Les analogues de nucléosides représentent une famille thérapeutique très largement utilisée en cancérologie dans le traitement des hémopathies malignes et autres cancers. Leur implication sur les variations des pools des nucléotides endogènes a été largement décrite et a constitué le point de départ de ce travail. C’est dans le but d’étudier ces variations que nous avons développé une méthode de dosage sensible et spécifique des ribonucléotides et désoxyribonucléotides physiologiques intracellulaires. Dans la première partie de ce mémoire nous avons réalisé une revue de la bibliographie sur les méthodes de dosage décrites dans la littérature puis nous avons détaillé le métabolisme des nucléotides endogènes et de leurs analogues. Dans la deuxième partie, nous présentons la validation de notre méthode de dosage et l’application à l’étude des variations des pools endogènes de ribonucléotides et désoxyribonucléotides dans différents modèles cellulaires : lignées résistantes versus lignées parentales et lignées traitées versus lignées non traitées. Les résultats obtenus sur les cellules montrent que notre méthode de dosage permet d’étudier l’impact des analogues nucleosidiques sur les pools endogènes de nucléotides mais aussi les dosages des dérivés phosphates de ces nucléosides / Nucleoside analogues constitute family of drugs widely used in cancer therapeutic for the treatment of malignancy hemopathies and several type of cancer. Numerous studies described their action on the variation of endogen nucleotide pools. This constitutes the point of starting of the present work. A sensible and specific assay for the quantification of intracellular ribonucleotides and désoxyribonucleotides was developed. In the first part, a review concerning the analytical methods published is presented. We also focused on the metabolism of endogen nucleotides and their analogues. In the second part, our method for the quantification of endogen nucleotides and désoxynucleotides is presented from different cellular models: resistant cell lines versus wild type lines, treated cells with analogues versus untreated cells. Results obtain from the cells lines studied show that our analytical method allows to study the impact of nucleoside analogues on endogenous nucleotides, but also the quantification of the phosphate derivatives of these analogues

La prise en charge du cancer reste dépendante de l’utilisation des agents cytotoxiques, avec les analogues nucléosidiques. Au-delà de leur similarité structurelle, certains de ces composés partagent une voie métabolique commune, où la cytidine déaminase apparaît comme enzyme majeure. L’existence d’une variabilité génétique et/ou phénotypique de la CDA nous a mené à nous intéresser aux relations entre le statut CDA et l’issue clinique des patients afin de déterminer si la CDA pouvait être considérée comme biomarqueur d’issue clinique chez les patients.Nos travaux personnels ont consisté à évaluer deux techniques permettant de mesurer l’activité de la CDA. Nous avons publié le premier cas mondial de toxicités mortelles sous azacytidine chez un patient CDA-déficient, ainsi que le premier cas de déficience en CDA et de toxicités sous cytarabine causées par la présence d’une variation génétique du gène CDA chez une patiente transplantée hépatique. L’influence du statut CDA a également été étudiée chez deux patients traités par azacytidine. Concernant la gemcitabine, nous avons démontré l’impact délétère en terme d’efficacité de l’augmentation de l’activité CDA chez les patients, ainsi que les résultats d’une étude multicentrique prospective dont le but était de déterminer si la CDA pouvait être un marqueur prédictif de l’apparition des toxicités sous gemcitabine, avec une étude pharmacocinétique en support. Les travaux préliminaires du pyroséquençage partiel de la CDA sur technologie Roche® sont présentés. L’ensemble de ces travaux de thèse confirme l’intérêt d’évaluer le statut CDA chez les patients susceptibles de recevoir une thérapie à base d’analogues nucléosidiques. / Nowadays, the management of cancer pathology remains largely dependent on the use of cytotoxic agents, including nucleoside analogs, used in a variety of settings. Beyond their structural similarity, some of these compounds also share a common metabolic pathway, wherein the cytidine deaminase (CDA) plays a pivotal role. The existence of constitutional genetic and / or phenotypic variability in CDA prompted us to study the relationships between the CDA status and clinical outcome in patients, and to determine if the constitutional CDA could be considered as a biomarker of efficacy and toxicity in patients treated with this class of drugs.Our personal work first consisted in evaluating two methods to measure the CDA enzymatic activity, in terms of robustness and cost. Then we published the first case-report of life-threatening toxicities in a CDA-deficient patient treated with azacytidine, and the first case of CDA deficiency and cytarabine-caused toxicities correlated with presence of a genetic variation in CDA gene in a liver-transplant patient. The influence of CDA status was also assessed in two patients treated with azacytidine. Regarding gemcitabine, we present the impact of an increase in CDA activity on loss of efficacy in patients, and the results of a prospective multicenter study whose purpose was to determine whether the CDA could be a predictive marker of the occurrence of gemcitabine-toxicities, with a pharmacokinetic study support. Finally, preliminary data on partial Roche®-pyrosequencing of CDA, also presented.All these thesis work confirms the interest to evaluate the CDA status in patients likely to receive a nucleosidic analogues-based therapy.

La squalénisation est la base d’une nouvelle et très prometteuse nanotechnologie. Le concept repose sur l’observation que la conjugaison d’un analogue nucléosidique ayant une activité thérapeutique à une molécule de squalène conduit à la formation spontanée dans l’eau de nanoparticules, de diamètre compris entre 100 et 300 nm, montrant une activité très supérieure à celle de l’analogue nucléosidique seul. Au cours de cette thèse nous avons cherché à comprendre les relations entre la nature de la paire drogue-terpénoide, la structure des nanoparticules et leur activité biologique. Pour cela, d’une part différents nucléosides et analogues nucléosidiques ont été couplés de façon covalente au squalène et d’autre part la gemcitabine a été couplée à des dérivés terpénoides de longueurs croissantes. L’organisation supramoléculaire de ces composés a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles et cryo-microscopie électronique. L’influence des conditions de nanoprécipitation sur la structure des nanoparticules a été étudiée. L’impact de l’organisation supramoléculaire des nanoparticules sur leur internalisation cellulaire et leur cytotoxicité a été mis en évidence pour certaines lignées. / Squalenoylation is a new and very promising nanotechnology. The concept consists in coupling nucleoside derivatives that have therapeutic activity to a molecule of squalene: whatever the nucleoside, nanoparticles with a diameter around 100 - 300 nm are spontaneously obtained upon nanoprecipitation of the nucleolipid in an aqueous medium. These nanoparticles display an increased biological activity compared with the nucleoside. The aim of this PhD thesis was to understand the link between the nature of the drug-terpenoid pair, the supramolecular structure of nanoparticles and the biological activity.Therefore, in a first part, several nucleosides and nucleoside derivatives were covalently coupled to squalene, and in a second part gemcitabine was coupled to terpenoid chains with increasing length. The supramolecular organization of the nanoparticles was determined by Small Angle X-rays Scattering and cryogenic transmission electronic microscopy. The influence of the condition of nanoprecipitation on the supramolecular structure of nanoparticles was studied. The impact of the supramolecular organization on the cell internalization and cytotoxicity was highlighted for some cell lines.

La squalénisation est la base d'une nouvelle et très prometteuse nanotechnologie. Le concept repose sur l'observation que la conjugaison d'un analogue nucléosidique ayant une activité thérapeutique à une molécule de squalène conduit à la formation spontanée dans l'eau de nanoparticules, de diamètre compris entre 100 et 300 nm, montrant une activité très supérieure à celle de l'analogue nucléosidique seul. Au cours de cette thèse nous avons cherché à comprendre les relations entre la nature de la paire drogue-terpénoide, la structure des nanoparticules et leur activité biologique. Pour cela, d'une part différents nucléosides et analogues nucléosidiques ont été couplés de façon covalente au squalène et d'autre part la gemcitabine a été couplée à des dérivés terpénoides de longueurs croissantes. L'organisation supramoléculaire de ces composés a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles et cryo-microscopie électronique. L'influence des conditions de nanoprécipitation sur la structure des nanoparticules a été étudiée. L'impact de l'organisation supramoléculaire des nanoparticules sur leur internalisation cellulaire et leur cytotoxicité a été mis en évidence pour certaines lignées.

La protéine de la nucléocapside (NC) possède un rôle important dans le cycle de viral du VIH-1 grâce à sa propriété chaperone des acides nucléiques (NA) qui implique la reconnaissance de son résidu Trp37 avec un résidu Guanine de l'acide nucléique cible. Nous avons caractérisé cette reconnaissance dynamique Trp37-G en utilisant des séquences impliquées dans la transcription inverse et l'assemblage de l'ARN génomique. En utilisant les analogues nucléosidiques fluorescents thienoguanosine (thG) et 2-thiényl-3-hydroxychromone (3HCnt), nous avons déterminé l'ensemble des constantes de vitesse cinétiques du mécanisme d’hybridation de la séquence (-)PBS avec (+)PBS en absence et en présence de NC. Nous avons également étudié le rôle du NA sucre dans les complexes NC-ARN et NC-ADN, puisque la protéine NC se lie avec la polarité opposée aux séquences d'ADN et d'ARN. Nous avons confirmé que l'interaction du résidu Trp37 avec les amino-acides de type guanines était critique lors de la formation des complexes avec les deux mutants d’ARN et d’ADN de PBS et de SL3. Enfin, nous avons réalisé un criblage de potentiels inhibiteurs de la protéine NC et examiné les touches identifiées à partir d’un test basé sur la fluorescence de la sonde thG. / Nucleocapsid protein (NC) plays crucial roles in HIV-1 life cycle through its nucleic acid (NA) chaperoning property that involves recognition of it’s Trp37 residue with a Guanine residue of the target nucleic acid sequences. Herein, we characterized this dynamic Trp37-G recognition with sequences involved in reverse transcription and genomic RNA packaging. Using the fluorescent thienoguanosine (thG) and 2-thienyl-3-hydroxychromone (3HCnt) nucleoside analogues, we determined the whole set of kinetic rate constants for annealing of (-)PBS with (+)PBS in the absence and presence of NC. We also investigated the role of NA sugar in NC-RNA and NC-DNA complexes, as NC binds with opposite polarity to DNA and RNA sequences. We confirmed that the interaction of the Trp37 residue with guanines was critical for the formation of complexes with both RNA and DNA variants of PBS and SL3. Finally, we performed screening of NC inhibitors and tested the selected hits on a thG-based assay.

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