained for mobile phases A and B, respectively, when mixtures with octan-1-ol were used. Due to co-elution between nobiletin and tetra-O-methyl scutelarein observed with mobile phase A, the method was validated using mobile phase B (acetonitrile and water 50:50 percent, v/v). Fluorescence detection provided lower LOD and LOQ values for sinensetin (1 and 3 microg mL -1 ) and nobiletin (13 and 44 microg mL -1 ) than reported in the literature. The method was applied to commercial sweet orange EOs samples, yielding consistent results for all PMFs.

O pró-fármaco olmesartana medoxomila (OLM) é um anti-hipertensivo representante da classe dos bloqueadores seletivos dos receptores da angiotensina II (BRA). No Brasil, encontra-se disponível sob a forma de comprimidos revestidos (Benicar®). Foi aprovado pelo FDA em 2002. Não existe monografia disponível para este fármaco em nenhum código oficial. Desse modo, este trabalho objetivou o desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação da OLM na substância química de referência (SQR) e forma farmacêutica, estabelecer a cinética de dissolução in vitro para os comprimidos revestidos deste fármaco e por fim investigar a presença de diferentes estruturas polimórficas da SQR deste anti-hipertensivo. A determinação da faixa de fusão, a espectrofotometria na região do infravermelho (IV), assim como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C permitiram a identificação da SQR. Os métodos por espectrofotometria na região do ultravioleta (UV), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) e cromatografia capilar eletrocinética micelar (MECC) foram utilizados para análise qualitativa do fármaco no produto acabado. A determinação quantitativa foi realizada através do desenvolvimento e validação de método indicativo da estabilidade por CLAE e MECC, avaliando-se os parâmetros descritos pelas guias de validação como: especificidade, robustez, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão. Determinou-se ainda, a intercambialidade dos mesmos, através de análise estatística por ANOVA (p = 0,05), e comprovou-se que ambos podem ser utilizados para análise qualitativa e quantitativa da OLM em matéria-prima e produto acabado. O teste de dissolução foi desenvolvido e validado de acordo com o guia proposto pelo USP Fórum, utilizando como meio de dissolução 900 ml de uma solução a 0,5% (p/V) de lauril sulfato de sódio pH 6,8, a 37 ± 0,5 °C, pás a 50 rpm e quantificação por CLAE e espectrofotometria na região do UV. A análise do teor de OLM dissolvida, realizada por ambos os métodos, não apresentou diferença estatística (p > 0,05). Os perfis de dissolução do Benicar®, medicamento referência, e do Olmetec®, outra formulação disponível no mercado, foram considerados semelhantes, após aplicação do método modelo-independente (f1 e f2) e eficiência de dissolução. Avaliou-se, também, a cinética de dissolução de ambas as formulações através da aplicação de métodos modelo-dependentes. Os perfis de dissolução do Benicar® e Ometec® foram descritos pelos modelos propostos por Hixson-Crowell e de ordem zero, respectivamente. Os valores calculados para t50% e t80%, obtidos através da aplicação da equação de ordem zero, foram semelhantes aos valores experimentais encontrados no perfil de dissolução de ambos os produtos. As técnicas de espectrofotometria por reflexão difusa no IV com transformada de Fourier (ATRFTIR), difração de raios-X de pó (XRPD), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) permitiram a identificação de uma forma amorfa e outra polimórfica da SQR da OLM, diferentes daquela descrita na literatura. Logo, de acordo com os resultados obtidos, todos os métodos propostos podem ser utilizados para no controle de qualidade da OLM em SQR e produto acabado. / The prodrug olmesartan medoxomil (OLM) is a selective angiotensin II receptor blocker (ARB). In Brazil, it is available as coated tablets (Benicar®). It was approved by FDA in 2002. There is no monograph available for this drug in any official code. According to this, the main purpose of this study was to develop a quality control analytical methodology for OLM in bulk material and dosage form, to establish in vitro dissolution kinetic for OLM coated tablets, and to investigate the crystalline behavior of OLM bulk material. The investigation of melting range and application of techniques such as infrared spectrophotometry (IR), as well as the 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were used to identify OLM. Ultraviolet (UV) spectrophotometry, thin-layer chromatography (TLC), highperformance liquid chromatography (LC) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were used for qualitative analysis of the drug in coated tablets. The quantitative determination was carried out through the development and validation of a stability-indicating LC and MEKC methods, evaluating the parameters described in the guidelines such as: specificity, robustness, linearity, detection and quantitation limits, precision, and accuracy. The results were compared statistically by ANOVA (p = 0.05), and no difference was found between them for both bulk material and coated tablets. A dissolution test was developed and validated according to the guideline proposed by the USP Forum, using 900 ml of dissolution medium containing 0.5% of sodium lauryl sulfate (w/V) pH 6.8, at 37 ± 0.5 °C, paddle at 50 rpm, and quantitation by LC and UV spectrophotometry. The resulting dissolution profiles did not show statistical difference (p > 0.05) between methods. The dissolution profiles of Benicar®, reference formulation, and Olmetec®, another commercial formulation available, were considered similar, using model independent (f1, f2, and dissolution efficiency) methods. The dissolution kinetic of both formulations, using model dependent approaches, revealed that Benicar® followed the Hixson-Crowell model, while Olmetec® the zero-order model. The calculated values of t50% and t80%, obtained from zero-order equation, were similar of experimental values found in the dissolution profile for both products. The attenuated total reflectance Fourier transformed infrared (ATR-FTIR) spectrophotometry, along with differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), X-ray powder diffraction (XRPD), and scanning electron microscopy (SEM) allowed to identify one amorphous and other polymorphic forms of OLM. According to the obtained results, all proposed methods could be used in the quality control of OLM bulk material and coated tablets.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

O chá-verde brasileiro, obtido a partir das partes aéreas de Camellia sinensis var. assamica, teve sua produção recentemente implantada no Brasil devido ao emergente consumo. As principais atividades farmacológicas atribuídas a esta planta estão relacionadas à atividade antioxidante, quimiopreventiva e antitumoral. Neste trabalho foi desenvo lvido e validado método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para avaliar o perfil dos constituintes majoritários [galato de epigalocatequina (EGCG), epigalocatequina, cafeína, galato de epicatequina (ECG) e epicatequina] do chá-verde brasileiro coletado na primavera e verão, e utilizando diferentes sistemas de extração. A resposta foi linear na faixa de 37-185 μg/ml para cafeína, 99-500 μg/ml para EGC, 20-100 μg/ml para catequina, 30-150 μg/ml para epicatequina, 150-800 μg/ml para EGCG, 20-105 μg/ml para galato de galocatequina e 40-205 μg/ml para ECG (r > 0,9999 para todos os compostos). Foi, também, avaliada a atividade antioxidante in vitro através do método fotocolorimétrico do DPPH· e do método enzimático da hipoxantina/xantina oxidase. Todos os sistemas de extração testados e seus respectivos extratos liofilizados apresentaram rendimento superior a 30%, sendo que o melhor sistema teve rendimento médio de 36,29%, e se mostrando mais eficiente na extração de EGCG e ECG. As amostras do verão apresentaram melhor atividade antioxidante em comparação às da primavera. Os teores dos componentes ECG e EGCG foram os únicos que correlacionaram com a atividade antioxidante in vitro (DPPH·). A análise estatística não mostrou diferença significativa (a = 0,05) nos teores de catequinas totais entre as estações primavera e verão. / The Brazilian green tea, produced from Camellia sinenis var. assamica, have been cultivated in Brazil recently because the rise at its consumption. The main pharmacological activities attributed to this plant are related to antioxidant activity as chemopreventive and anti-cancer agent. Herein, a new HPLC method was developed and validated to evaluate the profile of the major Brazilian green tea constituents [epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin, caffeine, epicatechin gallate (ECG) and epicatechin] between spring and summer, using different extraction systems. The response was linear over a range of 37-185 μg.mL-1 for caffeine, 99-500 μg.mL-1 for epigallocatechin, 20-100 μg.mL-1 for catechin, 30-150 μg.mL-1 for epicatechin, 150-800 μg.mL-1 for EGCG, 20-105 μg.mL-1 for gallocatechin gallate and 40- 205 μg.mL-1 for ECG (r > 0.9999 for all compounds). Likewise, the in vitro antioxidant activity was evaluated using DPPH· assay and hipoxanthine/xanthine oxidase assay. The extractors systems to produce the freeze-drying extract had presented yield up of 30%. The best system an average yield of 36.26% showed more efficient to extract EGCG and ECG. The summer samples presented better antioxidant activity when compared with spring samples. Only ECG and EGCG contents presented correlation with in vitro antioxidant activity (DPPH· assay). The statistic analysis did not show significant difference (a = 0.05) in total catechin content between spring and summer seasons.

O pró-fármaco olmesartana medoxomila (OLM) é um anti-hipertensivo representante da classe dos bloqueadores seletivos dos receptores da angiotensina II (BRA). No Brasil, encontra-se disponível sob a forma de comprimidos revestidos (Benicar®). Foi aprovado pelo FDA em 2002. Não existe monografia disponível para este fármaco em nenhum código oficial. Desse modo, este trabalho objetivou o desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação da OLM na substância química de referência (SQR) e forma farmacêutica, estabelecer a cinética de dissolução in vitro para os comprimidos revestidos deste fármaco e por fim investigar a presença de diferentes estruturas polimórficas da SQR deste anti-hipertensivo. A determinação da faixa de fusão, a espectrofotometria na região do infravermelho (IV), assim como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C permitiram a identificação da SQR. Os métodos por espectrofotometria na região do ultravioleta (UV), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) e cromatografia capilar eletrocinética micelar (MECC) foram utilizados para análise qualitativa do fármaco no produto acabado. A determinação quantitativa foi realizada através do desenvolvimento e validação de método indicativo da estabilidade por CLAE e MECC, avaliando-se os parâmetros descritos pelas guias de validação como: especificidade, robustez, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão. Determinou-se ainda, a intercambialidade dos mesmos, através de análise estatística por ANOVA (p = 0,05), e comprovou-se que ambos podem ser utilizados para análise qualitativa e quantitativa da OLM em matéria-prima e produto acabado. O teste de dissolução foi desenvolvido e validado de acordo com o guia proposto pelo USP Fórum, utilizando como meio de dissolução 900 ml de uma solução a 0,5% (p/V) de lauril sulfato de sódio pH 6,8, a 37 ± 0,5 °C, pás a 50 rpm e quantificação por CLAE e espectrofotometria na região do UV. A análise do teor de OLM dissolvida, realizada por ambos os métodos, não apresentou diferença estatística (p > 0,05). Os perfis de dissolução do Benicar®, medicamento referência, e do Olmetec®, outra formulação disponível no mercado, foram considerados semelhantes, após aplicação do método modelo-independente (f1 e f2) e eficiência de dissolução. Avaliou-se, também, a cinética de dissolução de ambas as formulações através da aplicação de métodos modelo-dependentes. Os perfis de dissolução do Benicar® e Ometec® foram descritos pelos modelos propostos por Hixson-Crowell e de ordem zero, respectivamente. Os valores calculados para t50% e t80%, obtidos através da aplicação da equação de ordem zero, foram semelhantes aos valores experimentais encontrados no perfil de dissolução de ambos os produtos. As técnicas de espectrofotometria por reflexão difusa no IV com transformada de Fourier (ATRFTIR), difração de raios-X de pó (XRPD), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) permitiram a identificação de uma forma amorfa e outra polimórfica da SQR da OLM, diferentes daquela descrita na literatura. Logo, de acordo com os resultados obtidos, todos os métodos propostos podem ser utilizados para no controle de qualidade da OLM em SQR e produto acabado. / The prodrug olmesartan medoxomil (OLM) is a selective angiotensin II receptor blocker (ARB). In Brazil, it is available as coated tablets (Benicar®). It was approved by FDA in 2002. There is no monograph available for this drug in any official code. According to this, the main purpose of this study was to develop a quality control analytical methodology for OLM in bulk material and dosage form, to establish in vitro dissolution kinetic for OLM coated tablets, and to investigate the crystalline behavior of OLM bulk material. The investigation of melting range and application of techniques such as infrared spectrophotometry (IR), as well as the 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were used to identify OLM. Ultraviolet (UV) spectrophotometry, thin-layer chromatography (TLC), highperformance liquid chromatography (LC) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were used for qualitative analysis of the drug in coated tablets. The quantitative determination was carried out through the development and validation of a stability-indicating LC and MEKC methods, evaluating the parameters described in the guidelines such as: specificity, robustness, linearity, detection and quantitation limits, precision, and accuracy. The results were compared statistically by ANOVA (p = 0.05), and no difference was found between them for both bulk material and coated tablets. A dissolution test was developed and validated according to the guideline proposed by the USP Forum, using 900 ml of dissolution medium containing 0.5% of sodium lauryl sulfate (w/V) pH 6.8, at 37 ± 0.5 °C, paddle at 50 rpm, and quantitation by LC and UV spectrophotometry. The resulting dissolution profiles did not show statistical difference (p > 0.05) between methods. The dissolution profiles of Benicar®, reference formulation, and Olmetec®, another commercial formulation available, were considered similar, using model independent (f1, f2, and dissolution efficiency) methods. The dissolution kinetic of both formulations, using model dependent approaches, revealed that Benicar® followed the Hixson-Crowell model, while Olmetec® the zero-order model. The calculated values of t50% and t80%, obtained from zero-order equation, were similar of experimental values found in the dissolution profile for both products. The attenuated total reflectance Fourier transformed infrared (ATR-FTIR) spectrophotometry, along with differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), X-ray powder diffraction (XRPD), and scanning electron microscopy (SEM) allowed to identify one amorphous and other polymorphic forms of OLM. According to the obtained results, all proposed methods could be used in the quality control of OLM bulk material and coated tablets.

A análise de fármacos é fundamental nas diversas fases do desenvolvimento farmacêutico, tais como em estudos de formulação, estabilidade e controle de qualidade do produto. O mesilato de gemifloxacino (MGF), liberado para uso clínico no Brasil em novembro de 2006 com o nome comercial de Factive®, é uma fluorquinolona indicada para o tratamento da exacerbação aguda da bronquite crônica e da pneumonia adquirida da comunidade. A literatura pesquisada apresenta poucos relatos de determinação quantitativa e de estudos de estabilidade do fármaco em comprimidos revestidos. Anteriormente aos estudos, foi realizada a caracterização da substância química de referência (SQR) de MGF por espectrofotometria no infravermelho (E IV), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono (RMN 13C), análise térmica por calorimetria exploratória de varredura (DSC) e determinação da faixa de fusão. Métodos analíticos para determinação qualitativa e quantitativa foram desenvolvidos e validados por espectrofotometria na região do ultravioleta (E UV) e visível (E VIS), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), eletroforese capilar (EC) e ensaio microbiológico pelo método de cilindros em placas. A validação de um método de dissolução baseado em dados in vivo do fármaco também foi realizada. A elucidação do produto de degradação isolado em condições alcalinas foi realizada por E IV, RMN de 1H, 13C e correlação (COSY, HSQC e HMBC), espectrometria de massas (EM) e emissão atômica. Estudos de citotoxicidade, fototoxicidade, genotoxicidade e fotogenotoxicidade foram empregados para conhecimento da toxicidade dos produtos analisados. / The drug analysis is essential in all areas of the pharmaceutical development, such as during formulation studies, stability and quality control of the product. Gemifloxacin mesylate (GFM), approved for clinical use in Brazil in November of 2007 with the commercial name of Factive®, is a fluoroquinolone prescribed for the treatment of acute exacerbations of chronic bronchitis and community-acquired pneumonia. The research literature shows a few studies of quantitative determination and stabilities studies of the drug in coated tablets. Previously, it was performed the characterization of the reference chemical substance of GFM by infrared spectrometry (IR), nuclear magnetic resonance of 1H (1H NMR) and 13C (13C NMR), thermal analysis by differential scanning calorimetry (DSC) and determination of the melting range. Analytical methods for qualitative and quantitative determination were developed and validated by ultraviolet (UV) and visible (Vis) spectrophotometry, highperformance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE) and microbiological assay applying the cylinder–plate method. The validation of the dissolution method based on in vivo data of the GFM was also performed. The elucidation of the isolate degradation product in alkaline conditions was performed by IR, 1H, 13C and correlation (COSY, HSQC and HMBC) NMR, and mass spectrometry (MS). Cytotoxicity, phototoxicity, genotoxicity and photogenotoxicity studies were carried out for the toxicity knowledge of the analyzed products.