Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-10-20T17:43:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Priscilla Carolinne Bagano Vilas Boas.pdf: 1837183 bytes, checksum: 784433b804bcd85b98b7c4fdf2b6a40f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-20T17:43:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Priscilla Carolinne Bagano Vilas Boas.pdf: 1837183 bytes, checksum: 784433b804bcd85b98b7c4fdf2b6a40f (MD5) / FAPESB / Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico de diversas doenças crônicas infecto-contagiosas em diferentes espécies de mamíferos, sendo a linfadenite caseosa a mais importante delas, encontrada em caprinos e ovinos. Esta patologia leva à formação de granulomas nos linfonodos superficiais e internos, e em alguns órgãos como os pulmões, fígado e baço, acarretando em diversas perdas econômicas para a caprino-ovinocultura. Neste trabalho, camundongos BALB/c foram imunizados com proteínas de um antígeno somático hidrofóbico extraído de uma linhagem virulenta de C. pseudotuberculosis. Os esplenócitos obtidos foram fusionados com células mielomatosas da linhagem SP2/0 e os hibridomas produzidos através desta fusão foram submetidos a testes de ELISA para identificação dos clones produtores de anticorpos específicos para o antígeno somático hidrofóbico. Foram selecionados quatro clones, posteriormente injetados intraperitonialmente em camundongos BALB/c, para produção de líquido ascítico. Os líquidos ascíticos foram testados por western blotting, usando o antígeno somático hidrofóbico submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 12,5 e 15%. Em SDS-PAGE a 12,5% todos os líquidos obtidos reconheceram duas bandas, com pesos moleculares estimados em 31 e 34 kDa e o clone 3-12C CL9A, também reconheceu uma banda com peso molecular de 19 kDa. Em SDS-PAGE a 15%, o clone 1-6G CL10 manteve o reconhecimento de apenas duas bandas de 31 e 34 kDa. Os demais apresentaram reconhecimento de outras bandas, além destas duas. Bandas proteicas com pesos moleculares similares aos aqui encontrados, já foram descritas na literatura em estudos realizados com soro de caprinos e ovinos infectados por C. pseudotuberculosis. Os anticorpos produzidos neste trabalho possuem potencial para utilização em imunoensaios, visando o aprofundamento de estudos sobre a relação micro-organismo hospedeiro, assim como a possibilidade de produção de um kit para o diagnóstico da infecção

Submitted by ALINE TROMBINI RODRIGUES null (aline.trombini.rodrigues@hotmail.com) on 2016-04-05T00:19:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Aline Trombini Rodrigues.pdf: 2179862 bytes, checksum: 92ed01e81ff3781b11363c36b0c2268f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-06T16:56:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rodrigues_at_me_bot.pdf: 2179862 bytes, checksum: 92ed01e81ff3781b11363c36b0c2268f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-06T16:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodrigues_at_me_bot.pdf: 2179862 bytes, checksum: 92ed01e81ff3781b11363c36b0c2268f (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / O conhecimento dos fenótipos eritrocitários de doadores de sangue é um procedimento essencial na prática transfusional, o qual aumenta a eficácia e a segurança do ato transfusional, além de prevenir a aloimunização. Os antígenos eritrocitários são clinicamente significantes na medicina transfusional, por serem altamente imunogênicos e pela possibilidade de causarem reações transfusionais, aloimunizações, anemias hemolíticas autoimunes e doença hemolítica do feto e recém-nascido (DHFRN). A incidência de aloimunização à antígenos eritrocitários é alta em pacientes politransfundidos, principalmente nos portadores de hemoglobinopatias e em pacientes submetidos a transplantes. O objetivo deste trabalho foi elaborar um banco de doadores de hemácias com diferentes fenótipos e painéis contendo soros e plasmas com anticorpos de importância clínica para atender e agilizar a transfusão de receptores de sangue alossensibilizados. Foi realizado um levantamento dos doadores de sangue do Hemocentro de Botucatu fenotipados utilizando registros de livros de bancada do ano de 2001 a 2007 e do sistema informatizado (Sistema de Banco de Sangue – SBS), através do qual encontramos um total de 6.039 doadores fenotipados, sendo que 2.700 tinham apenas registro nos livros de bancada. Das 31.942 amostras de doadores de sangue em que foram realizadas a Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) no período do nosso estudo, 77 apresentaram a PAI positiva na rotina laboratorial. Para a elaboração do Banco de Doadores Fenotipados, foram cadastrados e validados (duas ou mais fenotipagens realizadas) no sistema informatizado SBS, 7.074 antígenos de todos os sistemas de grupos sanguíneos. Desses, 4.748 (67,1%) antígenos pertenciam ao sistema Rh e 2.326 (32,9%) pertenciam a outros sistemas de grupos sanguíneos. Dos antígenos cadastrados (7.074), 2.396 (89%) antígenos não tinham nenhum histórico de fenotipagens anteriores e 304 (11%) já possuíam histórico e foram validados. De um total de 31.942 doadores de sangue, 77 apresentaram a PAI positiva. Para elaboração da soroteca/plasmateca constituída por painéis de soros/plasmas raros, realizamos novamente a PAI dessas amostras, seguida da Identificação de Anticorpos Irregulares (IAI), do tratamento com Dithiothreitol (DTT), se necessário, e da titulação de anticorpos. Destas 77 amostras de PAI positiva, 21 constituíram a soroteca/plasmateca, pois consideramos como critérios de inclusão: a importância clínica, a especificidade e o título dos anticorpos (reatividade com diluição maior que 1/2). Do total de anticorpos identificados (77), os de maior prevalência foram: anti-D, anti-E, anti-Dia, anti-M, anti-D+C e anti-Lea. Assim sendo, concluímos que é de suma importância a elaboração de um Banco de Doadores de Sangue com fenótipos menos frequentes, para que os pacientes em esquema de transfusão de concentrado de hemácias possam ser transfundidos de modo mais compatível possível, prevenindo deste assim a aloimunização a antígenos eritrocitários e otimizando a prática transfusional. É essencial também a elaboração de uma soroteca/plasmateca constituída de painéis de soros/plasma com anticorpos de importância clínica e, com isso, proporcionar além de uma maior agilidade na triagem da bolsa de concentrado de hemácias compatível, uma maior segurança para o paciente transfundido. / The knowledge of the erythrocyte phenotypes of blood donors is an essential procedure in transfusion practice, which increases the effectiveness and safety of transfusion Act, besides preventing the aloimunização. Erythrocyte antigens are clinically significant in transfusion medicine, because they are highly imunogênicos and the possibility of causing transfusional reactions, autoimmune hemolytic anemia, aloimunizações and hemolytic disease of the fetus and newborn (DHFRN). The incidence of alloimmunization to the erythrocyte antigens is high into politransfundidos patients, especially in patients with hemoglobinopathies and in patients undergoing organ transplants. The aim of this work was to develop a bank of red blood donors with different phenotypes and panels containing serums and plasmas with antibodies of clinical importance to attend and simplify the transfusion of blood alossensibilizados receivers. We manage a survey of blood donors from the Blood of Botucatu, using bench books records of the year 2001 to 2007 and computerised system (blood bank system SBS), through which we found a total of 6039 donors in conclusion, which only 2700 had records on the books. A total of samples (31942) of blood donors that were collected from the research of irregular antibodies (RAI) during the period of our study, 77 presented the RAI in laboratory routine. For the preparation of the donor bank in conclusion have been registered and validated (two or more fenotipagens made) in the computerised system SBS, 7074 antigens in every system of blood groups. Of these, 4748 (67.1) antigens belonged to the Rh system and 2326 (32.9) belonged to other blood group systems. Of registered antigens (7,074), 2396 (89) antigens had no history of previous fenotipagens and 304 (11) already had a history and have been validated. A total of 77 31942, blood donors showed the positive RAI. For the preparation of sorotecaplasmateca consisting of sorosplasmas rare panels carry out again the RAI of those samples, followed by the identification of irregular antibodies (IAI), treatment with Dithiothreitol (DTT) if necessary and titration of antibodies. Of these 77 samples were positive RAI, 21 formed the sorotecaplasmateca, because we believe as inclusion criteria: the clinical importance, the specificity and the title of antibodies (reactivity with dilution greater than 1/2). A total of identified antibodies (77), the most prevalent were: anti-D, anti-E, anti-Dia, anti-M, anti-D+C e anti-Lea . Therefore, we conclude that it is of the utmost importance to develop a Bank of blood donors with less frequent phenotypes, so that patients in transfusion of packed red blood cells, can be transfused as compatible as possible, preventing the alloimmunization to erythrocyte antigens and optimizing transfusion practice. It is essential also to draw up a sorotecaplasmateca consisting of sorosplasma panels with antibodies of clinical importance, for in this way we provide in addition to greater agility in the scholarship screening of packed cells compatible, greater safety for the patient transfused.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-25Bitstream added on 2014-06-13T20:03:05Z : No. of bitstreams: 1 blau_l_dr_arafcf.pdf: 2905737 bytes, checksum: c4bc675e22ee081d46b59428973bb73a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas ou Tripanossomíase americana é ainda um dos maiores problemas endêmicos na América Latina desde sua descoberta 100 anos atrás. Em 2006, havia aproximadamente 7,6 milhões de casos de infecção por Trypanosoma cruzi nos 21 países latino americanos. Cerca de 90 milhões de pessoas estão sobre o risco de contrair a infecção. O número de mortes e novos casos atribuídos a essa doença são respectivamente 21.000 e 200.000 no ano de 2000. Dois fármacos são usados particularmente para tratar esta doença, nifurtimox e benznidazol que são ativos somente na fase aguda da doença. No Brasil, somente benznidazol é disponível no mercado, por causa da resistência do nifurtimox às cepas de T. cruzi. Ambos os fármacos causam efeitos adversos graves que incluem polineuropatia periférica, agranulocitose e trombocitopenia púrpura. Embora o papel exato do sistema imune na patogenia não é totalmente entendido, é aceito que o sistema imune tenha um papel importante na proteção da infecção parasitária. Antígenos produzidos por T. cruzi afetam a função celular e induzem uma resposta caótica no hospedeiro, como a transialidase (TS) que é essencial para sobrevivência do parasita. TS é uma enzima envolvida na invasão de células hospedeiras mamíferas, na proteção contra componentes do sistema complemento e induz apoptose severa nas células do sistema imune, e que a administração de anticorpos é capaz de neutralizar esta enzima. Outro antígeno, J-18, um derivado recombinante da glicoproteína gp82, é capaz de se ligar à mucosa gástrica e isto é crucial para o estabelecimento da infecção oral. Então, um anticorpo contra esta glicoproteína poderia ser útil para inibir a invasão na mucosa gástrica. Cruzipaína é outra enzima importante do T. cruzi e suas funções parecem ser participar da nutrição, mecanismos de defesa e replicação do parasita... / Chagas disease or American trypanosomiasis is still one of the major endemic problems in Latin America since its discovery 100 years ago. In 2006, there were approximately 7.6 million cases of Trypanosoma cruzi infection in 21 Latin American countries. Around 90 million people are at risk of contracting the infection. The number of deaths and new cases attributed to this disease are respectively 21,000 and 200,000 in the year 2000. Two drugs are particularly used to treat this disease; nifurtimox and benznidazol are active only in its acute phase. In Brazil, just benznidazol is available in the market, because nifurtimox resistant to T. cruzi strains. Both drugs cause severe side-effects including peripheral sensitive polyneuropathy, agranulocytosis and thrombocytopenic purpura. Although the exact role of the host immune system in the pathogenesis is not still fully understood, it is accepted that the immune system plays an important role in protection from parasitic infection. Antigen derivatives from T. cruzi affect cellular function and induce chaotic immune system host response, like trans-sialidase (TS) being essential for the parasite survival. TS is an enzyme involved in the invasion of mammalian host cells, in the protection against components of complement system and induces severe apoptose in cells of the immune system, and that antibodies administration is able to neutralize this enzyme. Another antigen, J-18, a recombinant glyprotein gp82 derivative, is able to bind to gastric mucin and this is crucial for the establishment of T. cruzi infection by oral route. Then, an antibody against this glycoprotein could be useful to inhibit the gastric mucin invasion. Cruzain is another important enzyme of T. cruzi and its functions seem to participate in nutrition, defense host mechanisms and replication of intracellular parasite. While there are no strong inhibitors against TS... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-29Bitstream added on 2015-05-14T16:58:45Z : No. of bitstreams: 1 000828932.pdf: 760604 bytes, checksum: c30674cef7dfc0506331193c0c9efe70 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido às diversas formas de apresentação clínica e aos sinais clínicos comuns com outras afecções, o diagnóstico laboratorial do CDV (Canine distemper virus) se torna necessário. A RT-PCR seguida da NESTED com amostras de urina é atualmente a técnica mais recomendada para o diagnóstico do CDV. No Capítulo 2, foi desenvolvida a técnica de One-Step-RT-qPCR utilizando o sistema de detecção Syber Green I. Foram testados e comparados três kits comerciais (Sigma®, Promega® e Qiagen®). Foi determinada a sensibilidade analítica de dois sistemas de detecção (Sistema A e Sistema B) utilizando uma curva padrão de RNA sintético. Os três kits comerciais testados detectaram o vírus em 100% das urinas provenientes de animais sintomáticos e o kit da Qiagen® mostrou melhores resultados de reação. O Sistema A detectou aproximadamente 10 cópias de RNA por microlitro e no Sistema B detectou 100 cópias de RNA por microlitro na RT-qPCR e 10 cópias por microlitro quando seguida da NESTED-qPCR. No Capítulo 3 foram desenvolvidos três imunoconjugados de microesferas de poliestireno (MP) utilizando anticorpos policlonais hiperimunes anti-CDV (IgY, IgG e Proteína A+IgG) para o preparo de RNA e aplicação na RT-qPCR. A aplicação dos conjugados foi comparada ao método convencional de extração de RNA por kit comercial. Os conjugados foram padronizados e a sensibilidade analítica foi determinada através de curva padrão de RNA sintético. A sensibilidade diagnóstica foi determinada utilizando-se conjugado com IgY, MP sem anticorpos conjugados e urina adsorvida diretamente nos tubos de qPCR / The diagnosis of canine distemper is usually based on clinical suspicion of the disease. However, due to the different clinical forms of the disease and other disorders common to clinical signs, the laboratory diagnosis is necessary. The RT-PCR followed by NESTED is currently the method used to diagnosis of CDV (Canine Distemper Virus). The Chapter 2 aimed to standardized the technique of One-Step RT-qPCR-using Syber Green I system. Three commercial kits (Sigma®, Promega® and Qiagen®) were tested and compared. Analytical sensitivity of two detection systems (System A and System B) was determined using a standard curve. The three commercial kits tested detected the virus in 100% of samples from symptomatic dogs and the kit of Qiagen® showed better results. The System A detected approximately 10 RNA copies/μL and System B detected approximately 100 RNA copies/ μL in RT-qPCR and 10 RNA copies/ μL when followed by NESTED-qPCR. In Chapter 3 three immunoconjugates were developed with polystyrene microspheres (PM) using polyclonal hyperimmune anti-CDV antibody (IgY, IgG and protein A+IgG) to prepare RNA to canine distemper molecular diagnosis and comparison with the conventional method of RNA extraction by commercial kit. Conjugates were standardized and the analytical sensitivity was determined by standard curve. The diagnostic sensitivity was determined using IgY-conjugated, PM without conjugated antibodies and urine adsorption directly qPCR in tubes / FAPESP: 2011/50889-9

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:24Z : No. of bitstreams: 1 000840898.pdf: 3064925 bytes, checksum: 0f2210df4ef49e4de9b0eea0e8b112eb (MD5) / As infecções por MRSA podem ser consideradas um problema de saúde pública, com alta taxa de mortalidade. Desta maneira, com a ampla disseminação do MRSA é necessário adotar programas de vigilância que avaliem o perfil de sensibilidade dos isolados, além estimular o desenvolvimento tecnológico objetivando métodos mais rápidos e confiáveis que antecipem a escolha da terapêutica mais adequada propondo métodos de prevenção e vacinas para o avanço no controle da infecção hospitalar. Diante deste desafio este projeto tem como objetivo a caracterização de anticorpos monoclonais anti-MRSA obtidos por protocolos de imunização clássica e a obtenção de outros anticorpos com método de imunização subtrativa. Foram utilizados 10 camundongos Balb/C que receberam como tolerógeno proteínas de cepas de E.coli e MSSA associados a 100mg/kg/d de ciclofosfamida (CFM) em D1, D2,D3,D15, D16 e D17. Em D+31, 38, 45 e 54 foram feitas injeções de 50μg de proteínas da cepa de MRSA, anteriormente genotipada e confirmada a presença do gene mec A. Foram preparados extratos antigênicos por 3 métodos diferentes: fervura, morte à temperatura ambiente seguida de filtração 0,22μm e morte à temperatura ambiente e exposição ao banho ultrassônico. Pelo método de fervura obteve-se em média 5,31mg/mL enquanto que as técnica de morte a TA ambiente, filtrado ou submetido ao banho ultrassônico obtiveram em média uma concentração protéica duas vezes maior indicando a existência de proteínas termolábeis. Foi identificado uma taxa de mortalidade de 30% nos animais provavelmente associado ao uso da CFM. Foram realizadas 7 fusões celulares com a construção de 4.402 híbridos com uma taxa de eficiência de fusão de 2,42 vezes menor do que aquela obtida nos protocolos de imunização clássica. Dois hibridomas foram escolhidos para a clonagem pelo método de diluição limitante, cuja caracterização imunoquímica identifica... / The MRSA infections are considered a public health problem, with a high mortality rate. Thus, with the wide spread of MRSA it's necessary to embrace monitoring programs to evaluate the sensitivity profile of the isolates, as well as to stimulate technological development aiming faster and more reliable methods to anticipate the choice of the most appropriate therapy by proposing methods of prevention and vaccines to advance the control of hospital infections. Therefore, this study aims the characterization of anti-MRSA monoclonal antibodies obtained by classical immunization protocols and the obtaining of other antibodies with the subtractive immunization method. We used 10 Balb/C mice that received as tolerogen proteins of strains of E. coli and MSSA associated with 100mg/kg/d of cyclophosphamide (Cy) in D1, D2, D3, D 15, D16 and D17. On D+31, 38, 45 and 54 we made injections of 50 μg of the MRSA strain protein, previously genotyped and with confirmed presence of mec A. We prepared antigenic extracts by 3 different methods: boiling, death at ambient temperature followed by 0.22 μm filtration and death at ambient temperature and exposure to ultrasonic wash.The boiling method resulted on average 5.31mg/mL, whereas the technique of death at ambient temperature, filtered or exposed to ultrasonic wash culminated on average in a protein concentration two times higher, indicating the existence of heat labile proteins.We identified a mortality rate of 30% in the animals, which was probably associated with the use of Cy. We performed seven cellular fusions with the construction of 4.402 hybrids with a fusion efficiency rate of 2.42 times smaller than that obtained in protocols of classical immunization.We selected two hybridomas for cloning by the limiting dilution method, whose immunochemical characterization identifies bands of 30 and 50 kDa. The proteomic analysis of protein bands that was recognized by the two clones confirm that the ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-18Bitstream added on 2014-11-10T11:57:30Z : No. of bitstreams: 1 000790208_20160218.pdf: 1204228 bytes, checksum: 10f416eb0759a57de353af13f253e5a5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-18T10:00:17Z: 000790208_20160218.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-18T10:01:03Z : No. of bitstreams: 1 000790208.pdf: 3676280 bytes, checksum: dafede75e9a0efb9c14bb464917e791b (MD5) / A produção de anticorpos monoclonais (mAbs) é de extrema importância na área médica, sendo considerada a grande inovação da indústria biotecnológica. O método descrito por Köhler e Milstein exige a seleção celular por vias bioquímicas através do meio HAT (meio com hipoxantina, aminopterina e timidina). Com o crescente emprego da luz na área médica este trabalho buscou avaliar o emprego do LED (abreviação de Light Emitting Diode) com comprimento de onda de 475nm na seleção das células envolvidas na produção de anticorpos monoclonais com vistas a oferecer uma nova opção na seleção de hibridomas. Culturas celulares de Mieloma Murino (NS1) e MRSA 3-75 e 4-27 em meio completo 10% SFB foram segregadas em seis grupos para cada tipo celular (12 amostras), sendo: G1: controle (não irradiado); G2: 1 J/cm2; G3: 3 J/cm2; G4: 5 J/cm2; G5: 10 J/cm2; G6: 20 J/cm2. Com vistas a determinar o comportamento das células frente ao efeito da luz, foram avaliadas a taxas de viabilidades das células por Citometria de fluxo e MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), perfil secretor dos hibridomas por ELISA e nanodrop e taxa crescimento celular pela coloração de Azul de Tripan. Os resultados mostraram que houve bioinibição de NS1 e MRSA 3-75 e 4-27 em doses superiores a 5 J/cm2 promoveram aumento da morte por necrose e apoptose tardia com supressão da produção de anticorpos (hibridomas) em todos os grupos experimentais. Os Hibridomas MRSA 4-27 apresentaram bioestimulação quanto a produção de anticorpos em 31% na dose de 1 J/cm2 porém, o MRSA 3-75 não apresentou alteração no perfil secretor. O LED no comprimento de onda de 475nm não promoveu fotoseleção de mielomas e hibridomas após exposição à luz. Mas, bioestimulou o crescimento celular (NS1) e promoveu aumento da secreção de imunoglobulinas (MRSA 4-27), principal interesse dos laboratórios de bioengenharia que utilizam esta tecnologia / The production of monoclonal antibodies (mAbs) for medicine is highly important, being considered the greatest innovation of the biotechnologic industry over the years. The method described by Köhler e Milstein demands cellular selection through biochemistry ways using HAT (culture medium with hypoxanthine, aminopterin and tymidhine). By the increasing use of lights in the medical areas, this paper searches to evaluate the application of LED (Light Emitting Diode) - wave length of 475nm - in the selection of cells involved on monoclonal antibodies production, in order to offer a new option for hybridoma selection. Cell culture of Murine Myeloma (NS1) and MRSA 3-75 and 4-27 in complete culture medium with 10% of fetal bovine serum (FBS) were separated in six groups for each cellular type (12 samples), being: G1: control group (not irradiated), G2: 1 J/cm2; G3: 3 J/cm2; G4: 5 J/cm2; G5: 10 J/cm2; G6: 20 J/cm2. To determine the behavior of cells, the following tests were made: viability tests by Flow Cytometry and MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), ELISA and Emission Spectrometry to check hydridomas’ secretory profile and Tripan blue stain to determine cellular growth rate. The results show that there were bioinstimualtion of NS1 and MRSA 3-75 and 4-27 in doses above of 5 J/cm2, which promoted the increase of death by necrosis and late apoptosis with the reduction of monoclonal antibodies production (hybridoma) in all experimental groups. The MRSA 4-27 hybridomas presented biostimulation as for the anitbodies production in 31% at the dose of 1 J/cm2, although the MRSA 3-75 didn’t present any alteration of secretory profile. The LED with wave length of 475nm didn’t promoted photoselection of hybridomas and myelomas after the exposure to light. However, it biostimulated the cellular growth (NS1) and the increased the secretion of immunoglobulins (MRSA 4-27), which is the main interest of ...

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-19T15:36:22Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Jacqueline Neres Castilho.pdf: 770755 bytes, checksum: 8366f4930177c9447816c41a265e2d81 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-26T12:36:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Jacqueline Neres Castilho.pdf: 770755 bytes, checksum: 8366f4930177c9447816c41a265e2d81 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T12:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Jacqueline Neres Castilho.pdf: 770755 bytes, checksum: 8366f4930177c9447816c41a265e2d81 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / CAPES / Os inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) além de inibirem formação da angiotensina II (Ang II) são imunoreguladores capazes de inibir a produção de citocinas proinflamatórias, como o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), assim como estimular a secreção de interleucinas (IL) anti-inflamatórias, como a IL-10. Entretanto, os efeitos desses medicamentos sobre a produção de anticorpos ainda não estão bem entendidos em camundongos normais. Portanto, os objetivos do presente trabalho é avaliar os efeitos do enalapril e do captopril sobre a resposta humoral e a produção de citocinas no modelo murino. Para se verificar a possível ação imunoreguladora dos inibidores da ECA, enalapril e do captopril, sobre a resposta humoral, foram avaliados os níveis de IgG1 e IgM anti-OVA em soros de camundongos C57Bl/6 imunizados com OVA em presença de gel de hidróxido de alumínio com ou sem tratamento com enalapril ou captopril. A IL-5 foi avaliada em soros coletados no final do experimento. A análise dos anticorpos anti-OVA e da IL-5 foi feita por ensaios imunoenzimático (ELISA), nos quais foram também incluídos soros dos animais controle, que foram injetados com salina tamponada com fosfato (PBS) e deixados sem tratamento. A análise estatística dos resultados dos anticorpos anti-OVA mostrou que não houve diferença significante nos níveis de IgG1 e IgM específicas para OVA comparando-se os animais não tratados com aqueles que foram tratados com enalapril ou captopril. A IL-5 foi detectada somente em dois dos cinco animais imunizados e não tratados e dois camundongos do grupo controle. A partir dos resultados, pode-se concluir que nem enalapril nem captopril regulam, de forma significante, a produção de IgG1 e IgM anti-OVA. Como todos os animais imunizados e tratados com enalapril ou captopril apresentaram níveis séricos de IL-5 abaixo do limite de detecção (4 pμ/mL) da reação usada para avaliá-la, não é possível afirmar que esses medicamentos inibem a produção da IL-5 sistêmica no modelo estudado. / Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors block the formation of angiotensin II (Ang II). They are also immunoregulatory drugs capable of inhibiting the production of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) as well as stimulate secretion of anti-inflammatory interleukins (IL), such as IL-10. However, the effects of these drugs on antibody production are not well understood in normal mice. Therefore, the objectives of this study are to evaluate the effects of enalapril and captopril on the humoral response and cytokine production in murine model. To verify the possible immunoregulatory action of ACE inhibitors, enalapril and captopril on the humoral response, we assessed the levels of IgM and IgG1 anti-OVA in sera of C57Bl/6 mice immunized with OVA in the presence of hydroxide gel aluminum with and without treatment with captopril or enalapril. IL-5 was assessed in sera collected at the end of the experiment. Analysis of anti-OVA antibodies and IL-5 was performed by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), which were also included sera of control animals which were injected with phosphate buffered saline (PBS) and left untreated. Statistical analysis of the results of anti-OVA antibodies showed no significant difference in the levels of IgG1 and IgM specific for OVA comparing untreated animals with those treated with enalapril or captopril. IL-5 was detected in two of the five immunized animals and untreated. Two out of five mice in the control group also presented IL-5. From the results it can be concluded that captopril and enalapril do not significantly regulate the production of IgG1 and anti-OVA IgM. As all immunized animals that were treated with enalapril or captopril showed serum IL-5 levels below the detection limit (4 pμ/mL) of the reaction used to evaluate it, we can not state that these drugs inhibit the production of systemic IL-5 in this model.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Acidentes com serpentes são considerados um problema de saúde pública, estando inclusos na lista de Doenças Tropicais Negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. Apesar da baixa incidência dos acidentes com as serpentes do gênero Micrurus, a potencial gravidade dos mesmos e a escassez de informações bioquímicas dos venenos destas cobras-corais, faz com que aumente a necessidade de investigação. Alguns venenos do gênero Micrurus já possuem seus mecanismos fisiopatológicos e sua composição melhor descritos. Entretanto, para o veneno de Micrurus surinamensis, há poucas informações a respeito da fisiopatologia e seus componentes principais, limitando, desta forma, o melhor entendimento molecular do mecanismo provocado pelo veneno. O soro comercial utilizado para o tratamento dos envenenamentos é produzido pela hiperimunização de cavalos com venenos do gênero Micrurus, porém o veneno de M. surinamensis não é incluso nesta produção, o que pode gerar um tratamento ineficaz em indivíduos picados por esta serpente. Neste sentido, este trabalho procurou investigar as moléculas presentes do veneno e suas atividades. Para avaliar o perfil proteico dos venenos foi realizada eletroforese SDS-PAGE. O veneno de M. surinamensis possui todas as suas proteínas abaixo de 31kDa, enquanto M. frontalis tem bandas até 50kDa. Já em relação a toxicidade, M. frontalis apresentou uma DL50 de 0,69 mg/kg em camundongos e uma EC50 em células MGSO-3 de 4,219 μg, enquanto que M. surinamensis possui uma DL50 de 0,75 mg/kg e uma EC50 de 25,47 μg. A verificação da presença de atividades enzimáticas foi avaliada através de ensaios in vitro. Ambos venenos apresentaram atividade hialuronidásica, entretanto apenas o veneno de M. frontalis apresentou as atividades fosfolipásica e de L-aminoácido oxidase. Para avaliação da capacidade de produzir edema e dor, camundongos tiveram os venenos injetados na pata. Os venenos de M. frontalis e M. surinamensis apresentaram edema consideráveis. Apenas o veneno de M. frontalis foi capaz de gerar dor nos camundongos. Também foi produzido um soro antiveneno de M. surinamensis em coelhos para se realizar uma comparação com os soros comerciais produzidos no Brasil e Costa Rica. Através de ELISA e Western Blot e do ensaio de neutralização em camundongos, foi percebido que o soro produzido em coelhos foi capaz de reconhecer fortemente o veneno de M. surinamensis em ambos os ensaios e também de neutralizar a ação tóxica do veneno em animais. Já os soros comerciais foram capazes de reconhecer e neutralizar apenas parcialmente o veneno de M.surinamensis. O veneno de M. frontalis apresentou comportamento contrário ao de M. surinamensis, não sendo reconhecido pelo soro produzido em coelhos e apresentando reatividade com os soros comerciais. Como conclusão temos que o veneno de M. surinamensis apresenta um perfil proteico e de atividades biológicas muito diferente do veneno de M. frontalis, o que faz com que o veneno não seja totalmente reconhecido e neutralizado pelos soros comerciais antielapídico produzidos no Brasil e na Costa Rica. Este fato se torna um problema de saúde pública, uma vez que indivíduos picados pela serpente da espécie M. surinamensis podem não receber um soro antielapídico eficiente para tratar os efeitos tóxicos do veneno, podendo levar a morte.

Orientador: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote / Resumo: A engenharia tecidual voltada ao tecido ósseo tem como objetivo proporcionar uma reparação que apresente propriedades físicas e biológicas similares ao osso natural com restabelecimento adequado das suas funções. Neste contexto, materiais aloplásticos baseados em biopolímeros como a fibroína da seda (FS) e celulose bacteriana (CB) têm proporcionado a síntese de excelentes biomateriais para reparação óssea. Esses biopolímeros são biocompatíveis, possuem características mecânicas interessantes, apresentam uma lenta taxa de degradação in vivo, além da capacidade de serem modificados quimicamente. Para conferir a estes biopolímeros uma melhor bioatividade com intuito de potencializar a eficácia local da reparação óssea, o objetivo do presente estudo consistiu em sintetizar uma membrana à base de FS e outra à base de CB, sendo cada uma associada à hidroxiapatita e anticorpo anti-proteína morfogenética óssea (anti-BMP-2). Para tanto, estas membranas foram caracterizadas físico-quimicamente e, para análise do potencial destas membranas na reparação óssea, foram realizados ensaios in vitro para investigação de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade, além de expressão gênica desses materiais. As membranas à base de CB obtiveram resultados da caracterização físico-quimicamente mais satisfatórios em relação à FS e os testes seguintes foram realizados apenas com a membrana de CB. A membrana de CB associada à hidroxiapatita não demonstrou citotoxicidade, genotoxicidade e mutageni... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tissue engineering related to the bone tissue aims to provide a repair that presents similar physical and biological properties to the natural bone with adequate restoration of its functions. In this context, alloplastic materials based on biopolymers such as silk fibroin (SF) and bacterial cellulose (BC) have provided the synthesis of excellent biomaterials for bone repair. These biopolymers are biocompatible, have interesting mechanical characteristics, have a slow rate of degradation in vivo, and the ability to be chemically modified. In order to give these biopolymers better bioactivity to potentiate the local effectiveness for bone repair, the aim of the present study was to synthesize a SF-based and BC-based membrane, each of them was associated with hydroxyapatite and antibody anti-bone morphogenetic protein (anti-BMP-2). The membranes with immobilized anti-BMP-2 are expected to be effective in capturing endogenous BMP-2, conferring a different therapeutic approach and potential use for bone tissue engineering. For this purpose, these membranes were physico-chemically characterized and, in order to analyze the potential of these membranes in bone repair, in vitro assays were performed to investigate cytotoxicity, genotoxicity, mutagenicity and gene expression of these materials. The BC-based membranes obtained physically-chemically characteristics more satisfactory than the SF, and the next tests were performed only on the BC membrane. The BC membrane associated with h... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre