Foi conduzido um estudo sobre a ecologia da Febre Maculosa Brasileira, causada pela bactéria Rickettsia rickettsii, em uma área endêmica, no distrito de Taiaçupeba, Município de Mogi das Cruzes, SP. Para o melhor entendimento de quais animais silvestres são os hospedeiros das formas imaturas do carrapato vetor, Amblyomma aureolatum, foram capturados entre janeiro e dezembro de 2005, 243 animais silvestres em dois fragmentos de mata. Foram utilizadas estações de pitfall para captura de roedores e pequenos didelfídeos e armadilhas tomahawk para captura de Didelphis aurita, além da colocação de redes de neblina (14m x 3m cada) para captura de aves. Os animais foram sacrificados e tiveram sangue, baço e fígado extraídos. O baço de cada animal foi submetido a testes moleculares e bioensaios para pesquisa de bactérias do gênero Rickettsia. Os carrapatos capturados dos animais foram submetidos à identificação taxonômica morfológica ou molecular e à pesquisa de bactérias do gênero Rickettsia. Foram colhidos carrapatos dos gêneros Amblyomma, Haemaphysalis e Ixodes. Imaturos do carrapato Amblyomma aureolatum foram colhidos parasitando três indivíduos da espécie de Passeriforme Pyriglena leucoptera. Não foram encontrados exemplares desta espécie de carrapato parasitando roedores ou didelfídeos. Nenhum animal foi identificado sendo infectado por riquétsias, enquanto que três espécies de riquétsias, sendo duas do grupo da febre maculosa, foram identificadas infectando carrapatos das espécies Amblyomma longirostre, Ixodes aragaoi e Ixodes loricatus. Nenhum carrapato foi encontrado naturalmente infectado com a bactéria R. rickettsii. O estudo mostrou detalhes do ciclo de vida do carrapato A. aureolatum que podem auxiliar o entendimento do ciclo enzoótico da febre maculosa brasileira. / Brazilian Spotted Fever (BSF) is a tick-borne-disease caused by the bacterium Rickettsia rickettsii. An ecological study was conducted in a BSF-endemic area in Taiaçupeba County, Mogi das Cruzes Municipality, State of São Paulo. With the purpose to determine natural hosts of the immature stages of the tick vector Amblyomma aureolatum, a total of 243 wild animals were captured in two fragments of Atlantic Forests between January and December of 2005. Pitfall trap stations were used for capture of rodents and small didelphids while tomahawk traps were used for Didelphis aurita capture. Mist nets (14m x 3m each) were used for bird capture. Captured animals were scarified and blood, spleen and liver were extracted. Spleen samples were submitted to molecular and bioassay tests for rickettsia research. Captured ticks were submitted to morphological or molecular taxonomic identification and to rickettsia research. Ticks from the genera Amblyomma, Haemaphysalis and Ixodes were collected. Immature tick stages of A. Aureolatum were collected on three individuals of the bird species Pyriglena leucoptera, but no other A. Aureolatum tick was found infesting neither rodents or didelphids. No animal was found infected by rickettsiae whereas three rickettsiae, two of them belonging to Spotted Fever Group, were found infecting the ticks Amblyomma longirostre, Ixodes aragaoi and Ixodes loricatus. No tick was found infected by R. Rickettsii, the agent of BSF. The present study revealed details about the A. Aureolatum life cycle in natural conditions, contributing for a better understanding about the enzootic cycle of BSF.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma zoonose que tem como agente patogênico bactérias da espécie Rickettsia rickettsii, que são transmitidas por carrapatos da espécie Amblyomma aureolatum na Região Metropolitana de São Paulo, onde a letalidade da doença pode chegar a 80 por cento . Carrapatos dessa espécie realizam seu ciclo no interior das matas e cães domésticos - principais hospedeiros do estágio adulto desse carrapato em áreas degradadas - podem auxiliar na manutenção do ciclo da doença, ao transferir carrapatos infectados das matas para o ambiente antrópico. Este estudo teve como objetivo, analisar a relação entre fragmentação florestal, e sua possível influência na distribuição da soroprevalência de R. rickettsii em cães domésticos, na zona de contato entre Mata Atlântica e ambiente antrópico. Nove áreas com diferentes perfis ambientais foram selecionadas para o estudo: duas áreas em São Paulo, três áreas em Santo André, duas áreas em São Bernardo do Campo, uma área em Ribeirão Pires e uma área em Diadema. Uma amostra única de sangue foi coletada em trinta cães por área de estudo, num total de 270 cães amostrados. Todas as amostras foram submetidas a teste sorológico de imunofluorescência indireta para determinação do título de anticorpos contra R. rickettsii e todos os cães do estudo foram inspecionados em busca de carrapatos, que quando encontrados, foram levados ao laboratório para devida identificação de espécies e posterior pesquisa de riquétsias por PCR. Os dados de parasitismo por carrapatos em cães foi determinado pelo cálculo de abundância e intensidade parasitaria média. A soroprevalência encontrada variou de 0 a 37 por cento , e quando comparada aos dados ambientais, resultantes de análise multivariada de componentes principais, demonstrou que áreas mais preservadas, com maior área de mata e borda reduzida tem menores chances de ocorrência de casos de FMB do que áreas com área de mata reduzida e grande quantidade de borda. Somente as espécies A. aureolatum e R. sanguineus foram encontradas parasitando os cães do estudo, sendo que nenhum espécime foi considerado reagente na PCR. Os resultados sugerem que existe uma relação entre a soroprevalência de infecção por R. rickettsii em cães e as características de paisagem de cada região. A análise de estrutura de paisagem - parâmetro que pode favorecer a transmissão da bactéria R. rickettsii, uma vez que favorece o contato de cães e carrapatos vetores é uma ferramenta que pode auxiliar na determinação de áreas de maior ou menor risco para ocorrência de casos humanos de FMB, sendo útil na vigilância da doença. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease whose pathogen is the bacteria Rickettsia rickettsii, transmitted by Amblyomma aureolatum ticks in the Metropolitan Region of São Paulo, where the lethality of the disease can reach 80 per cent . The life cycle of those tiks occour in the forest and domestic dogs - main hosts of the adult stage of this tick in modify areas - can maintain the disease cycle, transferring infected ticks from the forest to the anthropic environment. This study aimed to analyze the relationship between forest fragmentation and its possible influence on the seroprevalence distribution of R. rickettsii in domestic dogs living at the contact zone between the Atlantic Forest and anthropic environment. Nine areas with different landscape profiles were selected for the study: two areas in São Paulo, three areas in Santo André, two areas in São Bernardo do Campo, an area in Ribeirão Pires and an area in Diadema. A single blood sample was collected in thirty dogs in each study area, with a total of 270 sampled dogs. All samples were submitted to serological test of indirect immunofluorescence to determine the antibodies titers against R. rickettsii, and all study animals were inspected for ticks, that when found, were taken to the laboratory for proper identification of species and further Ricketsia research through PCR reaction. Parasitism data of ticks on dogs was determined by the mean abundance and mean intensity. The seroprevalence found ranged from 0 to 37 per cent , and when compared to environmental data, resulted from the principal component analysis, showed that the most preserved areas, with larger amount of forest and less edge has lower chances of BSF occurrence, than areas with less forest and greather amount of edge. Only the species A. aureolatum and R. sanguineus were found parasitizing the study dogs, and no specimen was considered positive in the PCR reaction. The results suggest a relationship between the seroprevalence of infection with R. rickettsii in dogs and the landscape features on each region. The landscape structure analysis - parameter that can facilitate the transmission of the bacteria R. rickettsii, since it favors the contact between dogs and ticks - can assist in determining areas of higher or lower risk for the occurrence of human cases of BSF, being useful in monitoring the disease.

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-06-07T17:24:31Z No. of bitstreams: 1 2015 - Thiago Bernardo Pedro.pdf: 895954 bytes, checksum: 51cf79437e4ec796c2634cdc0a4b0498 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T17:24:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Thiago Bernardo Pedro.pdf: 895954 bytes, checksum: 51cf79437e4ec796c2634cdc0a4b0498 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / This study evaluates the influence of climatic variables on the occurrence distribution of Amblyomma sculptum adult ticks in four sample areas in Serop?dica and Mangaratiba, two municipalities in Rio de Janeiro Metropolitan mesoregion. The data used is relative to tick sampling between the spring of 2008 and the winter of 2012. The climatic variables included in the study were mean temperature, relative humidity and rainfall, in the day of sampling and in the 15 days prior to each sampling. For the statistical analysis, four types of generalized linear models were used: Poisson, Negative Binomial, Quasi Poisson (?2) and Zero Inflated Poisson (ZIP). A total of 574 ticks were found, most of them in the autumn. The bivariate analysis between each one of the independent variables and the response variable, tick count, showed seven variables that were significant at least in two types of models (being ZIP one of them): temperature in the day before sampling, temperature between the 4th and 6th days prior to sampling, temperature between the 11th and 15th days prior, humidity in the day before sampling, humidity in 5th day before, humidity between the 9th and 12th days prior and rainfall in the 12th day prior to sampling. These variables were combined in the multivariate analysis, therewith, nine models were fitted. Analyzing the prevalence ratio (PR), Akaike Information Criterion (AIC), mean square of residuals (MSR) and correlation between expected Y and observed Y (Corr), the best model was chosen, with the following variables (PR [CI 90%]): temperature between the 11th and 15th days prior to sampling (1,06 [1,01; 1,11]), humidity in the day before (1,04 [1,02; 1,05]) and rainfall in the 12th day prior to sampling (0,97 [0,94; 0,99]). Regarding the fitted models, it was possible to notice that the most satisfactory parameters were presented by ZIP models, in which the MSR values were the lowest and Corr values were the highest. The bivariate analyzes performed as of ZIP models contrasted the fact that temperature acts as a protection factor for the occurrence of A. sculptum adult ticks in the day of sampling and in the two days before, but it acts as a risk factor form the 3rd to the 15thday before. Humidity and rainfall act as protection factors for tick occurrence as from the 3rd and the 5th day prior to sampling, respectively. In the days closer to sampling, these two latter variables did not show a definite conduct of risk or protection with respect to the studied tick occurrence. Within this context, we conclude that understanding the parameters responsible for controlling the life cycle of A. sculptum is essential to generate risk models of disease transmission / O presente estudo avalia a influ?ncia de vari?veis clim?ticas sob a distribui??o de ocorr?ncia de carrapatos Amblyomma sculptum adultos em quatro ?reas amostrais nos munic?pios de Serop?dica e Mangaratiba, na mesorregi?o Metropolitana do Rio de Janeiro. Foram utilizados dados referentes a coletas de carrapatos realizadas entre a primavera de 2008 e o inverno de 2012. As vari?veis clim?ticas consideradas foram temperatura m?dia, umidade relativa do ar e volume de precipita??o, no dia das coletas e nos 15 dias anteriores a cada coleta. Para a an?lise estat?stica, foram utilizados quatro tipos de modelos de regress?o lineares generalizados: Poisson, Binomial Negativa, Extra Poisson (?2) e Poisson Inflacionada de Zeros. Foram coletados, ao todo, 574 carrapatos, sendo a maioria no outono. A an?lise bivariada entre cada uma das vari?veis explicativas e a vari?vel de desfecho, contagem de carrapatos, apresentou sete vari?veis significativas em pelo menos dois modelos (sendo um deles o ZIP): temperatura no dia anterior ? coleta, temperatura entre o 4? e o 6? dia anterior, temperatura entre o 11? e o 15? dia anterior, umidade no dia anterior ? coleta, umidade no 5? dia anterior, umidade entre o 9? e o 12? dia anterior e precipita??o no 12? dia anterior ? coleta. Essas vari?veis foram combinadas na an?lise multivariada, com isso, nove modelos foram ajustados. Atrav?s da an?lise da raz?o de preval?ncia (RP), Akaike Information Criterion (AIC), quadrado m?dio dos res?duos (QMR) e correla??o entre Y esperado e Y observado (Corr), foi escolhido o melhor modelo, com as seguintes vari?veis (RP [IC 90%]): temperatura entre o 11? e o 15? dia antes da coleta (1,06 [1,01; 1,11]), umidade no dia anterior ? coleta (1,04 [1,02; 1,05]) e precipita??o no 12? dia anterior (0,97 [0,94; 0,99]). Considerando-se os modelos ajustados, foi poss?vel observar que os par?metros mais satisfat?rios foram apresentados pelos modelos ZIP, em que os valores de QMR foram os mais baixos, e os valores de Corr, os mais elevados. As an?lises bivariadas realizadas a partir do modelo ZIP destacaram o fato de que a temperatura se apresenta como fator de prote??o para a ocorr?ncia de A. sculptum adultos no dia da coleta e nos dois dias anteriores, mas como fator de risco a partir do 3? dia anterior at? o 15?. J? umidade e precipita??o apresentam-se como fatores de prote??o para a ocorr?ncia de carrapatos a partir do 3? e do 5? dia anterior ? coleta, respectivamente, at? o 15?. Nos dias mais pr?ximos ? coleta, essas duas ?ltimas vari?veis n?o apresentam um comportamento definido de risco ou prote??o em rela??o ? ocorr?ncia dos carrapatos em estudo. Dentro desse contexto, conclui-se que entender os par?metros que controlam o ciclo de vida de A. sculptum ? essencial para a gera??o de modelos de risco de transmiss?o de doen?as

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-01-23T17:15:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T17:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) Previous issue date: 2016-10-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dentro da família Ixodidae, relatos recentes descreveram que o cruzamento de carrapatos de populações do táxon Amblyomma cajennense provenientes de diferentes regiões geográficas, apresentavam desempenho reprodutivo com taxa de fertilidade reduzida, podendo este táxon englobar um complexo de espécies diferentes, com subtipos determinados pela distribuição biogeográfica. Por estudos morfológicos, filogenéticos e de biogeografia, concluiu-se que este carrapato deveria ser diferenciado em seis clados definidos por regiões geográficas, todos pertencentes ao Complexo A. cajennense. Considerando este contexto, buscou-se neste estudo ampliar a base de conhecimentos acerca do genoma mitocondrial completo do carrapato Amblyomma sculptum, e diferenciá-lo do Amblyomma cajennense, ambos subtipos e pertencentes ao Complexo A. cajennense. Dentre os achados, destacam-se o gene ND5 e as regiões controle 1 e 2 com características que os credenciam a atuarem como marcadores moleculares evolutivos para a diferenciação destes dois subtipos de carrapatos. Análises comparativas futuras fazem-se necessárias com sequências mitogenômicas dos demais membros do Complexo A. cajennense. Na família Argasidae existem indivíduos que são morfologicamente de difícil identificação. Esta dificuldade ocorre tanto com espécimes adultos, quanto em estádios imaturos, constituindo assim, um importante obstáculo para o estabelecimento de arranjos taxonômicos mais precisos para esta família de carrapatos, sendo um ponto negativo para estudos filogenéticos e epidemiológicos. Desta forma, para o estudo referente à família Argasidae, realizou-se análises comparativa e filogenética do mitogenoma de Nothoaspis amazoniensis para com outros membros desta família, com o objetivo de promover uma melhor compreensão das inter- relações evolutivas entre os carrapatos argasídeos. Como conclusão, evidenciou-se que a abordagem filogenômica posicionou o mitogenoma de N. amazoniensis em um clado monofilético característico do arranjo taxonômico Cladísta, englobado por representantes das regiões Afrotropical e Neotropical, com parasitismo específico em morcegos, o que pode ser um indicativo de um processo evolutivo de coevolução entre vetor e seu hospedeiro. Paralelamente, também se investigou para o N. amazoniensis, a interação parasita-hospedeiro baseando-se na presença de material genético proveniente da ação hematófaga realizado por este argasídeo em seus hospedeiros. O mitogenoma completo referente ao hospedeiro de N. amazoniensis foi sequenciado, montado e anotado, caracterizando-o como oriundo de animal membro da ordem Chiroptera. Por análise filogenética comparando esta sequência contra outras de representantes da Ordem Chiroptera, depositadas em bancos de dados biológicos, obteve-se a identificação desta em nível de gênero, denominando-a como Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considerando os dados referentes à coleta do argasídeo N. amazoniensis, e aos resultados apresentados para este morcego, neste estudo, conclui-se que o N. amazoniensis apresenta uma dependência evolutiva, não somente ao seu provável hospedeiro do gênero Pteronotus, mas de uma forma geral, ao conjunto de condições específicas ecológicas bióticas e abióticas encontradas em seu ecossistema. No atual estudo, a abordagem filogenômica e o estabelecimento de genomas mitocondriais completos, como estratégias moleculares, foram de fundamental importância na inferência filogenética de carrapatos pertencentes às famílias Ixodidae e Argasidae, como também, no estudo sobre a associação evolutiva entre o N. amazoniensis, seu hospedeiro e o ecossistema habitado. / Within the Ixodidae family, recent reports have described that the crossing of populations of ticks Amblyomma cajennense taxon from different geographical regions, had reproductive performance with reduced fertility rate, which taxon may comprise a complex of different species, with subtypes determined by biogeographical distribution. Per morphologic, phylogenetic and biogeography studies have concluded that this tick should be differentiated into six clades defined by geographic regions, all belonging to the compound A. cajennense. In this context, this study targeted to expand the knowledge base about the complete mitochondrial genome of the tick Amblyomma sculptum, and differentiate it from Amblyomma cajennense, both subtypes and belonging to Complex A. cajennense. Among the findings, we can highlight the ND5 gene and control regions 1 and 2 which characteristics qualify them to act as evolutionary molecular markers for differentiation of these two subtypes of ticks. In the future is necessary more comparative analyzes with mitogenomics sequences of other members of the complex A. cajennense. In Argasidae family there are individuals who are morphologically difficult to identify. This difficulty occur in both, adult specimens and immature stages, then creating a major obstacle to the establishment of more precise taxonomic arrangements for this family of ticks, with a negative point for phylogenetic and epidemiological studies. Therefore, in the study relating to Argasidae family, it was carried comparative and phylogenetic analyzes of mitogenome of Nothoaspis amazoniensis to other members of this family, targeting a better understanding of the evolutionary interrelationships between ticks argasids. In conclusion, it was shown that the phylogenomic approach placed the mitogenome N. amazoniensis in a monophyletic clade typical of a taxonomic arrangement Cladist comprised by representatives of Afrotropical and Neotropical regions, with specific parasitism in bats, which may indicate an evolutionary process of coevolution between vector and its host. At the same time, it was also investigated for N. amazoniensis, the parasite-host interaction taking in account the presence of genetic material from hematophagous action performed by this argasid in their hosts. The complete mitogenome referring to the host of N. amazoniensis was sequenced, assembled and annotated, characterizing it as originated from an animal member of the order Chiroptera. Through phylogenetic analysis, comparing this sequence against other sequences of representatives of Chiroptera order, placed in biological databases, it was obtained an identification of this sequence in the genus level, terming it as Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considering the data regarding the collection of argasid N. amazoniensis, and the results presented for this bat in this study it was concluded that N. amazoniensis presents an evolutionary dependence, not only to the probable host Pteronotus gender, but in general, to the set of ecological specific conditions, biotic and abiotic, found in its ecosystem. In the current study, the phylogenomic approach and the establishment of complete mitochondrial genomes, as molecular strategies, have been of fundamental importance in the phylogenetic inference of ticks belonging to the Ixodidae and Argasidae families, as well as in the study of the evolutionary association between N. amazoniensis, its host and the ecosystem inhabited.

Cultura de células de carrapatos, é uma ferramenta importante, para isolar e estudar os agentes de doenças transmissíveis. Amblyomma sculptum é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, o agente da febre maculosa. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar as células deste carrapato, além de testar seu potencial uso, como substrato para o crescimento e isolamento de patógenos. A partir de massas de ovos de A. sculptum, culturas primárias foram, preparadas em meio L-15B, subcultivadas ao atingirem a confluência necessária e criopreservadas em diversas passagens. A boa recuperação celular estabeleceu a linhagem IBU/ASE-16, a qual foi testada para, Rickettsia spp, Trypanosoma theileri e Leishmania infantum chagasi, obtendo-se bons resultados. A citometria de fluxo analisou a expressão de marcadores de células-tronco, proliferação, diferenciação e regulação do ciclo celular, nas IBU/ASE-16. O Δψm mostrou atividade das mitocôndrias e ausência de células inativas. A microscopia confocal, localizou estruturas celulares marcadas com fluorocromos, enquanto que a MEV,mostrou, junções intercelulares, matriz extracelular e redes neuronais. O teste de tumorigênese em camundongos Balb/c nu/nu, não resultou em crescimento de tumores. / Cell cultures of ticks are important tools to isolate and study agents of transmissible diseases. Amblyomma sculptum is the main vector of Rickettsia rickettsii, the agent for spotted fever. The aim of this study was to establish and characterize the cells of this tick, and test their potential use as a substrate for the growth and isolation of pathogens. From a egg masses of A. sculptum, primary cultures were prepared in L-15B medium, subcultured as they reached the necessary convergence and cryopreserved in several passages. The good cell recovery established IBU/ASE-16 lineage, which was tested for Rickettsia spp, Trypanosoma theileri and Leishmania infantum chagasi, yielding good results. Flow cytometry analyzed the expression of stem cell markers, proliferation, differentiation and regulation of the cell cycle, in the IBU/ASE-16 lineage. The Δψm showed activity of mitochondria and absence of inactive cells. Confocal microscopy located cell structures marked with fluorochromes, while MEV showed intercellular junctions, extracellular matrix and neural networks. Tumorigenesis tests in Balb/c nu/nu mice resulted in no tumor growth.

Própolis é uma substância resinosa produzida por Apis mellifera, contendo principalmente resinas vegetais e cera das próprias abelhas. É usada na colmeia para diversas finalidades, como vedar aberturas, reparar as células e envolver invasores que foram mortos na colméia, além de contribuir para a quase constância da temperatura dentro da colmeia (28 - 30oC). A própolis é importante para as abelhas, pois é responsável pela manutenção de um ambiente quase estéril, agindo contra bactérias, fungos e até larvas invasoras. Em virtude do amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas associadas a esse produto, a própolis vem sendo extensivamente utilizada em medicina alternativa, bem como na indústria cosmética e alimentícia. Apesar dos numerosos estudos já realizados com própolis, os poucos que foram feitos visando ao uso em veterinária relacionavam-se a combate de endoparasitas. Muitas doenças de animais vêm acometendo o homem atualmente, tais como as transmitidas pelos carrapato vermelho do cão (Rhipicephalus sanguineus) e carrapato-estrela (Amblyomma cajennense). Problemas de saúde para o gado e queda da produtividade pecuária é causada pelo carrapato do boi (Rhipicephalus microplus). Além disso, é crescente o interesse de profissionais veterinários pelo uso de produtos naturais, sobretudo em relação aos animais domésticos. Vale lembrar que o uso indiscriminado de acaricidas levou à seleção de carrapatos resistentes, de modo que outras estratégias para o controle dessas pragas são de grande importância. Com isso, o intuito do presente projeto foi a determinação da atividade de extratos brutos de própolis brasileira e seus constituintes no controle de carrapatos específicos e generalistas. Foram preparados extratos clorofórmicos de amostras de própolis verde de Lavras (MG) e própolis preta de Picos (PI), anteriormente analisadas quimicamente. Os extratos foram concentrados à secura e redissolvidos para administração a carrapatos mantidos em laboratório. Os ensaios com extratos brutos foram realizados in vitro para avaliar seu efeito nos artrópodos, empregando-se o teste de pacote de larvas. Foram realizados isolamentos biomonitorados, na tentativa de obtenção de substâncias ativas presentes nas própolis analisadas. O extrato bruto de Picos não revelou atividade acaricida. Por outro lado, o extrato bruto de Lavras mostrou-se bastante ativo e, então, foi fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica. As frações resultantes foram novamente avaliadas em ensaios in vitro em carrapatos. Novo fracionamento e novos bioensaios foram realizados, e foi identificada uma subfração com atividade acaricida. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidas e quatro substâncias majoritárias (ácido 2,2-dimetil-cromeno-6-propenoico-dicafeoil glucosídeo, artepilina-C, bacarina e ácido 2,2-dimetil-cromeno-8-prenil-6-propenoico) dessa subfração ativa foram isoladas em CLAE-preparativo. As substâncias obtidas foram identificadas por meio de análises espectroscópicas correntes em química de produtos naturais (IV, UV, massas e RMN). Por fim, novos bioensaios foram realizados com a espécie de carrapato mais suscetível, Rhipicephalus microplus, porém não se observou atividade acaricida significativa para as substâncias isoladas. Assim sendo, talvez a alta atividade acaricida constatada na subfração ativa seja decorrente do sinergismo entre substâncias. / Propolis is a resinous substance produced by bees Apis mellifera, containing mainly plant exudates and bee waxes. It is used in the hive to close holes, repair cells and involve intruders that are killed inside the hive. Propolis is important to the bees, as it is responsible for the maintenance of the hive as a sterile environment, acting against bacteria, fungus and even invading larvae. Because of the wide range of biological and pharmacological activities of propolis, it has been extensivelly used in alternative medicine, as well as in cosmetic and food industries. However, few studies have been developed concerning the use of propolis to animal health. Nowadays, many animal diseases have affected humans, such as those transmited by ticks, the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and the star tick (Amblyomma cajennense). Cattle health problems and decrease of livestock productivity is caused by the cattle tick (Rhipicephalus microplus). In addition, the interest of veterinary professionals toward the use of natural products to animal health is increasing, mainly for the treatment of domestic animals. It is worth remembering that the indiscriminate use of acaricides leads to resistence selection. Thus, new strategies are of great importance for tick control. Hence, the aim of this project was to determine the activity of crude extracts of Brazilian propolis and their constituents for the control of specific and generalist ticks. Chloroform extracts were prepared from samples of green propolis from Lavras (state of Minas Gerais) and black propolis from Picos (state of Piauí), previously analyzed chemically. The extracts were concentrated to dryness and redissolved for ticks administration in laboratory. The bioassays were carried out in vitro to verify the effectivness of the extracts using the larval package test. Bioassays-guided isolations were carried out to obtain active constituents presented in the studied samples. The crude extract of propolis sample from Picos did not show any acaricide activity. On the other hand, the sample propolis from Lavras showed high activity, and then was fractionated by colunm chromatography in silica gel. The fractions obtained were tested, and a subfraction with acaricide activity was obtained. Analyses by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed and four compounds (2,2-dimethyl-cromene-6-propenoic-dicafeoyl glucoside acid, artepillin-C, baccarin and 2,2-dimethyl-cromene-8-prenyl-6-propenoic acid) of the active subfraction were isolated using preparative HPLC. These compounds were identified by means of current spectroscopic analysis in chemistry of natural products (IR, UV, mass and NMR). Finally, new bioassays were carried out with the most susceptible tick specie, Rhipicephalus microplus, but no effect was observed testing the isolated compounds. Thus, probably the high acaricidal activity observed in the active subfraction was due to a synergism among the subfraction constituents.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.