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Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture

Considered the most abundant carnivore in the world, the domestic dog can cause negative impacts when he is present in forested areas. Dogs can develop different roles in the environment in which they live as hunter, shepherd, guardian, companion and even more affective relationships in which the dog is seen like a family member. These roles are closely linked to the way of life of their owners. In Caraguatatuba City, dogs that live in the vicinity of Serra do Mar, an important Atlantic Rainforest Conservation Unit, are commonly parasitized by Amblyomma ovale. From data obtained through three years of monitoring in three different areas around the Serra do Mar State Park Caraguatatuba City, it has been possible to generate results that help in understanding the causes and consequences of the dog presence in the surroundings of the forest as well as its participation in the epidemiology of riquetsiosis and rangeliosis. Comparing the lifestyle of the owners and the role of their dogs in the environment in which they are inserted, it has been possible to estimate the risk of transmission of Rickettsia parkeri to these dogs. In addition, through the molecular analysis of the A. ovale individuals collected on dogs and also in free life, it has been possible to infer about the population structure and genetics of this parasite in Serra do Mar, which is an important ecological corridor for the Atlantic Rainforest wild fauna. / Considerado o carnívoro mais abundante do mundo, o cão doméstico pode causar impactos negativos quando presente em áreas florestadas. Cães podem desenvolver diferentes papéis no ambiente em que vivem desde caçador, pastor, guardião, companheiro e até mesmo relações mais afetivas em que o cão é visto como um membro da família. Estes papéis estão intimamente ligados ao modo de vida de seus proprietários. Em Caraguatatuba, cães que vivem no entorno da Serra do Mar, uma importante Unidade de Conservação da Mata Atlântica, são comumente parasitados por Amblyomma ovale. A partir de dados obtidos através de três anos de monitoramento em três diferentes áreas do entorno do Parque Estadual Serra do Mar Núcleo Caraguatatuba, foi possível gerar resultados que auxiliam no entendimento das causas e consequências da presença do cão no entorno da floresta e sua participação na epidemiologia da riquetsiose e rangeliose. Comparando o estilo de vida dos proprietários e o papel do cão no ambiente em que ele está inserido, foi possível estimar o risco de transmição de Rickettsia parkeri para estes cães. Além disso, através da análise molecular dos indivíduos de A. ovale coletados em cães e também coletados em vida livre, foi possível inferir sobre a estrutura e genética populacional deste parasita na Serra do Mar em Caraguatatuba, importante corredor ecológico para a fauna silvestre da Mata Atlântica.

Juntamente com o estágio larval, o estágio ninfal de carrapatos do gênero Amblyomma é o mais agressivo para seres humanos que adentram áreas habitadas por animais silvestres e alguns domésticos. No entanto, devido à inexistência de descrição morfológica do estágio ninfal de muitas das espécies de Amblyomma que ocorrem no Brasil, juntamente com a falta de uma chave taxonômica para esses carrapatos, muito pouco se sabe sobre a biologia e ecologia das ninfas de Amblyomma spp que parasitam humanos e animais no país. A grande maioria dos estudos tem se concentrado no estágio adulto de Amblyomma spp, por se tratar do único em que há descrições morfológicas e chave taxonômica para todas as espécies conhecidas. No presente estudo, a descrição morfológica do estágio ninfal, com características importantes ilustradas através da microscopia eletrônica de varredura, foi realizada para ninfas das seguintes 15 espécies de carrapatos do gênero Amblyomma que ocorrem no Brasil, para as quais o estágio ninfal permanecia sem descrição: Amblyomma aureolatum (Pallas, 1772), Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Amblyomma calcaratum Neumann, 1899, Amblyomma coelebs Neumann, 1899, Amblyomma fuscum Neumann, 1907, Amblyomma humerale Koch, 1844, Amblyomma incisum Neumann, 1906, Amblyomma latepunctatum Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma naponense (Packard, 1869), Amblyomma nodosum Neumann, 1899, Amblyomma ovale Koch, 1844, Amblyomma pacae Aragão, 1911, Amblyomma pseudoconcolor Aragão, 1908, Amblyomma scalpturatum Neumann, 1906, Amblyomma varium Koch, 1844. Em adição, o estágio ninfal das seguintes 12 espécies de Amblyomma, que haviam sido previamente descritas, foram redescritas: Amblyomma brasiliense Aragão, 1908, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787), Amblyomma dissimile Koch, 1844, Amblyomma dubitatum Neumann, 1899, Amblyomma longirostre (Koch, 1844), Amblyomma oblongoguttatum Koch, 1844, Amblyomma parkeri Fonseca e Aragão, 1952, Amblyomma parvum Aragão, 1908, Amblyomma romitii Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma rotundatum Koch, 1844, Amlyomma tigrinum Koch, 1844, Amblyomma triste Koch, 1844. As descrições e redescrições totalizaram 27 espécies, não contemplando apenas duas (Amblyomma geayi Neumann, 1899 e Amblyomma goeldii Neumann, 1899) das 29 espécies de Amblyomma que ocorrem de forma estabelecida no Brasil. As ninfas utilizadas para a descrição ou redescrição morfológica foram provenientes de colônias de laboratório, iniciadas com fêmeas adultas previamente identificadas e colhidas na natureza. A única exceção foi A. parkeri, que foi redescrita a partir de um único exemplar disponível em coleção. Para cada espécie, são apresentadas ilustrações obtidas através de microscopia eletrônica de varredura de pelo menos quatro regiões anatômicas dos carrapatos: capítulo dorsal, capítulo ventral, escudo dorsal e coxas I, II, III, IV. Por fim, foi construída uma chave dicotômica para auxílio na identificação taxonômica do estágio ninfal de 27 espécies de Amblyomma estabelecidas no Brasil. / Together with the larval stage, the nymphal stage of ticks of the genus Amblyomma are the most aggressive ticks for humans entering in areas inhabited by wild life and some domestic animals. However, due to the inexistence of morphological description of the nymphal stage of many Amblyomma species that occur in Brazil, together with the lack of a taxonomic key for these ticks, little or nothing is known about the biology and ecology of Amblyomma spp nymphs that parasitize humans and animals in the country. The great majority of the studies have concentrated in the tick adult stage, for which morphological descriptions and taxonomic keys are available for all known species. In the present study, the morphological description of the nymphal stage, illustrating important characters through scanning electron microscopy, was performed for nymphs of following 15 Amblyomma species that occur in Brazil, for which the nymphal stage had never been described: Amblyomma aureolatum (Pallas, 1772), Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Amblyomma calcaratum Neumann, 1899, Amblyomma coelebs Neumann, 1899, Amblyomma fuscum Neumann, 1907, Amblyomma humerale Koch, 1844, Amblyomma incisum Neumann, 1906, Amblyomma latepunctatum Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma naponense (Packard, 1869), Amblyomma nodosum Neumann, 1899, Amblyomma ovale Koch, 1844, Amblyomma pacae Aragão, 1911, Amblyomma pseudoconcolor Aragão, 1908, Amblyomma scalpturatum Neumann, 1906, Amblyomma varium Koch, 1844. In addition, the nymphal stage of the following 12 Amblyomma species, which had been previously described, were redescribed: Amblyomma brasiliense Aragão, 1908, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787), Amblyomma dissimile Koch, 1844, Amblyomma dubitatum Neumann, 1899, Amblyomma longirostre (Koch, 1844), Amblyomma oblongoguttatum Koch, 1844, Amblyomma parkeri Fonseca e Aragão, 1952, Amblyomma parvum Aragão, 1908, Amblyomma romitii Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma rotundatum Koch, 1844, Amblyomma tigrinum Koch, 1844, Amblyomma triste Koch, 1844. The descriptions and redescriptions totalized 27 species. Only two species (Amblyomma geayi Neumann, 1899 and Amblyomma goeldii Neumann, 1899) out of the 29 Amblyomma species established in Brazil were not included in the present study. Nymphal specimens used for morphological descriptions or redescriptions were derived from laboratory colonies that were started with field-collected adult ticks, previously identified to species. The only exception was A. parkeri, which was redescribed from a single nymphal specimen that was available in a tick collection. For each tick species, scanning electron microscopy-photographs are presented for at least four anatomic regions: dorsal capitulum, ventral capitulum, dorsal scutum, and coxae I, II, III, IV. Finally, a dichotomic key was constructed to support taxonomic identification of the nymphal stage of 27 Amblyomma species established in Brazil.

Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença causada por riquétsias do grupo da febre maculosa (RGFM) transmitidas por Amblyomma cajennense, é geralmente fatal quando não tratada precocemente. Métodos laboratoriais usuais (cultura em células Vero e RIFI) não permitem diagnósticos conclusivos da maioria dos casos verificados no Estado de São Paulo, onde o agente ainda não está devidamente caracterizado. Através da PCR e Southern blotting, foram pesquisados genes riquetsiais (gltA, ompA e ompB), em 20 amostras de coágulos sanguíneos humanos sintomáticos (São Paulo), 19 com resultados prévios negativos por métodos convencionais. Cerca de 95% dos pacientes foram positivos pela PCR. A seqüência de bases do gene ompB, a amostra 3, apresentou similaridade de 98% com Rickettsia ricketsii. Dos 75 lotes de A. cajennense (n=1483), coletados na mesma região endêmica, 09 resultaram positivos em células Vero e, em 22 detectou-se o gene ompA (RGFM). Sequenciamento e análise das amostras amplificadas poderão contribuir para o completo esclarecimento do ciclo das riquétsias na região. / Brazilian spotted fever (BSF), a disease caused by spotted fever group rickettsiae (SFGR) transmitted by Amblyomma cajennense, is generally fatal when not early treated. Common laboratory methods (Vero cell culture and immunofluorescence indirect assay) are not efficient on the diagnosis in most of the cases observed in State of São Paulo, where the agent is not well characterized yet. By means of PCR and Southern Blotting rickettsial genes (gltA, ompB and ompA) were searched in samples of coagulum sanguineous from 20 presenting symptom patients (São Paulo), from these, 19 of them have presented negative results by conventional methods. About 95% of the patients were positive and the ompB base pair sequences amplified showed 98% of similarity with Rickettsia ricketsii. From the 75 lots of A. cajennense (n=1483), collected at the same endemic region, 9 were positive in Vero cell cultures and in 22 it was possible to detect the ompA gene (SFGR). Sequencing and analysis of the amplified samples can contribute to the complete understanding of the rickettsiae biological cycle.

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

Própolis é uma substância resinosa produzida por Apis mellifera, contendo principalmente resinas vegetais e cera das próprias abelhas. É usada na colmeia para diversas finalidades, como vedar aberturas, reparar as células e envolver invasores que foram mortos na colméia, além de contribuir para a quase constância da temperatura dentro da colmeia (28 - 30oC). A própolis é importante para as abelhas, pois é responsável pela manutenção de um ambiente quase estéril, agindo contra bactérias, fungos e até larvas invasoras. Em virtude do amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas associadas a esse produto, a própolis vem sendo extensivamente utilizada em medicina alternativa, bem como na indústria cosmética e alimentícia. Apesar dos numerosos estudos já realizados com própolis, os poucos que foram feitos visando ao uso em veterinária relacionavam-se a combate de endoparasitas. Muitas doenças de animais vêm acometendo o homem atualmente, tais como as transmitidas pelos carrapato vermelho do cão (Rhipicephalus sanguineus) e carrapato-estrela (Amblyomma cajennense). Problemas de saúde para o gado e queda da produtividade pecuária é causada pelo carrapato do boi (Rhipicephalus microplus). Além disso, é crescente o interesse de profissionais veterinários pelo uso de produtos naturais, sobretudo em relação aos animais domésticos. Vale lembrar que o uso indiscriminado de acaricidas levou à seleção de carrapatos resistentes, de modo que outras estratégias para o controle dessas pragas são de grande importância. Com isso, o intuito do presente projeto foi a determinação da atividade de extratos brutos de própolis brasileira e seus constituintes no controle de carrapatos específicos e generalistas. Foram preparados extratos clorofórmicos de amostras de própolis verde de Lavras (MG) e própolis preta de Picos (PI), anteriormente analisadas quimicamente. Os extratos foram concentrados à secura e redissolvidos para administração a carrapatos mantidos em laboratório. Os ensaios com extratos brutos foram realizados in vitro para avaliar seu efeito nos artrópodos, empregando-se o teste de pacote de larvas. Foram realizados isolamentos biomonitorados, na tentativa de obtenção de substâncias ativas presentes nas própolis analisadas. O extrato bruto de Picos não revelou atividade acaricida. Por outro lado, o extrato bruto de Lavras mostrou-se bastante ativo e, então, foi fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica. As frações resultantes foram novamente avaliadas em ensaios in vitro em carrapatos. Novo fracionamento e novos bioensaios foram realizados, e foi identificada uma subfração com atividade acaricida. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidas e quatro substâncias majoritárias (ácido 2,2-dimetil-cromeno-6-propenoico-dicafeoil glucosídeo, artepilina-C, bacarina e ácido 2,2-dimetil-cromeno-8-prenil-6-propenoico) dessa subfração ativa foram isoladas em CLAE-preparativo. As substâncias obtidas foram identificadas por meio de análises espectroscópicas correntes em química de produtos naturais (IV, UV, massas e RMN). Por fim, novos bioensaios foram realizados com a espécie de carrapato mais suscetível, Rhipicephalus microplus, porém não se observou atividade acaricida significativa para as substâncias isoladas. Assim sendo, talvez a alta atividade acaricida constatada na subfração ativa seja decorrente do sinergismo entre substâncias. / Propolis is a resinous substance produced by bees Apis mellifera, containing mainly plant exudates and bee waxes. It is used in the hive to close holes, repair cells and involve intruders that are killed inside the hive. Propolis is important to the bees, as it is responsible for the maintenance of the hive as a sterile environment, acting against bacteria, fungus and even invading larvae. Because of the wide range of biological and pharmacological activities of propolis, it has been extensivelly used in alternative medicine, as well as in cosmetic and food industries. However, few studies have been developed concerning the use of propolis to animal health. Nowadays, many animal diseases have affected humans, such as those transmited by ticks, the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and the star tick (Amblyomma cajennense). Cattle health problems and decrease of livestock productivity is caused by the cattle tick (Rhipicephalus microplus). In addition, the interest of veterinary professionals toward the use of natural products to animal health is increasing, mainly for the treatment of domestic animals. It is worth remembering that the indiscriminate use of acaricides leads to resistence selection. Thus, new strategies are of great importance for tick control. Hence, the aim of this project was to determine the activity of crude extracts of Brazilian propolis and their constituents for the control of specific and generalist ticks. Chloroform extracts were prepared from samples of green propolis from Lavras (state of Minas Gerais) and black propolis from Picos (state of Piauí), previously analyzed chemically. The extracts were concentrated to dryness and redissolved for ticks administration in laboratory. The bioassays were carried out in vitro to verify the effectivness of the extracts using the larval package test. Bioassays-guided isolations were carried out to obtain active constituents presented in the studied samples. The crude extract of propolis sample from Picos did not show any acaricide activity. On the other hand, the sample propolis from Lavras showed high activity, and then was fractionated by colunm chromatography in silica gel. The fractions obtained were tested, and a subfraction with acaricide activity was obtained. Analyses by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed and four compounds (2,2-dimethyl-cromene-6-propenoic-dicafeoyl glucoside acid, artepillin-C, baccarin and 2,2-dimethyl-cromene-8-prenyl-6-propenoic acid) of the active subfraction were isolated using preparative HPLC. These compounds were identified by means of current spectroscopic analysis in chemistry of natural products (IR, UV, mass and NMR). Finally, new bioassays were carried out with the most susceptible tick specie, Rhipicephalus microplus, but no effect was observed testing the isolated compounds. Thus, probably the high acaricidal activity observed in the active subfraction was due to a synergism among the subfraction constituents.

Cultura de células de carrapatos, é uma ferramenta importante, para isolar e estudar os agentes de doenças transmissíveis. Amblyomma sculptum é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, o agente da febre maculosa. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar as células deste carrapato, além de testar seu potencial uso, como substrato para o crescimento e isolamento de patógenos. A partir de massas de ovos de A. sculptum, culturas primárias foram, preparadas em meio L-15B, subcultivadas ao atingirem a confluência necessária e criopreservadas em diversas passagens. A boa recuperação celular estabeleceu a linhagem IBU/ASE-16, a qual foi testada para, Rickettsia spp, Trypanosoma theileri e Leishmania infantum chagasi, obtendo-se bons resultados. A citometria de fluxo analisou a expressão de marcadores de células-tronco, proliferação, diferenciação e regulação do ciclo celular, nas IBU/ASE-16. O Δψm mostrou atividade das mitocôndrias e ausência de células inativas. A microscopia confocal, localizou estruturas celulares marcadas com fluorocromos, enquanto que a MEV,mostrou, junções intercelulares, matriz extracelular e redes neuronais. O teste de tumorigênese em camundongos Balb/c nu/nu, não resultou em crescimento de tumores. / Cell cultures of ticks are important tools to isolate and study agents of transmissible diseases. Amblyomma sculptum is the main vector of Rickettsia rickettsii, the agent for spotted fever. The aim of this study was to establish and characterize the cells of this tick, and test their potential use as a substrate for the growth and isolation of pathogens. From a egg masses of A. sculptum, primary cultures were prepared in L-15B medium, subcultured as they reached the necessary convergence and cryopreserved in several passages. The good cell recovery established IBU/ASE-16 lineage, which was tested for Rickettsia spp, Trypanosoma theileri and Leishmania infantum chagasi, yielding good results. Flow cytometry analyzed the expression of stem cell markers, proliferation, differentiation and regulation of the cell cycle, in the IBU/ASE-16 lineage. The Δψm showed activity of mitochondria and absence of inactive cells. Confocal microscopy located cell structures marked with fluorochromes, while MEV showed intercellular junctions, extracellular matrix and neural networks. Tumorigenesis tests in Balb/c nu/nu mice resulted in no tumor growth.