Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-05-07T14:33:04Z No. of bitstreams: 1 2014_PerolaOliveira.pdf: 1195383 bytes, checksum: 4a98f936c74babeb72de17f0574f4866 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-13T13:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_PerolaOliveira.pdf: 1195383 bytes, checksum: 4a98f936c74babeb72de17f0574f4866 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T13:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_PerolaOliveira.pdf: 1195383 bytes, checksum: 4a98f936c74babeb72de17f0574f4866 (MD5) / Esclerose múltipla, neuromielite óptica ou doença de Devic e mielites são desordens inflamatórias, autoimunes e neurodegenerativas que envolvem o sistema nervoso central. A doença celíaca é uma afecção imunomediada caracterizada por intolerância permanente a proteínas contidas no glúten que, em indivíduos geneticamente susceptíveis, resulta em progressivas e graves lesões da mucosa entérica. A coexistência entre doença celíaca e doença desmielinizante do sistema nervoso central é sugerida desde a década de 1960, contudo há poucos trabalhos publicados e os resultados encontrados são conflitantes. O objetivo do presente estudo foi ddeterminar a prevalência de doença celíaca em pacientes com diagnóstico de doença desmielinizante do sistema nervoso central, especificamente, esclerose múltipla, neuromielite óptica e mielites de causa não determinada. Foi realizado estudo de prevalência com pacientes assistidos na Rede Sarah de Hospitais de Reabilitação com idade igual ou superior a 16 anos, de ambos os sexos, em acompanhamento médico regular no período compreendido entre março de 2012 e setembro de 2013, com diagnóstico de esclerose múltipla, neuromielite óptica ou mielite idiopática. Foi realizada pesquisa sérica para anticorpos antitransglutaminase tissular (IgA-tTG) e antiendomísio (IgA-EMA). Os resultados obtidos foram comparados com a literatura sobre prevalência da doença celíaca na população brasileira. Foram avaliados 379 pacientes com diagnóstico de doença desmielinizante do sistema nervoso central. Deste total, 249 (65,70%) pacientes tinham diagnóstico de esclerose múltipla, 37 (9,56%) de neuromielite óptica e 96 (24,54%) de mielites idiopáticas. Dois pacientes (0,53%) apresentaram IgA-tTG e IgA-EMA positivos, sendo um com diagnóstico de esclerose múltipla e outro de mielite. A prevalência de doença celíaca encontrada entre os pacientes com doenças desmielinizantes do SNC (0,53%) foi maior que a prevalência de doença celíaca na população brasileira obtida em estudo de 2003 com 2371 adultos em região geográfica semelhante ao estudo atual e que foi de 0,21%. Estes dados reforçam a suspeita de que a doença celíaca seja mais frequente em pacientes com doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). Outros estudos são necessários para confirmar estes achados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Multiple sclerosis, neuromyelitis optica or Devic's disease and myelitis are inflammatory, autoimmune and neurodegenerative disorders involving the central nervous system. The celiac disease is an immune-mediated condition characterized by a permanent intolerance to the gluten protein in genetically susceptible individuals, leading to in progressive, severe enteric mucosal lesions. The coexistence between celiac disease and demyelinating illness of central nervous system is suggested since the 1960s; however, there are few published studies and the results are controversial. Objective: Determining the prevalence of celiac disease in patients diagnosed with demyelinating disease of the central nervous system, specifically multiple sclerosis, neuromyelitis optica and myelitis of undetermined etiology. Methods: A prevalence study was conducted with patients assisted in the Sarah Network of Rehabilitation Hospitals, minimum age of 16 years, of both gender, in regular medical monitoring between March 2012 and September 2013, with a diagnosis of multiple sclerosis, neuromyelitis optica and myelitis of unknown etiology. It was performed a laboratory serum research for anti-tissue transglutaminase and antiendomysium antibodies. The results were compared with the literature about the prevalence of celiac disease in Brazilian population. Results: We evaluated 379 patients with a diagnosis of demyelinating disease of the central nervous system. From the total, 249 (65.70%) individuals were diagnosed with multiple sclerosis, 37 (9.56%) with neuromyelitis optica and 96 (24.54%) with idiopathic myelitis. Two patients (0.53 %) presented positive IgA - tTG and IgA –EMA; one of them was diagnosed with multiple sclerosis, and the other with myelitis. Discussion: The prevalence of celiac disease found among patients with demyelinating diseases of the CNS, 0.53 %, was higher than the prevalence of celiac disease in Brazilian population obtained in the 2003 study with 2371 adults in a similar geographic region to the current study and that it was 0.21%. Conclusion: These data reinforce the suspicion that celiac disease is more frequent in patients with demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Other population studies are necessary to confirm these findings.

Orientador: Ramon Kaneno / Resumo: O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo mais prevalente de câncer no mundo, com frequentes complicações metastáticas muitas vezes associadas ao desenvolvimento de resistência adquirida aos fármacos. Uma das estratégias terapêuticas utilizadas no tratamento de pacientes que não respondem bem à quimioterapia convencional é a imunoterapia baseada na aplicação de anticorpos monoclonais cetuximab ou panitumumab, ambos dirigidos ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Em alguns casos observa-se associação da resistência aos anticorpos com a superexpressão de HER2, outro membro da família do EGFR. Assim, esta dissertação foi elaborada para testar a hipótese de que o uso conjunto de anticorpos anti-EGFR e anti-HER será capaz de reduzir o escape das células tumorais e que a associação com fármacos antitumorais tornará mais efetiva sua eliminação. Com esse propósito, nosso objetivo foi utilizar nanopartículas ouro (AuNP) para o transporte de 5-fluorouracil (5FU), endereçando esses nanocarreadores para as células de câncer colorretal recobrindo-os com anticorpos contra os receptores para fator de crescimento epidérmico EGFR (ErbB-1) e HER2 (ErbB-2). Os nanocarreadores foram testados in vitro quanto a sua interação por células de câncer colorretal HCT-116 e Caco-2 por citometria de fluxo, sua capacidade de induzir apoptose/necrose e seu efeito sobre a atividade proliferativa das células testadas. Nossos dados indicam que as AuNP produzidas e funcionalizadas com as molé... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Colorectal cancer (CRC) is the third most prevalent type of cancer in worldwide and is frequently associated with metastatic complications. Therapeutic strategies to treat those patients who do not respond to conventional chemotherapy is based on the application of monoclonal antibodies cetuximab or panitumumab, both directed targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR). However, in some cases resistance is associated with an overexpression of HER2, another receptor belonging to the EGFR family. Therefore, this dissertation was designed to test the hypothesis that the combination of anti-EGFR and anti-HER antibodies will be able to reduce the escape of tumor cells, and that their association with antitumor drugs could improve the elimination of tumor cells. Then, our goal was to use gold nanoparticles (AuNP) for transporting 5-fluorouracil (5FU), addressing them to colorectal cancer cells by coating them with antibodies against the receptors of epidermal growth factor EGFR (ErbB-1) and HER2 (ErbB-2). Nanocarriers were tested in vitro by flow cytometry for their interaction and internalization by the colorectal cancer cell line HCT-116 and Caco-2, their ability to induce apoptosis/necrosis and stop cell proliferation. Our results show that AuNP produced and functionalized with the molecules of interest have spherical structure, however, some formulations showed agglomeration due to the incorporation of organic molecules. Biological assays showed that AuNP 5FU EGFR had... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos / The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

O crescimento cada vez maior da industrialização e a existência de um mercado globalizado vêm exigindo dos produtores rurais à utilização de modernas tecnologias ligadas à produção animal. O baixo custo de produção e o aumento da qualidade do produto final gerado têm sido a grande meta dos pecuaristas e centros de pesquisa voltados à agropecuária. Devido à necessidade de aumento na produção, propriedades agropecuárias têm recorrido ao uso de todo e qualquer recurso disponível que possa promover melhorias na atividade produtiva.O uso indiscriminado dos antimicrobianos com a intenção de aumentar a produção animal pode resultar em concentrações residuais nos produtos como carne, ovos e leite acima das doses aceitáveis para o consumo humano. Inicialmente, os antibióticos eram usados como medida terapêutica, mas com o avanço do conhecimento e desenvolvimento de novos compostos, passaram a ser utilizados também como medida preventiva e como promotores do crescimento.O que se deve questionar não é a presença destes resíduos, mas sim o tipo e as concentrações dos mesmos. De fato, as modernas tecnologias analíticas têm permitido a detecção de partes por bilhão de substâncias químicas, componentes ou metabólitos de medicamentos de uso veterinário em alimentos e, nestas quantidades, dificilmente elas representariam perigo à saúde dos consumidores. Portanto, há necessidade de se estabelecer metodologias analíticas mais eficientes que possam auxiliar os órgãos de fiscalização da agricultura no controle do uso desses antimicrobianos na produção animal. Assim como auxiliar no controle de qualidade, principalmente em indústrias exportadoras que almejam expansão de mercado, onde essa prática é quase uma imposição no contexto do comércio internacional de produtos pecuários \"in natura\" e processados. Devido a essas necessidades, o objetivo do presente foi padronizar e desenvolver reagentes imunoenzimáticos para a pesquisa da ciprofloxacina em produtos de origem animal. Os resultados obtidos no desenvolvimento desses imunoreagentes foram positivos quando correlacionado (r2 = 0,9588) com o kit referência RIDASCREEN® Enro/Cipro da R-Biopharm. Diante disso, é possível concluir que o Brasil possui infra-estrutura adequada para padronizar esses testes rápidos, evitando com isso um grande gasto na importação desses kits / The growth each time higher of industrialization and the existence of a global market forces the rural producers to use modern technologies related to animal production. The low production cost and the increasing of obtained final product quality have been the great aim of cattle farmers and cattle farming research centers. Due to the necessity of increasing the production, rural properties have required the use of any available source able to promote better productive activities. The indiscriminated antibiotics use aiming to increase animal production may result in residual concentrations found in products such as meat, eggs and milk over acceptable doses to the human consumption. Firstly, antibiotics were used as therapeutic prescriptions although the advances on knowledge and development of new compounds were also used as a preventive way and as growth promoters. What must be questionable its not the presence of these residuals but surely what kind of residual and their concentrations. In fact, the modern analytic technologies make possible the detection of parts per billions (ppb) of chemical substances, compounds or medicine metabolites of veterinary use in food and in these quantities, hardly they would be dangerous to the consumer health. However, it\'s necessary to establish more efficient analytic methodologies to help on agriculture supervising organs in the control of these antibiotics use in the animal production. Thus, how to help in the quality control, mainly in industries that export to get the market expansion, where this activity is almost an imposition at the international trade context of farming products \"in natura\" and industrialized ones. Due to these necessities, the goal of our present work was to standard and develop immunoenzymatics reagents to the ciprofloxacin researching from animal products. The results obtained on development of these immunoreagents were positive when correlated (r2= 0,9588) to the kit RIPASCREEN® Enro/Cipro from R-Biopharm reference. At the light of these knowledge, it?s possible to conclude that Brazil has adequate proper-structure to standardize these quick tests, to avoid in this way a high cost to import these kits.

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

Foi investigada a existência de proteção cruzada entre bacterinas bivalentes formuladas com um de três representantes do Sorogrupo Sejroe: hardjo (bacterina A), wolffi (bacterina B) e guaricura (bacterina C), e uma estirpe do sorovar pomona, empregada por ser patogênica para hamsters (Mesocricetus auratus) e possibilitar a realização do teste de potência com desafio. Os ensaios foram efetuados em hamsters machos, comparando-se os níveis de anticorpos aglutinantes e neutralizantes, respectivamente obtidos nos testes de soroaglutinação microscópica (SAM) e inibição de leptospiras in vitro (ICL). Os animais receberam duas doses de vacinas via subcutânea; aos dez dias da segunda dose, foram inoculados com culturas não inativadas dos respectivos sorovares do Sorogrupo Sejroe. Aos 21 dias pós-infecção (d.p.i.), os animais foram sangrados, os soros (n=8) foram agrupados em pools e submetidos aos testes de SAM e ICL. O teste de potência com desafio para o sorovar pomona foi adaptado do protocolo preconizado pelo United States Department of Agriculture, mas as vacinas não foram diluídas e o esquema de imunização empregou duas aplicações de 1,0mL pela via subcutânea em intervalo de dez dias; o desafio foi efetuado aos dez dias da segunda aplicação; os óbitos por leptospirose foram registrados e, aos 21 d.p.i., os sobreviventes foram sacrificados e a condição de portadores renais foi investigada através de cultivos de tecido renal para isolamento de leptospiras. No teste de potência com o sorovar pomona, o número de doses infectantes empregado para desafio (100) situou-se dentro da faixa preconizada (10 a 100); respectivamente para as bacterinas A, B e C, as proporções de mortes por leptospirose entre os animais vacinados foram de 1/10, 0/10 e 3/10, e as de portadores renais de leptospiras entre os sobreviventes foram 2/9, 1/10 e 2/7. Os resultados do teste SAM revelaram que a bacterina A induziu reações para os sorovares hardjo e wolffi; a bacterina B, para hardjo, wolffi e guaricura, e a bacterina C, apenas para a guaricura, e do teste de ICL, que animais vacinados com as bacterinas B ou C apresentaram proteção para hardjo, wolffi e guaricura; entretanto, a bacterina A conferiu proteção apenas para wolffi. Apesar das variações no poder imunogênico segundo a estirpe de leptospira empregada para a produção das bacterinas, houve proteção cruzada entre os sorovares hardjo, wolffi e guaricura. / The existence of cross-protection among bivalent bacterins, produced with one of three leptospires belonging to Serogroup Sejroe: hardjo (bacterin A), wolffi (bacterin B) and guaricura (bacterin C), and a strain of serovar pomona (included because of its pathogenicity to hamsters and the possibility of performing potency assay with challenge), was investigated in male hamsters (Mesocricetus auratus) by comparison of agglutinating and neutralizing antibodies titers, respectively measured by microscopic agglutination (MAT) and in vitro growth inhibition (GIT) tests. All animals received two doses of bacterins by subcutaneous route; after ten days from the second dose, they were inoculated with non-inactivated cultures of respective serovars of Serogroup Sejroe. At 21 post-challenge day (p.c.d.), all animals were bled and their sera (n=8) were joined in pools and tested by MAT and GIT. The potency assay with challenge performed only with serovar pomona was modified from protocol of USDA, but vaccines were not diluted and the immunization schedule employed two 1.0 mL vaccine doses by subcutaneous route with 10?day interval; the challenge was performed after ten days from the second dose; the number of deaths due to leptospirosis was registered; at 21 p.c.d., the survivors were sacrificed and their renal carrier state was investigated by culture of renal tissue for leptospires isolation. In the potency assay with serovar pomona, the number of infectious doses employed for challenge (100 infective units) was in accordance with the recommended range (10-1,000 infective units); respectively to bacterins A, B and C, proportions of deaths due to leptospirosis among vaccinated animals were 1/10, 0/10 and 3/10, and proportions of leptospires renal carrier among survivors were 2/9, 1/10 and 2/7. Results of MAT showed that bacterin A induced reactions against serovars hardjo and wolffi; bacterin B, against hardjo, wolffi and guaricura, and bacterin C, against guaricura; results of GIT revealed that vaccinated animals with bacterins B or C presented protection against serovar hardjo, wolffi and guaricura; however, bacterin A induced protection only against wolffi. A cross?protection was observed among serovars hardjo, wolffi and guaricura, although variations exist in the immunogenic capacity according to the strain of leptospires used for the bacterins production.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Neste trabalho, estudou-se a extraÃÃo de Imunoglobulina G (IgG) em Sistemas Aquosos BifÃsicos (SABs) compostos por polietilenoglicÃis (PEG) com massas moleculares iguais a 4000, 6000 e 8000 g.mol-1 e tampÃo citrato com pHs 5,0, 6,0 e 7,0. Primeiramente, determinou-se o comportamento no equilÃbrio para cada sistema por duas metodologias diferentes: cloud-point, a partir do qual foram obtidas as curvas binodais, e densitometria, que deu origem Ãs linhas de amarraÃÃo. Os resultados obtidos por ambas as tÃcnicas apresentaram uma boa concordÃncia. Observou-se que o aumento da massa molar do PEG, bem como o aumento do pH do tampÃo citrato levou a um aumento da Ãrea sobre a curva binodal. Entretanto, para o Ãltimo caso, a expansÃo da regiÃo bifÃsica nÃo foi significante quando se aumentou o pH de 6,0 para 7,0. Em relaÃÃo Ãs linhas de amarraÃÃo, tambÃm nÃo foram observadas mudanÃas significativas tanto no comprimento como nas inclinaÃÃes das mesmas quando se variou a massa molar e o pH, o que mostra a alta capacidade dos Ãons citrato em se hidratar preferencialmente e promover quase totalmente ou totalmente a exclusÃo do PEG da fase fundo, como observado nesse trabalho. O estudo de partiÃÃo se deu a partir de um planejamento estatÃstico do tipo 24 com resoluÃÃo completa e adiÃÃo de trÃs pontos centrais, tendo como variÃveis a % PEG, % tampÃo citrato, pH e massa molar do PEG. Para tal finalidade o software Statistica 7 foi utilizado. Foram realizados 19 experimentos e cada variÃvel independente foi testada em trÃs nÃveis, sendo os valores de porcentagem de PEG iguais a 26, 28 e 30% m/m e de tampÃo citrato iguais 8, 10 e 12% m/m. Os experimentos que apresentaram os maiores valores de coeficiente de partiÃÃo (Kp) foram aqueles com pH 7,0 e 12% de tampÃo citrato, classificados como fatores significativos estatisticamente. Fixaram-se, entÃo, esses valores de pH e % de tampÃo citrato e realizaram-se mais 27 experimentos com diferentes concentraÃÃes de NaCl (0, 0,2 e 0,4 M). Observou-se um aumento no valor de Kp quando se aumentou a concentraÃÃo de NaCl. Os resultados apresentados neste estudo mostraram que elevados valores de Kp podem ser obtidos mesmo a baixas concentraÃÃes de sal neutro. Este resultado mostrou ser satisfatÃrio visto que a utilizaÃÃo de grandes concentraÃÃes de sais em um processo industrial pode ocasionar diversos problemas como, por exemplo, a reduÃÃo na vida Ãtil dos equipamentos devido à corrosÃo dos mesmos. / In this work, it was studied the extraction of immunoglobulin G (IgG) in Aqueous Two Phase Systems (ATPS) composed of polyethylene glycols (PEG) with molecular weight equal to 4000, 6000 and 8000 g.mol-1 and citrate buffer with pH 5.0, 6.0 and 7.0. First, the behavior for each system in equilibrium was determined by two different methodologies: cloud-point from which binodal curves were obtained and density, which led to the tie-lines. The results obtained by both techniques showed good agreement. It was observed that the increase in PEG molecular weight and the increase in citrate buffer pH led to an increase in the area of the binodal curve. However, for the latter case, the expansion of two-phase region was not significant when the pH increased from 6.0 to 7.0. Regarding the tie-lines, there were also no significant changes in both length and slopes of the same while varying the molecular weight and pH, which shows the high ability of citrate ions on hydrating theirselves preferably and promoting fully or almost fully the PEG exclusion bottom phase, as observed in this study. The study of partition was made from a statistical design of type 24 with complete resolution and adding three central points, having as variables % PEG, % citrate buffer, pH and PEG molar mass. For this purpose the software Statistica 7 was used. 19 experiments were performed and each independent variable was tested in three levels, being the values of PEG percentage equals to 26, 28 and 30% (m/m) and citrate buffer percentage equals to 8, 10 and 12% (w/w). The experiments showed that the highest values of the partition coefficient (Kp) were obtained in systems with pH 7.0 and 12% citrate buffer, classified as statistically significant factors. These values of pH and % citrate buffer were settled and other 27 experiments were conducted with different concentrations of NaCl (0, 0.2 and 0.4 M). There was an increase in the Kp value when the NaCl concentration increased. The results of this study showed that high Kp values can be obtained even at low concentrations of neutral salt. This result is satisfactory since the use of high concentrations of salts in an industrial process may cause various problems such as the reduction in service life due to corrosion of the equipment thereof.

Introdução: O papel do sistema HLA na evolução do transplante é indiscutível. Dados da literatura internacional e do nosso laboratório têm mostrado que este não é o único sistema envolvido nos processos de RMA (rejeição mediada por anticorpo) Esse fato é comprovado a partir da constatação de que transplantes realizados entre irmãos com total identidade HLA também são alvos da RMA. Entretanto, os alvos antigênicos desses anticorpos permanecem desconhecidos, dificultando assim o diagnostico e tratamento da RMA não-HLA. No transplante renal a presença desses anticorpos têm sido associada com anticorpos anti células endoteliais, células epiteliais tubulares, podocitos, células mesangiais e monócitos. Nosso objetivo neste estudo foi avaliar a presença e a relevância clínica de anticorpos contra a megalina, membro da família de receptores de LDL, expressa na membrana apical dos túbulos proximais, com importante papel na reabsorção de proteínas no rim. Métodos: Soros pré-transplante de 105 pacientes submetidos a transplante renal, realizado no Serviço de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (UTR-HC-FMUSP) foram testados por ELISA contra 2 peptídeos da megalina estudados e sintetizados em nosso laboratório. (convencionalmente chamados 18 e 19) Resultado: Não foi detectada a presença de anticorpos do isotipo IgG nas amostras prétransplante dos pacientes estudados. Entretanto, foi detectada a presença de anticorpos do isotipo IgM anti-peptídeo 18 em 33 (31,4%) amostras de soro e anti-peptídeo 19 em 23 (21,9%). Para avaliar a significância clinica desses anticorpos dividimos os pacientes em 2 grupos: pacientes com pelo menos 1 episodio de rejeição aguda (Grupo I) e pacientes sem rejeição (Grupo II) e observamos a distribuição dos pacientes positivos nos 2 grupos. O numero de pacientes com anticorpos anti-peptídeo 18 foi igualmente distribuída nos dois grupos. (12/42, 28,5% no Grupo I e 21/63, 33,3% no Grupo II p=ns). A maioria dos pacientes com anticorpos anti-peptídeo 19 pertenciam ao grupo I (17/42, 40,5% ; 6/63, 9,5% p=0,0003). Esta analise demonstrou uma boa correlação entre presença de anticorpos anti-peptídeo 19 no soro pré-transplante e rejeição. Conclusão: Nossos dados sugerem que anticorpos IgM anti-megalina no pré-transplante podem ser um fator de risco na rejeição do aloenxerto renal. É importante salientar que a nosso conhecimento este é o primeiro estudo envolvendo megalina e rejeição no transplante clínico. / Background. Preformed donor-specific human leukocyte antigen (HLA)- antibodies are accountable for the majority of antibody-mediated rejections (AMR). However, recipients of HLA identical kidneys can develop AMR implicating putative pathogenic antibodies that are directed against non-HLA antigens. Unknown immune targets and consecutive lack of detection methods make non-HLA AMR particularly difficult to diagnose and treat. In renal transplant rejection, the presence of antibodies to non-HLA has been associated with antibodies against endothelial cells, tubular epithelial cells, podocytes, mesangial cells and monocytes. The aim of this study was to evaluate the presence and clinical relevance of preformed antibodies against megalin, a member of the LDL receptor family, expressed on the apical membrane of proximal tubules. Megalin performs a central role in renal protein reabsorption. Methods. Pré-transplant sera of 105 recipients of kidney allograft transplanted at Serviço de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (STRHCFMUSP) were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against 2 megalin-peptides (conventionally named 18 and 19) studied and synthetized in our laboratory. Results. Antibodies were not detected in pretranplant sera when tested for IgG isotype. However, in 33 (31,4%) sera we detected the presence of IgM antibodies to megalin-peptide18 and in 23 (21,9%) to megalin-peptide 19. To evaluate the clinical significance of these antibodies we divided the patients in 2 groups: Group I - 42 patients with at least one rejection episode during the first post-transplant year and Group II - 63 patients without any rejection episode and observed the distribution of positive patients in each of the 2 groups. Patients with megalin-peptide18 antibodies had the same distribution in both groups. (12/42, 28, 5% Group I and 21/63, 33,3% no Group II p=ns). However, patients with megalinpeptide19 antibodies were more frequent in group I. (17/42, 40,5% group I and 6/63, 9,5% group II p=0,0003). This analysis demonstrated a good correlation between preformed anti-megalin-peptide19 antibodies and allograft rejection Conclusion. Our data suggest that presence of IgM megalin antibodies before transplantation might be a risk factor for kidney allograft rejection. To our knowledge, this is the first study involving megalin and rejection in clinical transplantation.

No semi-árido paraibano há poucos relatos de ocorrência da raiva, há quem afirme que os caprinos, ovinos e asininos são resistentes à doença e a prática de vacinação é incomum. Este trabalho visou estudar a situação da raiva na região semi-árida de Patos-PB, estabelecendo o diagnóstico desta enfermidade em diferentes espécies de animais domésticos e silvestres. Foram capturados 12 exemplares de raposas (Dusicyon vetulus), por meio de armadilha; 192 morcegos insetívoros (Molossus molossus), capturados no Centro de Saúde e Tecnologia Rural - CSTR, Universidade Federal de Campina Grande - UFCG, em Patos, e oito morcegos insetívoros (M. molossus) encaminhados por moradores desta cidade. As raposas capturadas foram submetidas à colheita de sangue e em seguida sacrificadas com uso de Ketamina e T-61. Outras 287 raposas e oito guaxinins (Procyon cancrivorous) atropelados e mortos nas rodovias que servem o município de Patos foram examinados, além de 74 amostras de diferentes espécies de animais domésticos, enviados pelo setor de Patologia do Hospital Veterinário do CSTR-UFCG. Os animais silvestres, uma vez transportados ao Laboratório de Virologia do CSTR-UFCG, foram necrópsiados e os fragmentos do cérebro, submetidos à prova de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC) para o diagnóstico da raiva. Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos à IFD, dos quais 47 (8,09%) se confirmaram à ICC. Relativamente às espécies, 19/41 amostras de bovinos; 12/299 de raposas; 1/5 de ovinos e 2/6 de caninos apresentaram resultados positivos para ambas as provas. Amostras procedentes de caprinos, eqüinos e morcegos apresentaram resultados discrepantes entre as provas de IFD e ICC, de 2/6 e 1/6; 3/11 e 2/11; e 9/200 e 8/200, respectivamente. As amostras de vírus foram enviadas ao Laboratório de Raiva da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, para extração do material nucléico, tipificação antigênica e genética. A tipificação antigênica e genética com base no gene M1 foi realizada no "Canadian Food and Inspection Agency", Fallowfield, Otawa, Canadá, patrocinado pela IICA – "Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture". A caracterização genética do gene N e o estudo filogenético foram realizados no laboratório do "National Institute of Infectious Diseases", Toyama, Tóquio, pelos pesquisadores do "College of Bioresources Sciences" da Nihon University, Kanagawa, Japão. O estudo do comportamento biológico das amostras foi realizado em camundongos, pela inoculação por via intracerebral, avaliando-se os períodos de incubação e clínico, no seu primo-isolamento. O comportamento biológico de um isolado de raposa foi estudado em caprinos e ovinos inoculados experimentalmente por via intramuscular. A mesma amostra foi utilizada para o desafio de asininos e eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus inativado. Estes animais apresentaram níveis mensuráveis de anticorpos anti-rábicos neutralizantes e os resultados do desafio indicaram a eficácia da vacina contra o isolado de raposa. Os resultados da tipificação antigênica e genética permitem concluir que: na região estudada a epidemiologia da raiva é complexa, revelando existir variantes distintas, mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. / In the semiarid of the State of Paraíba there are few reports of rabies occurrence, and it is said that caprines, ovines and asinines are resistant to rabies and the use of vaccines in these species is uncommon. This work aimed to study the situation of rabies in the semiarid of Patos-PB, establishing the diagnosis in domestic and wild animals. For the study, 12 foxes (Dusicyon vetulus) were captured alive; 192 insectivorous bats (Molossus molossus), captured at the "Centro de Saúde e Tecnologia Rural-CSTR", of the "Universidade Federal de Campina Grande-UFCG", Patos-PB; and 8 bats (M. molossus) sent by residents of the city of Patos. Captured foxes were submitted to blood collection and then sacrificed using ketamine and T-61. Other 287 foxes and 8 raccoons (Procyon cancrivorus) road-kills collected from the roads serving the Patos municipality were examined. Other 74 samples from different domestic animals sent by the Pathology section of the Veterinary Hospital of the CSTR-UFCG were also included. The wild animals, once shipped to the Virology Laboratory of the CSTR-UFCG, were necropsied and brain fragments were submitted to the fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT) for rabies diagnosis. Among the 581 materials, 50 (8.60%) were positive by FAT, and 47 (8.09%), confirmed by MIT. Concerned to animal species, 19/41 bovines; 12/299 foxes; 1/5 ovines; and 2/6 canines were positive for both FAT and MIT. Caprine, equine and bat samples presented discrepant results between the FAT and MIT, from 2/6 to 1/6; 3/11 to 2/11; 9/200 to 8/200, respectively. All the isolates were sent to the Rabies Laboratory of the "Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal", "Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia", "Universidade de São Paulo-FMVZ-USP", for extraction of nucleic materials, to perform the antigenic and genetic typing. Antigenic and genetic typing based on M1 gene was conducted at the Canadian Food and Inspection Agency, Fallowfield, Otawa, Canada, sponsored by the IICA – Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture. The genetic characterization of the N gene and the phylogenetic analyses were made at the National Institute of Infectious Diseases, Toyama, Tokyo, by the researchers of the College of Bioresources Sciences, Nihon University, Kanagawa, Japan. The biologic behavior of the isolates was studied in mice through intracerebral inoculation by registering the incubation and the clinical periods at its first passage. The biologic behavior of a fox isolate was assessed in caprines and ovines, by experimental inoculation through intramuscular route. The same isolate was used for the challenge of asinines and equines that had been vaccinated with a commercially available inactivated virus vaccine. The vaccinated animals showed measurable levels of neutralizing antirabies antibodies and the results of challenge indicated the efficacy of this vaccine against the fox isolate. According to the results of antigenic and genetic typing, it can be concluded that in the region, the epidemiology of rabies is complex, revealing the existence of virus variants maintained in populations of domestic dogs, foxes and hematophagous and insectivorous bats.

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.