Les biofilms bactériens, communautés multicellulaires adhérentes à une surface et enrobées d’une matrice extracellulaire, sont cruciaux pour le maintien de la plupart des écosystèmes de notre planète mais représentent également une menace pour la santé humaine. Leur éradication est un véritable défi pour la microbiologie moderne du fait de leur résistance élevée aux antibiotiques. Providencia stuartii est une bactérie Gram-négative connue pour sa forte capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain, qui est responsable pour environ 10% des infections nosocomiales urinaires chroniques. Nous avons montré que cette souche bactérienne exploite un moyen de socialisation supplémentaire préalable à l’adhésion des cellules aux surfaces et la sécrétion d’une matrice extracellulaire, les communautés flottantes. Les deux porines de P. stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, soutiennent la formation des communautés flottantes en s’auto-associant à travers leurs boucles extracellulaires pour former des dimères de trimères (DOTs) intercellulaires. La formation des DOTs, rivetant les cellules adjacentes entre elles, est médiée par des forces électrostatiques et des interactions de type steric zipper.Les deux grands objectifs de la thèse ont été i) de caractériser les impacts environnementaux sur l’établissement et la survie des deux types de communautés formés par P. stuartii, et ii) d’empêcher la socialisation bactérienne par inhibition des DOTs de porines. Nos résultats ont montrés que des peptides mimant les résidus impliqués dans les interactions de type stérique zipper des DOTs de porines, et couplés à de la coumarine, sont prometteurs pour diagnostiquer les infections à P. stuartii. De plus, nous avons mis en avant qu’une combinaison d’antibiotiques avec certains de ces peptides est une nouvelle approche thérapeutique envisageable pour lutter contre les infections de P. stuartii. Nos résultats montrent aussi que les futurs traitements devraient être évalués sur les communautés flottantes et les biofilms adhérents, dans des conditions imitant les voies urinaires, afin d’être efficaces et potentiellement éradiquer P. stuartii. / Bacterial biofilms are multicellular communities adherent to surfaces and surrounded by an extracellular matrix. They are crucial for maintaining most of our planet’s ecosystems, but also a threat to human health. Biofilm eradication is one of the greatest challenges of modern microbiology due to their high resistance to antibiotics. In this PhD, we focused on Providencia stuartii, a Gram-negative pathogen that forms biofilms in the human urinary tract and is responsible for about 10% of hospital-acquired urinary tract infections. P. stuartii exploits an additional means of socialization, forming floating communities of cells (FCCs), that later sediment and adhere onto surfaces yielding surface-attached biofilms (SABs). The two porins of P. stuartii, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, are involved in FCC formation by self-association into intercellular dimers of trimers (DOTs). The main driving force behind DOT formation is electrostatic attraction, yet the DOT structure is locked-in by steric zipper interactions between facing extracellular loops.The two main objectives of this PhD were (i) to characterize the environmental impacts on the establishment and survival of the two type of socialized communities formed by P. stuartii, and (ii) to inhibit bacterial socialization by targeting porin DOTs. Our results reveal that peptides featuring residues involved in the steric zipper interaction of DOTs, and coupled with coumarin, are promising lead compound to diagnose P. stuartii infections. In addition, we tested combinations of antibiotics with some of these peptides and results suggest that is was a new therapeutic approach that can be envisaged to fight against P. stuartii infections. Future treatments should be evaluated on FCCs and SABs in conditions mimicking urinary tract, to be efficient and potentially eradicate P. stuartii.

La contamination des environnements aquatiques par les antibiotiques et les bactéries antibio-résistantes est une préoccupation majeure à l'échelle mondiale. Les rejets de stations d'épurations (STEPs) et les ruissellements ou lessivages de sols sont les principales voies d'entrées de ces contaminants dans les eaux de surface. Afin de mieux comprendre le devenir des antibiotiques et des populations bactériennes indicatrices de contamination fécale (Escherichia coli, Enterococcus), ces contaminants ont été étudiés le long de deux continuums : (i) centre de soins - STEP - rivière et (ii) exploitation bovine - zone urbaine. Le développement d'une méthode analytique multi résidu (LC/MS/MS) a permis de détecter les concentrations de 34 molécules d'antibiotiques dans les eaux des deux continuums pour des valeurs seuils de l'ordre du nanogramme par litre. En parallèle à ces analyses chimiques, la structure des populations de bactéries fécales isolées des eaux ont été caractérisées sur la base de l'antibio-résistance, la distribution des groupes phylogénétiques A, B1, B2 et D, l'occurrence d'intégrons, des facteurs de virulence pour E. coli ; et de la diversité d'espèces, des profils de résistance aux antibiotiques et des gènes codant la résistance pour Enterococcus. L'étude des deux continuums indique que les antibiotiques retrouvés ne sont pas les antibiotiques majoritairement prescrits (pénicillines), mais les molécules les plus stables dans les eaux (quinolones, sulfamides, macrolides). Toutefois les concentrations (1ng.L-1 à 100ng.L-1) sont insuffisantes pour exercer une pression de sélection sur les bactéries antibio-résistantes. L'usage des sols, la proximité des sources et les pratiques d'élevage ont un impact sur (i) les niveaux de contamination en antibiotiques et bactéries fécales, et (ii) la structure des populations d'E. coli et d'Enterococcus circulantes dans les eaux. Des souches d'E. coli et d'Enterococcus d'origine hospitalière disparaissent le long du continuum au profit d'autres souches mieux adaptées à l'environnement. Des premiers essais de modélisation à l'aide du modèle conceptuel GR montre également l'importance des flux d'E. coli antibio-résistantes lors des périodes de ruissellements fréquents (hiver) à l'échelle d'un bassin versant dont l'occupation des sols est soumis à une pression humaine majoritaire.

Face à l'apparition grandissante de souches bactériennes multi-résistantes à l'arsenal d'antibiotiques actuels, les thiopeptides antibiotiques, bien que connus depuis plus de 60 ans, suscitent actuellement un fort regain d'intérêt. En effet, cette classe de molécules présente une forte activité antibiotique contre des souches bactériennes résistantes et multirésistantes, et met en œuvre deux modes d'inhibition originaux de la synthèse protéique encore inexploités en thérapie antibiotique humaine. Leur développement pharmacologique est en particulier freiné par la difficulté de préparation de ces molécules très complexes. L'élaboration d'une stratégie innovante de synthèse de la partie la plus complexe de ces molécules, le cœur hétérocyclique est étudiée dans ce travail. Cette approche repose sur l'étude et la valorisation de nouvelles méthodologies de fonctionnalisation directe des liaisons C-H et C-X de mono- et bis-thiazoles avec une large gamme d'hétéroaromatiques. Sa viabilité est démontrée par la préparation du cœur hétérocyclique commun aux amythiamicines.

Face à l’apparition grandissante de souches bactériennes multi-résistantes à l’arsenal d’antibiotiques actuels, les thiopeptides antibiotiques, bien que connus depuis plus de 60 ans, suscitent actuellement un fort regain d’intérêt. En effet, cette classe de molécules présente une forte activité antibiotique contre des souches bactériennes résistantes et multirésistantes, et met en œuvre deux modes d’inhibition originaux de la synthèse protéique encore inexploités en thérapie antibiotique humaine. Leur développement pharmacologique est en particulier freiné par la difficulté de préparation de ces molécules très complexes. L'élaboration d'une stratégie innovante de synthèse de la partie la plus complexe de ces molécules, le cœur hétérocyclique est étudiée dans ce travail. Cette approche repose sur l'étude et la valorisation de nouvelles méthodologies de fonctionnalisation directe des liaisons C-H et C-X de mono- et bis-thiazoles avec une large gamme d’hétéroaromatiques. Sa viabilité est démontrée par la préparation du cœur hétérocyclique commun aux amythiamicines. / Due to the emergence of multiresistant bacterial strains to standard antibacterial treatments, thiopeptides antibiotics are actually highly considered, though they are known for 60 years. They show an excellent antibiotic activity against multiresistant bacterial strains, and implement two originals inhibition mechanisms of protein synthesis, still unemployed in human therapy. However, the difficulty to prepare these complex macromolecules limits their pharmacological development. The development of a new strategy to synthetize the most complicated part of these macromolecules, their heterocyclic core, is studied here in. This approach is based on the study and the exploitation of novel direct C-H and C-X transition-metal-catalyzed couplings of mono- and bithiazoles units with a broad panel of heteroaromatics. Its viability is here demonstrated trough the multi-step synthesis of the common heterocyclic core of amythiamicins.

Notre recherche étudie la situation dans laquelle un monopole développe un nouvel antibiotique faisant partie d'une même famille qu'un antibiotique déjà mis en marché par une industrie générique. L'interdépendance entre les deux antibiotiques est due à la présence d'un réservoir commun d'efficacité antibiotique. En modélisant celui-ci comme une ressource non renouvelable, nous comparons les incitatifs économiques d'innovation et de vente du monopoleur (qui est titulaire du brevet du nouvel antibiotique) au cas socialement optimal. Nous basons notre analyse intertemporelle sur un modèle bioéconomique simplifié ainsi que sur le contrôle optimal. Nous étudions différents outils économiques pouvant servir à induire une utilisation simultannée socialement optimale des deux antibiotiques. Les résultats montrent une divergence des incitations privées et socialement optimales quant au positionnement d'un nouvel antibiotique ainsi qu'à sa gestion intertemporelle, cette dernière pouvant être corrigée par un système de taxation encadrant l'utilisation des deux antibiotiques.

Les hormones et les antibiotiques administrés aux animaux d'élevage peuvent contaminer les terres agricoles et parfois les plantes lors de l'épandage du fumier. Pour déterminer les concentrations d'antibiotiques dans les fumiers de ferme, il est important d'élaborer une méthode d'extraction et de détection fiable, rapide et peu coûteuse. Dans la présente étude, des méthodes d'extraction liquide et les ultrasons ont été employés pour extraire l'oxytétracycline (OTC), la chlortétracycline (CTC) et la tylosine (TYL) dans quelques fumiers de ferme enrichis en OTC, CTC et TYL. Plusieurs paramètres ont été analysés pour optimiser les méthodes d'extraction d'antibiotiques développées par Blackwell et al. (2004b) : la longueur d'onde de détection, la dégradation des antibiotiques dans le méthanol, le type de fumiers, le temps de contact entre l'antibiotique et le fumier, la concentration en solutés, le volume de la solution extractive, la température d'extraction et le type de méthode SPE (Solid phase extraction). La détection a été effectuée par LC-UV. Après un ajout de 20 ppm d'antibiotiques, les taux d'extraction de l'OTC, de la CTC et de la TYL étaient respectivement de 79,4 ± 0,4 %, 58,9 ± 1,3 %, 40,7 ± 1,5 % pour le fumier de porc frais et de 72,2 ± 10,8 %, 40,2 ± 3,7 % et 49,6 ± 4,2 % pour le fumier de bovin de boucherie frais. Quant au fumier lyophilisé, les taux d'extraction étaient de 81,7 ± 32,3 % et de 55,7 ± 4,7 % pour l'OTC et la CTC respectivement. D'autres techniques ont été testées à savoir l'ELISA, le LC-MS et le FT-NIR. L'utilisation de l'ELISA pour la détection de CTC et de TYL est possible, mais la variabilité entre les répétitions est élevée. Des enrichissements allant de 1,4 à 75 ppm en CTC dans des fumiers préalablement lyophilisés et broyés à 1mm ont été analysés par FT-NIR (Fourier transform near-infrared). Des régions spécifiques ont été sélectionnées et le modèle de régression PLS (Partial least square) a permis la prédiction des données (validation). Selon les lignes directrices interprétant des indices de précision (r², RPD, RER), le FT-NIR peut être utilisable pour la plupart des applications, car sa classification est acceptable et son filtrage non précis.

Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) de la famille SXT/R391 sont reconnus pour leur rôle prépondérant dans la propagation de la résistance aux antibiotiques parmi des populations de Gammaproteobactéries, en particulier chez Vibrio cholerae, l’agent pathogène causant le choléra. Ces éléments génétiques autonomes possèdent tous les gènes nécessaires à leur dissémination au sein d’une population bactérienne et s’intègrent normalement dans un site précis du chromosome bactérien. L’activateur SetCD et la machinerie de conjugaison encodée par les ICE permettent non seulement leur transfert conjugatif, mais également la mobilisation d’îlots génomiques, les MGI (mobilizable genomic islands). Lorsque leur transfert est enclenché sans excision au préalable, les MGI et les ICE peuvent mobiliser plusieurs centaines de kb d’ADN chromosomique adjacent à leurs sites d’insertions. Cet ADN mobilisé peut alors recombiner avec le génome de la cellule réceptrice, aboutissant à des remplacements d’allèles. En plus du squelette de gènes conservés de cette famille d’ICE, ces éléments portent une cargaison d’ADN variable qui peut coder pour des fonctions adaptatives potentiellement avantageuses pour l’hôte bactérien. Les ICE SXT/R391 portent également les gènes codant pour un système de recombinaison qui promeut la diversité de la famille en générant des ICE hybrides. Ces éléments mobiles sont extrêmement stables dans les populations bactériennes. Cette stabilité est attribuable à leur intégration au chromosome et à plusieurs composantes qu’ils contiennent, par exemple les systèmes toxine-antitoxine de la cargaison d’ADN variable ou encore le système conservé de partition des éléments excisés. La majorité des gènes portés par les ICE SXT/R391 est contrôlée par leur système de régulation qui se situe au cœur de ce projet doctoral. Ce système de régulation comprend SetR, le répresseur responsable du maintien de l’état quiescent dans lequel l’ICE est intégré au chromosome et est propagé verticalement dans la population bactérienne, c’est-à-dire au rythme de la réplication chromosomique et de la division cellulaire. Lorsque l’ADN bactérien est endommagé, il y a activation de la réponse SOS de réparation de l’ADN par RecA, un facteur de l’hôte, qui induit parallèlement l’autoprotéolyse de SetR, levant ainsi la répression exercée sur les gènes setC et setD. Ces derniers codent pour SetCD, le complexe activateur des ICE SXT/R391 qui active l’expression de la machinerie de conjugaison ainsi que d’autres fonctions codées par ces ICE. Ce projet doctoral a permis l’identification de nouvelles composantes importantes pour la régulation des ICE SXT/R391. Premièrement, nous avons généré par génie génétique plusieurs mutants qui ont permis de caractériser CroS par des essais de transfert conjugatif, de PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) et d’expression avec le gène rapporteur lacZ. Nous avons déterminé que CroS est un régulateur transcriptionnel qui, avec SetR, constitue un interrupteur génétique permettant l’induction du transfert conjugatif dépendante de RecA. Nous avons également validé par gel à retardement la liaison par SetR et CroS d’un site opérateur additionnel. Des essais β galactosidase ont montré que ce site contribue à la répression des gènes croS, setC et setD. De plus, les résultats de ce projet doctoral ont clarifié certains points concernant la régulation par SetCD. Des essais d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à la digestion avec une exonucléase (ChIP-exo) combinés avec le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et la détermination des sites +1 d’initiation de la transcription (5’-RACE et extension d’amorces) ont permis d’établir le régulon de SetCD chez les ICE SXT/R391 et chez les MGI qu’ils mobilisent. La nécessité de SetCD dans la cellule réceptrice pour qu’il y ait intégration de l’ICE de manière site-spécifique dans l’extrémité 5’ du gène prfC a été mise en évidence à l’aide de la construction de mutants, d’essais de transfert conjugatif, de buvardage de type Southern, d’électrophorèse en champs pulsés et de PCR en temps réel. Nous avons également observé, grâce à des essais de PCR quantitatif et d’activité β galactosidase, une boucle de rétroaction positive médiée par l’activation de l’excision et de la réplication de l’ICE par SetCD. En somme, ce projet doctoral a mené à une meilleure compréhension des composantes et des mécanismes en scène pour la gouvernance de cette famille d’ICE qui sont, entres autres, d’importants vecteurs de la dissémination des résistances aux antibiotiques.

Suite à leur utilisation, les médicaments sont souvent partiellement métabolisés; ainsi ces substances pharmaceutiques et/ou leurs métabolites sont rejetés continuellement dans les eaux usées. Leur présence et accumulation dans les eaux naturelles constituent une pollution émergente conduisant à la perturbation des écosystèmes et l'accroissement de mal fonctionnement de la reproduction des espèces aquatiques telles que les poissons. Parmi les polluants pharmaceutiques, les antibiotiques méritent une attention particulière parce qu'ils sont utilisés en grande quantité d'une part et constituent des molécules biologiquement actives pouvant interagir avec des cibles biologiques spécifiques conduisant à l'apparition du phénomène de résistance des micro-organismes potentiellement pathogènes tels que les bactéries (vis-à-vis de ces médicaments employés pour les combattre). Une action préventive est donc indispensable pour réduire leur présence dans les milieux aquatiques naturels. Dans ce travail nous avons appliqué le procédé électro-Fenton (EF), une méthode indirecte d'oxydation électrochimique très performante, à la dégradation des polluants pharmaceutiques sélectionnés, trois antibiotiques couramment utilisés : le sulfaméthoxazole (SMX), l'amoxicilline (AMX) et sulfachloropyridazine (SCP). Le traitement des solutions aqueuses de ces antibiotiques été réalisé en milieux aqueux acide à l'aide des radicaux hydroxyles générés électrochimiquement. Les radicaux hydroxyles sont produits in situ à courant constant dans une cellule électrochimique non divisée, munie d'une cathode tridimensionnelle de grande surface spécifique (feutre de carbone) et d'une anode de Pt ou de BDD afin de suivre la cinétique d'oxydation avec les radicaux hydroxyles et la minéralisation de leurs solutions aqueuses. Ces radicaux sont générés à travers la réaction de Fenton : H2O2 + Fe2+ + H+ → Fe3+ + H2O + *OH dans laquelle les réactifs générés (H2O2) ou régénéré (Fe2+ en tant que catalyseur) électrocatalytiquemment. L'influence des différents paramètres sur la cinétique de dégradation des antibiotiques et sur la cinétique de minéralisation des solutions d'antibiotiques a été étudiée. L'effet co-catalytique des ions Cu2+ a été aussi examiné. Les radicaux hydroxyles formés sont des oxydantes très puissants et réagissent sur les antibiotiques en question conduisant à leur minéralisation. L'étude cinétique montre que la dégradation oxydative des trois antibiotiques suit une cinétique de réaction du pseudo-premier ordre, avec des temps de dégradation assez courts. Par exemple, avec une anode de Pt, l'oxydation complète des molécules SMX, AMX et SCP a été achevée en moins de 15 min à 300 mA. Afin d'établir les voies de dégradation avec les radicaux hydroxyles, les intermédiaires aromatiques, les acides carboxyliques formés ainsi que les ions inorganiques libérés dans la solution lors du traitement ont été identifiés et leur évolution dans le temps a été suivie. Les valeurs des constantes de vitesse des réactions entre les *OH et les antibiotiques et leurs intermédiaires ont été déterminés par la technique de cinétique de compétition à l'aide d'un composé de référence, l'acide p-hydroxybenzoϊque. L'efficacité du procédé d'oxydation anodique (OA) avec une anode Pt et BDD à titre comparatif avec le procédé électro-Fenton a été aussi étudiée. L'efficacité de minéralisation des solutions aqueuses d'antibiotique à été évaluée par mesure du carbone organique total (COT). Le suivi de la toxicité lors du traitement des solutions d'antibiotiques par la méthode Microtox®, (une méthode basée sur la mesure de la luminescence des bactéries marines Vibrio fischeri) a montré la formation des intermédiaires plus toxiques que les molécules mères. L'ensemble des résultats obtenus confirme l'efficacité du procédé électro-Fenton pour la dépollution des effluents aqueux chargés d'antibiotiques.

Mes divers thèmes de recherche concernent la traduction qui, au sens large du terme, peut être considérée comme la production de biomolécules à rôle structural et/ou fonctionnel à partir de l'information contenue dans les gènes. Pour ma part je me suis intéressé tout d'abord à l'aminoacylation des ARNs de transfert (ARNt) ainsi qu'à la formation de certaines bases modifiées qui les composent. En effet, l'ARNt est un acteur clé de la synthèse protéique car c'est de l'exactitude de son aminoacylation que dépend grandement la fidélité de la synthèse protéique. <br />Chez la levure, il existe un complexe multi-synthétasique simplifié formé de la MetRS, la GluRS et Arc1p, une protéine dont le gène est en interaction non seulement avec la machinerie de transport nucléocytoplasmique mais également celle de la biosynthèse des ARNts. Ces découvertes m'ont amené à étudier le rôle de Mtr10p dans les échanges nucléocytoplasmiques et un possible lien avec le transport des ARNts. Les acquis lors de ces travaux auront été utiles dans l'étude du rôle d'Efl1p, une GTPase de type EF-2 impliquée dans une étape tardive (cytoplasmique) de la biogenèse de la grande sous-unité ribosomale 60S.<br />Grâce aux travaux antérieurs, j'ai pu me familiariser avec de nombreuses techniques biochimiques et génétiques qui s'avèreront précieuses pour mon projet d'étude de la localisation et de l'interactome des aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). En effet, il n'est pas concevable que le couple ARNt/aaRS évolue de façon autonome dans la cellule mais il doit interagir / communiquer d'une part avec les acteurs directs de la synthèse protéique et, d'autre part, avec des facteurs intervenant dans d'autres processus cellulaires. Trouver, comprendre et étudier les spécificités de divers organismes fournira peut-être de nouvelles pistes à but thérapeutique restées insoupçonnées jusqu'alors.<br />Un autre aspect de mon projet, toujours relié aux aaRS, traitera d'un système atypique de la machinerie traductionnelle qui est celui des voies de formation des aminoacyl-ARNts dans les systèmes asparagine et glutamine. En effet, un certain nombre d'organismes, pathogènes de l'homme, ne possèdent pas d'aaRS (AsnRS, GlnS) pour l'un et/ou l'autre de ces acides aminés et pallient à cette absence par l'utilisation d'une voie indirecte pour la formation de ces aminoacyl-ARNts. L'étude de ces voies est non seulement intéressante sur les plans évolutifs et relation structure-fonction ARN-protéine mais également d'un point de vue appliqué, certes à plus long terme, dans le but d'enrayer ces voies de biosynthèse amenant ainsi des cibles alternatives pour des molécules de type antibiotique. Cet aspect est d'autant plus important qu'à l'heure actuelle apparaissent des phénomènes de résistance aux antibiotiques posant de vrais problèmes de santé publique.

Nous assistons durant ces trente dernières années à une croissance de la fréquence d'apparition des bactéries résistantes aux antibiotiques. Face à la récurrence des infections difficiles à traiter dues à ces bactéries pathogènes multi-résistantes, le renforcement de l'arsenal des antimicrobiens fait partir des préoccupations majeures de santé publique. À ce titre, une approche ethno-pharmacologique a été initiée dans le cadre d'une coopération entre le laboratoire de pharmacodynamie biochimique (Université Félix Houphouët-Boigny, Côte d'Ivoire) et le laboratoire universitaire de biodiversité et d'écologie microbienne(Université de Bretagne Occidentale, France). Dans cette approche, les habitudes traditionnelles d'automédication par les plantes médicinales ont été exploitées pour identifier de nouvelles sources de composés antimicrobiens. Dans une première partie de cette présente étude, une investigation sur les résistances bactériennes en Côte d'Ivoire a montré non seulement une évolution de la fréquence d'apparition des bactéries résistantes aux antibiotiques dans le temps, mais aussi une évolution de ces souches résistantes vers des différents types de multi-résistances. Dans la seconde partie, Morinda morindoides, une plante médicinale ivoirienne, a suscité notre attention pour la recherche de substances antimicrobiennes. À partir de 18 extraits des différents organes de cette plante, des tests d'activité antimicrobienne ont permis de justifier son utilisation en médecine traditionnelle. L'extrait à l'acétonitrile de la racine qui affiche l'activité la plus intéressante a servi pour isoler et caractériser 12 phytomolécules antimicrobiennes dont une se distingue par sa structure chimique originale, la morindoïdine. En plus de leurs paramètres antimicrobiens, d'autres propriétés biologiques de ces substances ont été évaluées telles que, leur pouvoir antioxydant, leur cytotoxicité, leur activité hémolytique et leur cible moléculaire. Cette évaluation a révélé un mode d'action sans doute proche de celui des quinolones.