La résistance aux antibiotiques apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, en particulier à cause de l'apparition de souches de bactéries multirésistantes par production d'enzymes de modification de ces antibiotiques. Nous avons étudié une de ces enzymes de résistance, l'AAC(6')-Ib conférant la résistance aux aminoglycosides, antibiotiques à large spectre utilisés principalement en milieu hospitalier pour lutter contre des infections sévères. Deux variants de cette enzyme se sont répandus dans les souches cliniques résistantes : le premier confère une résistance élargie à tous les aminoglycosides, le second confère une résistance élargie à une autre classe d'antibiotiques, les fluoroquinolones. Nous avons résolu la structure de l'enzyme sauvage et du premier variant par cristallographie aux rayons X. Nous avons également modélisé la structure du deuxième variant. Ces structures nous ont permis d'apporter une explication possible sur l'adaptation de cette enzyme aux différents antibiotiques. En parallèle, nous avons réalisé un criblage de ligands de cette enzyme par RMN à flux continu robotisé. Nous avons pu isoler plusieurs motifs se fixant dans le site actif de l'enzyme constituant des pistes intéressantes dans la conception d'inhibiteurs de l'activité enzymatique.

Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu'elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l'ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l'une des principales causes d'infections chroniques, mais également d'infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd'hui reconnu qu'une telle biostructure est un véritable bouclier à l'action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l'hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l'origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d'infections. C'est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l'action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d'études réalisées sur des cellules planctoniques, l'originalité de notre approche a été d'étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l'épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d'exopolymères, ainsi que l'impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l'activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l'action des antibiotiques, et de souligner l'urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms.

Les systèmes de transduction du signal et les transporteurs ABC contribuent de façon conjointe à la réponse adaptative des bactéries aux changements d'environnement. Trois modules, associant un phosphorelais et un transporteur ABC, ont été répertoriés chez B. subtilis et sont impliqués dans la réponse à différents antibiotiques: BceRSAB, PsdRSAB et YxdJKLM. Ils sont caractérisés par une histidine kinase possédant une boucle extracytoplasmique courte et appartenant à la famille des Intramembrane Sensing - Histidine Kinase (IM-HK) et par un transporteur ABC possédant une Membrane Spanning Domain (MSD) à boucle extracytoplasmique exceptionnellement longue. En utilisant une approche phylogénomique, il a été établi que ce type de modules était restreint aux Firmicutes, où ils sont apparus et se sont largement répandus. De plus, cette analyse met en lumière une histoire évolutive très dynamique impliquant de nombreux transferts horizontaux, duplications et pertes de gènes, conduisant à un répertoire de modules Bce-like très varié chez ce phylum. Grâce à une analyse phylogénétique fine, il a été proposé une classification de ces modules en six sous-familles bien définies. Des études fonctionnelles ont été réalisées sur des membres de la sous-famille IV comprenant le module de résistance à la bacitracine BceRSAB de B. subtilis, dont l'expression des gènes codant pour le transporteur requiert, en présence de l'antibiotique, le système de transduction du signal aussi bien que le transporteur lui-même. Les résultats de ces études montrent que d'autres membres de la sous-famille IV, YtsCD de B. licheniformis et BceAB de B. halodurans, sont également impliqués dans la résistance à la bacitracine. Ils suggèrent aussi que dans ces modules le transporteur ABC est le premier senseur de la présence de l'antibiotique et qu'il active le système de transduction une interaction entre une sous unité du transporteur et la kinase du module. De plus, en présence de bacitracine, l'expression des gènes codant pour le transporteur BceAB ainsi que la résistance à cet antibiotique requièrent la présence de la boucle de la MSD BceB ce qui démontre l'importance de cette boucle aussi bien au niveau fonctionnel que structural. Par ailleurs, l'étude que nous avons réalisée suggère que le mécanisme original de régulation des gènes du transporteur BceAB de B. subtilis pourrait être généralisé à tous les modules équivalents présents chez les Firmicutes. Ces modules constitueraient ainsi un mécanisme important de résistance aux antibiotiques peptidiques chez les bactéries de ce phylum qui comprend de nombreux pathogènes.

Peu étudiée et méconnue, initialement décrite au début du XXème siècle, Helicobacter pylori fut redécouverte en 1982 par deux chercheurs australiens, JR Warren et BJ Marshall. Ils soutinrent que la plupart des ulcères gastro-duodénaux étaient causés par cette bactérie, et non par le stress ou la nourriture épicée, comme pensé auparavant. Cette découverte révolutionna le monde de la gastroentérologie et leur valut le prix Nobel de physiologie et de médecine 2005. Environ la moitié de la population mondiale est colonisée par H. pylori au niveau de l'estomac. Dans 10 à 20% des cas, l'infection peut évoluer vers un ulcère gastro-duodénal et dans certains cas vers une transformation maligne. Cette infection se soigne classiquement à l'aide d'une trithérapie associant 2 antibiotiques à un inhibiteur de la pompe à protons pour neutraliser l'acidité gastrique. Notre travail de recherche a consisté à analyser la proportion de patients infectés par H. pylori dans une cohorte de plus de 22.000 patients, issus de divers groupes ethniques, vivant en Belgique. Ces souches de H. pylori, isolées dans notre laboratoire, à partir des biopsies gastriques, ont aussi servi à une étude pour suivre l'évolution de la résistance aux antibiotiques ces 20 dernières années afin de proposer des améliorations de la prise en charge thérapeutique de l'infection à H. pylori en Belgique.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques stimule le développement de nouveaux médicaments. Ceux ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation des membranes bactériennes sont de bons candidats puisque les pathogènes y développent plus lentement une résistance. La RMN-ÉS in vivo de membranes naturelles marquées au deutérium (2H) devraient permettre des études plus représentatives des interactions entre les membranes et des agents antimicrobiens ce qui poussera le développement de nouveaux antibiotiques moins susceptibles aux phénomènes de résistance. Le but de ce projet est donc de préparer des bactéries Escherichia coli ayant les lipides membranaires deutérés par incorporation d'acides gras exogènes deutérés pour permettre des études in vivo par 2H RMN-ÉS. Le projet a également pour but d'extraire et purifier des pigments de type marennine pour évaluer leur activité biologique et leurs effets sur les membranes d'E. coli. Nos résultats démontrent qu'une souche sauvage d'E. coli incorpore l'acide palmitique deutéré dans les phospholipides membranaires à un taux de 76% (m/m d'acide gras totaux) permettant un bon rapport signal sur bruit sur les spectres 2H RMN-ÉS. Trois agents antimicrobiens avec des mécanismes d'action différents ont été testés afin de vérifier la réponse des membranes deutérée d'E. coli. Les effets de l'antibiotique polymyxine B étaient cohérents avec la rigidification des membranes, tandis que l'exposition aux nanoparticules de fullerénol a restreint légèrement la dynamique des phospholipides. Le spectre du chlorure de cétyltriméthylammonium révèle la formation d'une phase gel de la membrane. Les interactions entre le modèle développé et les agents antimicrobiens sont en accord avec les mécanismes d'action connus ce qui souligne la justesse de l'analyse in vivo 2H RMN-ÉS d'une souche sauvage d'E. coli pour étudier les mécanismes d'action des agents antimicrobiens et les biomembranes. Le modèle développé a été exposé à l'agent antimicrobien marennine pour vérifier si ce pigment algal extrait de diatomées perturbait les membranes d'E. coli. Les travaux ont permis d'optimiser la croissance des diatomées H. provincialis et d'H. karadagensis en réduisant l'intensité lumineuse, ce qui a assuré la qualité et la quantité du pigment marennine. L'analyse 2H RMN-ÉS indique que la forme externe du pigment extrait d'H. provincialis rigidifie les membranes d'E. coli tandis que la forme interne les fluidifie légèrement ce qui est en accord avec leur propriétés antimicrobiennes respectives connues. Les interactions entre les pigments et les membranes bactériennes sont possiblement la cause de leur action antibiotique. Les formes externes d'H. ostrearia et d'H. karadagensis ont été testées sur les cellules Vero pour déterminer leur cytotoxicité et leur effet antiviral sur le virus HSV-1. Le pigment d'H. karadagensis est moins toxique et a un effet antiviral plus important que le pigment d'H ostrearia ce qui oriente la recherche de nouveaux agents antiviraux sur les pigments d'H karadagensis. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bactérie Gram négatif, interactions membranaires, polymyxine B, fullerène polyhydroxylé, chlorure de cétyltriméthylammonium, pigment de type marennine.

Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICEs) sont des éléments génétiques mobiles bactériens largement reconnus en tant qu'importants vecteurs de la transmission des gènes de résistance aux antibiotiques. Comme tous les éléments génétiques mobiles, ils participent grandement à la plasticité génomique de leur hôte, en permettant le transfert horizontal de gènes conférant des avantages pour l'adaptation de leur hôte à différentes conditions environnementales. Les ICEs se transfèrent horizontalement par conjugaison, par un mécanisme similaire à celui emprunté par les plasmides conjugatifs. Cependant, au contraire des plasmides, les ICEs ne possèdent pas un intermédiaire circulaire extrachromosomique réplicatif : ils s'intègrent plutôt dans le chromosome de leur hôte par recombinaison site-spécifique, à la manière d'un prophage. Une conséquence de ces deux caractéristiques est qu'ils sont également transmis verticalement lors de la division cellulaire de leur hôte. Lorsque soumis à certaines conditions, les ICEs s'excisent de leur hôte sous forme d'une molécule circulaire qui est le substrat pour leur transfert conjugatif vers un nouvel hôte. Une fois transférée, la molécule de l'ICE est recircularisée et s'intègre dans le chromosome. Les ICEs de la famille SXT/R391 sont largement distribués dans les souches de Vibrio cholerae et dans les ?-protéobactéries apparentées et ont été isolées dans une diversité d'endroits géographiques. Les membres de cette famille comportent un large squelette de gènes conservés qui codent pour leurs fonctions principales d'intégration/excision, de transfert conjugatif et de régulation. À l'intérieur de ce squelette sont retrouvées des régions.variables - dont la nature et les combinaisons diffèrent d'un élément à l'autre - qui codent pour des fonctions accessoires telles les résistances aux antibiotiques. Le patron de combinaisons des régions variables entre différents ICEs a mené à l'hypothèse qu'ils sont soumis à de fréquents échanges de matériel génétique par recombinaison. L'intégration site-spécifique de tous les membres de cette famille dans le même locus chromosomique permet la coexistence de deux ICEs semblables mais non identiques dans la même cellule, ce qui fournit un substrat à la recombinaison inter-ICE et permet la formation d'éléments hybrides. Cette thèse présente l'étude d'un nouveau système de recombinaison homologue identifié dans le squelette des ICEs SXT/R391 et sa participation dans la formation d'ICEs hybrides. Ce système de recombinaison, composé de la recombinase Bet et de l'exonucléase Exo est apparenté au système de recombinaison Red du bactériophage ? et est retrouvé chez tous les membres de la famille SXT/R391. La première portion du projet a visé l'identification des déterminants génétiques impliqués dans la formation d'hybrides. Les résultats obtenus démontrent que les ICEs hybrides peuvent être formés par trois voies différentes : i) Bet/Exo, d'une manière indépendante de RecA, ii) RecA et iii) Bet/Exo et RecA, de manière coopérative. Les résultats démontrent également que l'excision des éléments du chromosome ainsi que leur transfert conjugatif vers une nouvelle cellule ne sont pas nécessaires pour former des hybrides. Cette portion du projet met en évidence que les ICEs de la famille SXT/R391 sont capables de promouvoir leur propre diversité à l'aide du système de recombinaison homologue RecA-indépendant qu'ils codent. La deuxième partie du projet s'est portée sur la régulation de l'expression du système de recombinaison Bet/Exo. Les résultats obtenus démontrent que la transcription des gènes de recombinaison est induite en présence d'agents causant des dommages à l'ADN, par le biais des activateurs de transcription de l'ICE, SetC et SetD. Ces activateurs sont sous le contrôle du répresseur principal SetR, dont la répression est levée par les conditions qui induisent la réponse SOS de l'hôte, et sont responsables de l'expression concertée des gènes d'intégration/excision et de transfert conjugatif. Bien que la transcription des gènes de recombinaison soit fortement induite en présence d'agents induisant la réponse SOS, l'analyse de leur profil traductionnel démontre que leur traduction est fortement régulée. Des atténuateurs de traduction putatifs positionés en amont de Bet et Exo pourraient être responsables de ce niveau additionnel de régulation. L'analyse de l'organisation génétique du locus de recombinaison a mis en évidence que bet et exo font partie d'un opéron polycistronique comprenant 12 autres gènes du squelette conservé des ICEs SXT/R391, dont les fonctions ne sont pas connues. Finalement, une analyse in silico visant à identifier tous les systèmes de recombinaison apparentés au sein des génomes séquencés de bactéries, plasmides et virus a permis de démontrer qu'un nombre important de ces systèmes existent chez une diversité d'espèces bactériennes appartenant à des taxons éloignés. Bien que la majorité de ces systèmes soient codés par des bactériophages, plusieurs sont retrouvés sur des plasmides conjugatifs. L'ensemble des résultats présentés dans cette thèse permet une meilleure compréhension de l'évolution des éléments génétiques mobiles bactériens, et plus particulièrement des éléments intégratifs et conjugatifs de la famille SXT/R391.

Les composés dits 'bionano' (bionanocomposites) apparaissent comme un nouveau groupe de matériaux hybrides nano-structurés. Ils sont issus de la combinaison de polymères naturels et de solides inorganiques et sont de l'ordre du nanomètre dans au moins une direction. Ces matériaux hybrides conservent les structures et les propriétés fonctionnelles des polymères et matériaux inorganiques dont ils sont composés. Parallèlement, la présence de biopolymères permet de diminuer les risques environnementaux et de santés publiques liés aux nano-matériaux. Les propriétés inhérentes aux biopolymères (biocompatibles' et biodégradables) ouvrent des perspectives intéressantes pour ces matériaux hybrides en particulier dans les domaines de la médecine regénérative et en génie de l'environnement. La production de bionanocomposites de taille plus importante, que les nanoparticules qu'ils renferment, permet d'éviter les effets nocifs potentiels des nanoparticules (NPs) pour les organismes vivants et plus particulièrement pour l'homme. L'association de biopolymères et de nano-solides inorganiques permet la conception de bionanocomposites multifonctionnels qui peuvent être synthétisés et utilisés pour des applications dans des domaines variés. Cette thèse se propose d'étudier principalement (i) ma présence d'arsenic et d'antibiotiques dans les sources d'eau potable en Chine; (ii) l'évaluation d'un nouveau bionanocomposites, à savoir le CGB (chitosan goethite bionanocomposite), dans la décontamination des eaux contenant des espèces inorganiques d'arsenic; (iii) l'évaluation d'argiles comme adsorbants de décontamination de la gentamicine (un antibiotique aminoglycoside ) présent dans l'eau de même que celle de bionanocomposés fait d'argiles riches en gentamicine de polymères de methycelluloses hydroxypropyles Gt-Mt-HPMC (gentamicin-montmorillonite- hydroxypropyl methycellulose) utilisés comme pansement contre les infections qui ont lieu suite à des brûlures.

Face à l'apparition alarmante et continue de résistance massive des bactéries à l'arsenal actuel d'antibiotiques, la recherche de nouveaux agents antibactériens est actuellement un enjeu sociétal de tout premier ordre. Bien que connus depuis plus de 50 ans, les thiopeptides antibiotiques suscitent actuellement un très fort regain d'intérêt de la communauté scientifique internationale en raison de leurs propriétés antibactériennes remarquables, notamment contre les staphylococcus areus résistants à la méthiciline et les enterococci résistants à la vancomycine, impliquées dans de nombreuses infections qui engagent la vie des patients, et qui s'exercent de façon très intéressante selon deux modes d'action d'inhibition de la synthèse protéique originaux et encore inexploités en thérapie antibiotique humaine. Le travail développé s'inscrit dans ce programme international de valorisation pharmacologique qui repose pour une grande part sur le développement d'approches synthétiques rapides et modulables. Le projet a été centré en particulier sur la conception et la mise en oeuvre de nouveaux plans de synthèse des unités centrales di- ou trithiazolylpyridines, appelées coeurs hétérocycliques, communs à de nombreux thiopeptides de la série d et qui représentent les principaux défis synthétiques. Dans le cadre d'un programme de recherche du laboratoire ciblé sur l'étude de nouvelles méthodes de fonctionnalisation directe d'aromatiques et d'hétérocyclique, un premier travail méthodologique d'étude de la fonctionnalisation directe dans deux séries structurellement représentatives, thiazole-4-carboxylate et 2-cétothiazole, a été réalisé. Ainsi, une nouvelle méthodologie originale d'hétéroarylation directe pallado-catalysée régioselective du thiazole-4-carboxylate de tert-butyle avec une large gamme d'halogéno(hétéro)aromatiques a été développée avec succès. Une seconde méthodologie originale d'hétéroarylation directe de 4-bromo-2-cétothiazoles selon une séquence réactionnelle de boroylation pallado-catalysée suivie d'un couplage de Suzuki-Miyaura (BSC) a également été développée. Un second travail a porté sur l'exploitation des deux méthodologies de fonctionnalisation directe en série thiazolique développées et associées à la méthodologie de construction thiazolique de Hantzsch pour proposer et mettre en oeuvre un nouveau plan de synthèse expéditif et général d'accès aux coeurs hétérocycliques communs à une grande majorité des thiopeptides de la série d basé sur la fonctionnalisation séquencée d'un précurseur pyridinique aisément accessible. En particulier, la stratégie envisagée a permis, à partir des esters 5-bromopicolinates, la préparation tout d'abord d'un analogue thiazolique du coeur hétérocyclique des sulfomycines puis celle des coeurs hétérocycliques des micrococcines et des amithiamicynes.