Introdução: O envolvimento hepático na doença celíaca (DC) é amplamente reconhecido e atualmente é uma das manifestações extra-intestinais mais freqüentes. Com o advento de marcadores sorológicos de elevada especificidade e sensibilidade, sobretudo o anticorpo antiendomísio (EMA), a DC tem sido descrita em associação a várias hepatopatias. Objetivos: caracterizar as formas de triagem de DC em portadores de hepatopatia crônica; caracterizar e estudar os pacientes cujo diagnóstico de DC foi realizado durante a investigação de uma doença hepática; pesquisar a reatividade do antiendomísio em pacientes com hepatite auto-imune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e hipertensão portal não cirrótica; avaliar o comportamento da doença hepática na vigência de dieta sem glúten. Métodos: Os pacientes foram triados pela detecção dos anticorpos anti-reticulina e anticorpo antimatriz extracelular durante a rotina de imunofluorescência de pesquisa dos auto-anticorpos hepáticos; pela presença de manifestações de DC em hepatopatas crônicos, pelo aspecto endoscópico sugestivo de DC e pela pesquisa sistemática do EMA nas patologias referidas anteriormente. Todos os pacientes foram submetidos à pesquisa do EMA, anti-reticulina IgG ou antimatriz de fibroblastos IgG na presença de deficiência de IgA. Em caso de positividade desses marcadores, foram submetidos à endoscopia digestiva alta para biópsia intestinal e caracterizados do ponto de vista clínico, laboratorial e histopatológico. A evolução desses dados permitiu a caracterização da evolução da doença hepática e da doença celíaca a partir da introdução da dieta sem glúten. Resultados: Foram identificados 43 pacientes com auto-anticorpos relacionados à DC (em 42 o EMA IgA e em um o antimatriz extracelular IgG em associação com deficiência de IgA). A rotina de pesquisa de auto-anticorpos hepáticos identificou 31 pacientes; seis apresentavam hepatopatia crônica e manifestação de DC; em três o exame endoscópico foi sugestivo de DC e a pesquisa sistemática do EMA foi positiva em três casos. O diagnóstico de DC foi confirmado em 37 de 40 pacientes (92,5%) em que a biópsia intestinal foi realizada. A idade dos pacientes variou de 2 a 68 anos, com mediana de 35 anos. Houve maior prevalência de acometimento no sexo feminino (65%). A DC foi mais prevalente na raça branca (87%), mais foi identificada em quatro mulatos e um negro. As doenças hepáticas mais freqüentes foram hipertransaminasemia criptogênica, hepatite auto-imune, hiperplasia nodular regenerativa e hepatite pelo vírus C. Conclusões: 1) A reatividade do anti-reticulina, a presença de diarréia inexplicada e a análise endoscópica da mucosa duodenal foram as formas de seleção mais efetivas de se identificar a DC em hepatopatas crônicos. 2) A ausência de manifestações clínicas de DC nesse grupo de pacientes foi bastante expressiva. 3) A pesquisa sistemática do EMA em cirrose biliar primaria, hepatite auto-imune, colangite esclerosante primária não contribuiu para o diagnóstico de DC em um número significativo de pacientes, ao contrário do observado no grupo de hipertensão portal não cirrótica, especialmente hiperplasia nodular regenerativa 4) As doenças hepáticas em que mais freqüentemente foi diagnosticada a DC foram a hiperplasia nodular regenerativa, hepatite auto-imune, hipertransaminasemia criptogênica, hepatite pelo vírus C e cirrose biliar primária antimitocôndria negativo. 5) A retirada do glúten da dieta contribuiu de maneira efetiva para normalização das enzimas hepáticas nos casos de hipertransaminasemia criptogênica. Nos grupos de hiperplasia nodular regenerativa, hepatite B e C, cirrose biliar primária, álcool e hepatite auto-imune, o papel da dieta foi de difícil avaliação em razão da interferência da instituição do tratamento específico e da evolução natural da doença hepática de base. / Introduction: The hepatic involvement in Celiac Disease (CD) is well known and widely regarded as a frequent extra-intestinal manifestation. With the advent of highly specific and sensitive serological markers, especially the antiendomysial antibody (EMA), CD has been described in association with several liver conditions. Objectives: To characterize ways for screening patients with chronic liver conditions in order to diagnose CD, to characterize and study patients whose CD diagnoses were performed when investigating hepatic diseases, to test the reactivity of EMA in patients with autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis and non-cirrhotic portal hypertension, to evaluate the course of the hepatic disease in gluten-free diet. Methods: Patients were selected by the detection of antireticulin and anti-extracellular matrix antibodies during routine immunoflourescence determination for hepatic autoantibodies, by the presence of CD manifestations in chronic patients with liver diseases, by the endoscopic aspects suggestive of CD and by systematic search for EMA in the above mentioned pathologies. All patients were submitted to tests for EMA, antireticulin IgG or antimatrix of IgG fibroblasts in IgA deficiency. When testing positive for these markers, patients were submitted to upper digestive endoscopy for intestinal biopsy, and were also characterized from the clinical, laboratorial and histological point of view. The assessment of these data enabled the characterization of the hepatic condition as well as the CD from the onset of a gluten-free diet. Results: 43 patients with autoantibodies related to CD were identified (42 tested positive for IgA EMA and 1 for IgG extracellular antimatrix in the presence of IgA deficiency). Routine determination of hepatic autoantibodies identified 31 patients. Of those, 6 presented chronic liver diseases and CD manifestations. In 3 patients, the endoscopic exam was suggestive of CD; systematic EMA determination was positive in all three cases. The CD diagnosis was confirmed in 37 out of 40 patients (92.5%) that performed intestinal biopsy. Patients aged between 2 and 68 years (median: 35 years). Female patients were most affected (65%). CD was more prevalent in white patients (87%), but was also found in four mulattoes and 1 black person. The most common liver disorders were cryptogenic hypertransaminasemia, autoimmune hepatitis, nodular regenerative hyperplasia and chronic hepatitis C. Conclusions: 1) The reactivity of antireticulin, the presence of unexplained diarrhea and the endoscopic analysis of the duodenal mucous were the most effective ways to identify CD in chronic liver diseases. 2) The absence of CD clinical manifestations in this group of patients was impressive. 3) Contrary to what was observed in the group with non-cirrhotic portal hypertension, especially regenerative nodular hyperplasia, the systematic determination of EMA in primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis and primary sclerosing cholangitis did not contribute to CD diagnosis in a significant number of patients. 4) CD was most frequently diagnosed in the following liver diseases: cryptogenic hypertransaminasemia, autoimmune hepatitis, nodular regenerative hyperplasia and chronic hepatitis C and negative antimitochondrial primary biliary cirrhosis. 5) The removal of gluten from the diet contributed effectively to bring the hepatic enzymes levels back to normal in cases of cryptogenic hypertransaminasemia. However, the role of diet was difficult to evaluate in nodular regenerative hyperplasia, autoimmune hepatitis, alcohol disease and primary biliary cirrhosis groups due to the nature of the specific treatments and the natural course of the hepatic conditions.

A doença hemolítica perinatal (DHPN) é caracterizada pela destruição das hemácias fetais por anticorpos da classe IgG presentes na circulação materna. Esses anticorpos, dirigidos contra antígenos eritrocitários presentes nas hemácias do feto, atravessam a barreira placentária e promovem a hemólise prematura dos eritrócitos, podendo levar à anemia fetal. O presente trabalho teve como objetivo principal determinar a prevalência dos anticorpos irregulares em gestantes atendidas em maternidades públicas da hemorrede de Santa Catarina por meio de um estudo observacional, com coorte retrospectiva, entre janeiro de 2012 a dezembro de 2015, englobando a análise de dados arquivados no laboratório de Imunohematologia do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina, situado na cidade de Florianópolis. As variáveis investigadas nas amostras de cordão e de recém nascido (RN) foram: Anticorpo(s) materno(s) identificado(s) no teste de eluato de amostras com teste de antiglobulina direto positivo; fenotipagem ABO/RhD da mãe do RN. No caso das amostras de gestantes com suspeita de aloimunização e mães dos RNs, avaliaram-se as seguintes variáveis: anticorpo(s) antieritrocitário(s) identificado (s); fenotipagem ABO/RhD da gestante. O número total de casos analisados ao longo dos 4 anos foi equivalente a 585, sendo que o número de casos de anticorpos irregulares maternos na população estudada foi equivalente a 45. A distribuição do total de anticorpos irregulares maternos (TAIM) para cada ano demonstrou forte tendência de crescimento linear (coeficiente de correlação linear igual a 0,9311). Os dados coletados apontaram as seguintes especificidades de anticorpos, citados de acordo com a ordem decrescente de distribuição de frequência : anti-D (57,8%); anti-D,-C (11,1%); anti-c (6,7%); anti-c,-E (4,4%); anti-D,-E (4,4%); anti-M (4,4%); anti-C (2,2%); anti-E (2,2%); anti-K (2,2%); anti-Fy(b) (2,2%); anti-Jk(a) (2,2%) com prevalência de 41% do anti-D sob as outras classes de anticorpos. A associação entre o fenótipo RhD da gestante e a realização do teste de Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) demonstrou que o fato do fenótipo RhD ser positivo ou negativo não influencia na execução do teste (p=0,1672; Coeficiente de Cramer equivalente a 0,1783), entretanto, foi possível observar uma predominância do número de casos de testes de PAI não realizados sob os realizados, em especial em gestantes RhD positivo. Os resultados encontrados contribuíram para a elaboração do material clínico na forma de cartilha intitulado: DHPN - DOENÇA HEMOLÍTICA PERINATAL E TESTES IMUNOHEMATOLÓGICOS PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL. A cartilha foi elaborada na forma de perguntas e respostas englobando principalmente esclarecimentos sobre os testes imunohematológicos que auxiliem no diagnóstico da DHPN. / Perinatal hemolytic disease is characterized by the destruction of fetal red blood cells by IgG antibodies present in the maternal circulation. These antibodies directed against erythrocyte antigens present in red blood cells of the fetus, cross the placental barrier and promote the premature haemolysis of red blood cells and can lead to fetal anemia. This study aimed to determine the prevalence of irregular antibodies in pregnant women in public hospitals in hemorrede of Santa Catarina through an observational study with retrospective cohort from January 2012 to December 2015, involving the analysis of archived data in Immunohematology laboratory of Center of Hematology and Hemoterapy of Santa Catarina, located in Florianópolis. The variables to be investigated in the cord samples and newborn (NB) were: maternal antibody identified in eluate test of samples with a positive direct antiglobulin test; phenotyping ABO / RhD of newborn`s mother. For samples of pregnant women with suspected alloimmunization and mothers of newborns, the following variables will be evaluated: Antierythrocyte(ies) antibody(ies) identified; phenotyping ABO / RhD of the pregnant woman. The total number of cases analyzed over the four years was equivalent to 585, and the number of cases of maternal irregular antibodies in the population studied was equivalent to 45. The distribution of total maternal irregular antibodies (TMIA) for each year showed strong linear growth trend (linear correlation coefficient of 0.9311). The data collected showed the following specific antibodies, cited according to the descending order of frequency distribution: Anti-D (57.8%); anti-D, -C (11,1%); anti-c (6.7%); anti-c E (4.4%); anti-D, E (4.4%); Anti-M (4.4%); Anti-C (2.2%); Anti-E (2.2%); anti-K (2.2%); anti-Fy (b) (2.2%); antiJk(a) (2.2%) with a prevalence of 41% of anti-D in relation to other antibody specificities. The association between RhD phenotype of pregnant women and the realization of Irregular antibody screening test (PAI) showed that the fact of the RhD phenotype be positive or negative does not influence the test execution (p = 0.1672; Cramer coefficient equivalent to 0.1783), however, it was possible to observe a predominance of the number of cases of PAI tests not performed under performed, especially in RhD positive pregnant women. The results contributed to the development of the clinical material in the form of spelling book entitled: DHPN - PERINATAL HEMOLYTIC DISEASE AND IMMUNOHEMATOLOGICAL TESTS FOR LABORATORY DIAGNOSTICS. The spelling book was prepared in the form of questions and answers covering mainly clarifications on immunohematological tests to assist in the diagnosis of DHPN.

Anticorpos antieritrocitários são produzidos contra um ou mais epítopos presentes na superfície dos glóbulos vermelhos. A pesquisa de anticorpos irregulares consiste em expor os anticorpos circulantes do indivíduo a antígenos conhecidos in vitro. Nos casos dos doadores de sangue, a legislação vigente determina a realização da pesquisa de anticorpo irregular (PAI), não exigindo, porém, a determinação da especificidade do anticorpo, e os componentes plasmáticos e os concentrados de plaquetas, cuja presença de anticorpos irregulares fora evidenciada, não devem ser utilizados para transfusão. O presente estudo caracterizou o perfil imunohematológico referente à presença de anticorpos irregulares em doadores de sangue do Instituto Paranaense de Hemoterapia e Hematologia Ltda., no período de abril de 2008 a dezembro de 2015, e avaliar: (i) a prevalência de doadores de sangue voluntários que apresentam PAI positiva, (ii) a especificidade dos aloanticorpos identificados, (iii) a prevalência dos aloanticorpos em doadores de acordo com o sexo e a faixa etária. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa. As informações sobre resultado da PAI, especificidade do anticorpo, sexo e idade disponíveis no sistema informatizado do Instituto Paranaense de Hemoterapia e Hematologia Ltda. foram acessadas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste exato de Fisher e valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Foram analisados 155.834 doadores. Em 474 (0,3%) doadores foram detectados anticorpos irregulares, dos quais, 358 doadores apresentaram resultados conclusivos (25% sexo masculino e 75% feminino). Os anticorpos de maior frequência foram anti-D (23%, n=83), anti-M (15%, n=55), anti-K (12,2%, n=44), anti-E (11,7%, n=42) e antiDia (11,7%, n=42). As associações de diferentes anticorpos ocorreram em 14,8% (48) da população estudada, sendo a mais frequente, anti-D + anti-C (n=19). A frequência de anticorpo irregular na população feminina foi significativamente maior que na masculina para as especificidades anti-D (p=0,0191) e anti-M (p=0,0005). O grupo de doadores com idade menor a 40 anos apresentou uma frequência estatisticamente maior de anticorpos irregulares com especificidades anti-M (p=0,0008) e anti-Dia (p=0,0176) quando comparado ao grupo de doadores com idade maior ou igual a 40 anos. Entre os 86 doadores do sexo masculino, a prevalência de anti-Dia foi significativamente maior na população masculina com idade inferior10 a 40 anos quando comparado aos doadores com idade maior ou igual a 40 anos (p=0,0273). O resultado obtido induz a suspeita de um provável IgM de origem natural considerando que esta população de doadores masculinos apresenta baixa chances de aloimunização por transfusão e não tem histórico de gestacional. A definição da prevalência e especificidade de aloanticorpos em doadores de sangue pode indicar a necessidade de um protocolo que defina a conduta frente ao doador com objetivo de proteção do doador de sangue e otimização do serviço de hemoterapia em relação às coletas de sangue realizadas / Anti-erythrocyte antibodies are produced against one or more epitopes present on the surface of red blood cells. The search for irregular antibodies consists in exposing the subject\'s circulating antibodies to known antigens in vitro. In the case of blood donors, the current Brazilian legislation determines that the irregular antibody test (PAI) must be checked in all blood donores, but does not require the determination of the specificity of the antibody, and the plasma components and the platelet concentrates from blood donors with irregular antibodies should not be used for transfusion. The present study characterized the immunohematology profile for the presence of irregular antibodies in blood donors from the Instituto Paranaense de Hemoterapia e Hematologia Ltda., from April 2008 to December 2015, in order to evaluate: (i) the prevalence of donors with irregular antibodies, (ii) the specificity of the alloantibodies identified, (iii) the prevalence of alloantibodies in donors according to gender and age group. The research project was approved by the Ethics Committee. PAI result, antibody specificity, sex and age data were collected from the system of the Instituto Paranaense de Hemoterapia e Hematologia Ltda. Statistical analyzes were performed using Fisher\'s exact test and values of p <0.05 were considered statistically significant. A total of 155,834 donors were analyzed. In 474 (0.3%) donors, irregular antibodies were detected, of which 358 donors presented conclusive results (25% male and 75% female). The most frequent antibodies were anti-D (23%, n = 83), anti-M (15%, n = 55), anti-K (12.2%, n = 44), anti-E (7%, n = 42) and anti-Dia (11.7%, n = 42). The associations of different antibodies occurred in 14.8% (48) of the study population, being the most frequent anti-D + anti-C (n = 19). The frequency of irregular antibody in the female population was significantly higher than in the male for the anti-D (p = 0.0191) and anti-M (p = 0.0005) specificities. The group of donors less than 40 years of age presented a statistically higher frequency of irregular antibodies with anti-M (p = 0.0008) and anti-Dia specificities (p = 0.0176) when compared to the group of donors aged 40 years or older. Among the 86 male donors, the prevalence of anti-Dia was significantly higher in the male population under 40 years of age when compared to those aged 40 years or older (p = 0.0273). This result induces the suspicion of a probable IgM of natural origin considering that this population of male donors has low chances of transfusion alloimmunization and has no gestational history. The definition of the prevalence and specificity of alloantibodies in blood donors may indicate the need for a12 protocol that defines the conduct towards the donor for the purpose of protecting the blood donor and optimizing the hemotherapy service in relation to the blood collections performed.

A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença infecciosa de ocorrência mundial e transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. As manifestações clínicas são inespecíficas e multissistêmicas. Pode apresentar as fases aguda, assintomática e crônica, as quais podem cursar com alterações hematológicas como trombocitopenia, discreta anemia e leucopenia durante a fase aguda, discreta trombocitopenia na fase assintomática, e pancitopenia nos casos crônicos graves. O estabelecimento de indicadores prognósticos para a doença pode ser de grande valia para o direcionamento do tratamento clínico. O estudo do título de anticorpos em cães infectados poderia auxiliar no diagnóstico da EMC bem como no monitoramento do tratamento. A fim de identificar as principais alterações clínicas, hematológicas e sorológicas de cães infectados por E. canis, foram selecionados 82 animais com diagnóstico etiológico de EMC (positivos a Reação em Cadeia da Polimerase PCR). Os cães foram subdivididos em grupos de animais assintomáticos (n=12), doentes e sobreviventes (n=51) e doentes e não sobreviventes (n=19). Foi realizado ainda acompanhamento clínico, hematológico e sorológico de 28 animais tratados com medicação preconizado, no período de até 180 dias após o tratamento. Na análise clínica, não houve predisposição sexual ou racial, porém cães maiores de 8 anos de idade apresentaram maior frequência. Os sintomas observados mais frequentemente em todos os cães, exceto nos assintomáticos, foram palidez de mucosas, apatia, hiporexia, letargia e gastrenterite. As alterações hematológicas encontradas no grupo dos cães doentes foram anemia e trombocitopenia, que variaram apenas na intensidade quando da comparação dos animais sobreviventes com os não sobreviventes, porém apenas a anemia e a leucopenia apresentaram-se como fatores prognósticos negativos para a doença. Altos títulos de anticorpos (&ge; 2.560) foram observados em grande parte dos animais infectados, porém não puderam ser considerados indicadores de persistência da infecção. Em dois dos 28 animais com monitoramento pós tratamento houve reinfecção, face aos resultados novamente positivos na pesquisa de material genético para E.canis, associados à recidiva de alterações hematológicas em um dos dois animais, e abrupto novo aumento do título de anticorpos. Em outros animais, apesar da rápida ascensão do título concomitante à recidiva de alterações hematológicas, não houve amplificação de DNA erliquial, sugerindo diagnóstico molecular falso negativo. Concluiu-se que alterações clínicas e hematológicas sugestivas da doença foram encontradas nos animais doentes, apenas a anemia e leucopenia podem ser indicadores prognósticos da doença, e que a interpretação do título de anticorpos deve ser feita em consonância com alterações clínicas e hematológicas do cão suspeito. / The canine monocytic ehrlichiosis (CME) is an infectious disease occurring worldwide and is transmitted by the tick Rhipicephalus sanguineus. The clinical manifestations are nonspecific and multisystemic. It may present acute, asymptomatic and chronic phases, which may be presented with haematological changes such as thrombocytopenia, mild anemia and leukopenia during the acute phase, mild thrombocytopenia in asymptomatic phase, and pancytopenia in severe chronic cases. The establishment of prognostic indicators for the disease may be of great value to guide clinical treatment. The study of antibodies titer in infected dogs could help in the diagnosis of CME and in monitoring treatment. In order to identify the main clinical, hematological and serological changes in dogs infected with E. canis, 82 animals were selected with etiologic diagnosis of a CME (positive to Polymerase Chain Reaction - PCR). The dogs were subdivided into groups of asymptomatic animals (n = 12), sick and survivors (n = 51) and sick and non-survivors (n = 19). It was also conducted clinical, hematological and serological monitoring of 28 animals treated with recommended medication for the period until 180 days after treatment. In clinical analysis, there was no racial or sexual predisposition, however dogs older than 8 years of age had a higher frequency. The most frequently reported symptoms in all dogs except the asymptomatic patients were pale mucous membranes, apathy, appetite loss, lethargy and gastroenteritis. Hematological changes found in the group of sick dogs were anemia and thrombocytopenia, which varied only in intensity when comparing the survivors to the nonsurvivors, but only anemia and leukopenia were presented as negative prognostic factors for the disease. High titers of antibodies (2560 &ge;) were observed in most infected animals, but they could not be considered indicators of persistent infection. In two out of the 28 monitored animals after treatment there was reinfection, compared to positive results back on the research of genetic material to E.canis, associated with relapse of hematological changes in one of the two animals, and sudden new increase in antibody titer. In other animals, despite the rapid rise of the concurrent title of relapse hematological changes, there was no erliquial DNA amplification, suggesting molecular diagnostic to be false negative. It was concluded that clinical and hematologic changes suggestive of the disease were found in sick animals, only anemia and leukopenia may be prognostic indicators of the disease, and that the interpretation of antibody titers should be done in line with clinical and hematologic changes of the suspect dog.

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:00:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CarlaReis_M.pdf: 2012737 bytes, checksum: 29446d9a4e9ff14301c100dcd3fb82ab (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Anticorpos monoclonais (AcM) são imunoglobulinas secretadas por clones de linfócitos B imortalizados obtidos pela tecnologia de hibridomas. Esses clones são cultivados em meios de cultura complexos e, geralmente, liberam baixas concentrações de AcM, dificultando as etapas de purificação. Como a utilização destas proteínas nas áreas terapêutica e analítica requer um alto grau de pureza, diferentes estratégias de purificação vêm sendo desenvolvidas, mas usualmente os anticorpos são purificados por cromatografia de afinidade com proteína A ou G imobilizada, o que representa um elevado custo de produção para processos industriais. No intuito de contribuir para o desenvolvimento de processos de purificação dessas moléculas, estudou-se a purificação do AcM anti-Trypanosoma cruzi isotipo IgG2a em orto-fosfo-serina (OPS) imobilizado em gel de agarose. Contrário ao relatado em literatura, observou-se que o agente quelante apresentou baixa capacidade em imobilizar o íon metalico Ni2+. Além disso, o quelato formado adsorveu a molécula alvo juntamente com impurezas do sobrenadante do meio de cultura. Foi observado também que o OPS se comporta como ligante de troca iônica seletivo para IgG2a em solução tampão Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,0, quando imobilizado em gel de agarose ativado com CNBr, porém os ensaios realizados com o ligante imobilizado em gel ativado com bisoxirano demonstraram que a inserção de uma molécula espaçadora reduz a seletividade do adsorvente. O AcM foi recuperado com elevado grau de pureza quando empregado em solução tampão Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,0 e dessorção pelo acréscimo de NaCl 1,0 mol/L para promover aumento da força iônica. Os resultados de ensaios dinâmicos revelaram que a eficiência de recuperação do produto foi de 97,3% e a capacidade dinâmica de adsorção foi 0,39 mg de AcM/mL de gel devido. Este trabalho sugere a potencialidade de utilização do ligante OPS para a purificação dos anticorpos anti-Trypanosoma cruzi (IgG2a) / Abstract: Monoclonal antibodies (mAb) are immunoglobulins produced by lynphocyte B clones immortalized by the hibridoma technology. Those clones are cultivated in complex medium and generally produce low levels of mAb, interfering on purificaton steps. Since these antibodies are required for analytical and therapeutical purposes, the need of highly pure antibodies is imperative. Although they are usually purified by chromatografic techniques utilizing immobilized protein A ligands, different strategies for downstream processes have been studied to overcome the high costs of these conventional medias for industrial scale purposes. Aiming to contribute with the development of such processes, the anti-Trypanosoma cruzi mAb (IgG2a isotype) was investigated under chromatographic conditons twards the affinity ligand ortho-phospho-L-serine (OPS) immobilized onto agarose beads. It was observed that despite the fact this ligand has been reported as a chelating agent for the purification of immunoglobulins by IMAC technique, OPS presented low chelating capacity for Ni2+ and the metal complex formed adsorbed the desired protein within culture medium contaminants. It was also observed that under buffering conditions of Tris-HCl 50 mmol/L pH 7.0 OPS behaves as a selective ionic exchanger ligand for IgG2a when immobilized in CNBr activated agarose. On the other hand, when immobilized in bisoxirane activated agarose, OPS has shown that the presence of a spacer arm reduces the selectivity of the adsorbent. The mAb was recuperated in one single step with highly putity degree when operated with adsorption buffer Tris-HCl 50 mmol/L pH 7.0 and elution by increasing the ionic strength with the addition of NaCl 1.0 mol/L. The dynamic tests results showed that the efficiency for product recovery was 97.3% and the dynamic binding capacity was 0.39 mg of mAb/mL swollen agarose. This work suggests the potencial use os OPS ligand affinity for the purification of IgG2a antibodies anti-Trypanosoma cruzi in a single step / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Nos últimos anos, estudamos vários aspectos da resposta imune naturalmente adquirida em indivíduos de diferentes áreas endêmicas da Região Amazônica expostos à malária. Para isso, utilizamos proteínas recombinantes baseadas em antígenos de formas sanguíneas de P. vivax, os quais têm sido considerados candidatos à vacina contra a malária vivax. No presente trabalho, nossos estudos imunoepidemiológicos concentraram-se em 396 indivíduos de uma comunidade rural da Amazônia ocidental brasileira, localizada no Estado do Acre, com o objetivo de realizar um estudo transversal e longitudinal da resposta de anticorpos contra um painel de proteínas recombinantes derivadas de merozoítos de P. vivax (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;). Para isso, os soros desses indivíduos foram testados por ELISA quanto ao reconhecimento das quatro proteínas recombinantes. As proporções de indivíduos na linha de base com anticorpos IgG contra MSP119, AMA- 1, MSP3&#945; e MSP3&#946; foram de 59,8%, 50,0%, 23,5% e 26,5%, respectivamente. Dentre esses indivíduos, apenas 10,9% tinham infecções por P. vivax, P. falciparum ou malária mista. No grupo de infectados por P. vivax, a proporção de respondedores foi maior para as proteínas recombinantes MSP119 e AMA-1, atingindo 78,6%, em ambos os casos. A proporção de indivíduos com anticorpos para cada uma das proteínas associou-se com o maior tempo de exposição à malária, exceto para a MSP3&#946;. Além disso, a positividade foi mais alta nas áreas de maior risco de transmissão. Não observamos associações relevantes entre o genótipo do antígeno Duffy dos indivíduos e presença de anticorpos para as proteínas estudadas. No estudo longitudinal, observamos um aumento da prevalência de respondedores durante a parasitemia patente, sendo de 81,9%, 80,9%, 31,9% e 48,9% para a MSP119, AMA-1, MSP3&#945; e MSP3&#946;, respectivamente. Em conclusão, nossos resultados confirmam a alta antigenicidade dessas proteínas, o que pode ser de grande importância para futuros ensaios clínicos na região. / In recent years we studied various aspects of the naturally acquired immune response in individuals from different endemic areas of the Amazon region exposed to malaria. For this purpose we used recombinant proteins based on P. vivax blood stage antigens considered candidates for a vaccine against vivax malaria. In the present study, we focused on 396 individuals from a rural community in western Brazilian Amazon located at the state of Acre. We conducted a transversal and longitudinal study of the antibody response to a panel of recombinant proteins representing P. vivax merozoites surface antigens (MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;). The sera of these individuals were tested by ELISA for the recognition of the four antigens mentioned above. The proportions of individuals at the baseline with IgG antibodies to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946; were 59.8%, 50.0%, 23.5% and 26.5%, respectively. Among these individuals, 10.9% had patent malaria infections with either P. vivax or P. falciparum or both. Among individuals with patent P. vivax infection, the frequency of responders was high for MSP119 and AMA-1, (78.6% in both cases). Except in the case of MSP3&#946;, the proportion of individuals with antibodies to each protein correlated with the time of malaria exposure. Also, the positivity was higher in areas of higher transmission levels. No relevant association was found between the Duffy genotypes and presence of antibodies to the different antigen. In longitudinal study, we observed an increased prevalence of responders during patent parasitemia, 81.9% 80.9% 31.9% and 48.9% to MSP119, AMA-1, MSP3&#945; and MSP3&#946;, respectively. In conclusion, our results confirm the high antigenicity of these proteins, which can be of great importance for future clinical trials in the region.

As gastroenterites ainda são um importante problema de saúde pública nos países em desenvolvimento e as Escherichia colí são as principais causas de diarréias. Adultos brasileiros apresentam anticorpos reativos com E. colí enteropatogênica (EPEC), que apresenta muitas semelhanças com E. colí enterohemorágica (EHEC) e pode ser responsável por complicações como a síndrome hemolítica urêmica e a colite hemorrágica. Ambas as bactérias apresentam um mecanismo patogênico comum: a formação da lesão \"attaching and effacing\" nos microvilus dos enterócitos, mediadas por fatores de virulência, como Intimina, Tir e as Esps. Os lipopolissacarídeos (LPS) são componentes da membrana externa das bactérias gram-negativas, incluindo E. colí. A infecção por EHEC 0157 resulta na produção de anticorpos séricos antiLPS 0157, que geralmente são indicativos de infecção recente. Neste trabalho, nós investigamos a presença de anticorpos séricos IgG e IgM anti-EHEC 0157:H7, EHEC 0111:H- e EPEC 0111:H- em adultos brasileiros, da Grande São Paulo. Amostras de soro foram coletadas de 200 adultos saudáveis, doadores de sangue, e um pool foi formado com 100 amostras. Anticorpos foram determinados em 100 amostras individuais por ELlSA com bactérias íntegras e anti-LPS para a determinação de anticorpos específicos anti-LPS 0111 e 0157 com o \"pool\" de soro como controle, em relação às concentrações de IgG e IgM totais determinadas simultaneamente. Os resultados foram submetidos a análise estatística. O repertório de anticorpos IgG e IgM para as três bactérias foi investigado por \"immunoblotting\" (18). A presença de anticorpos anti-bacterianos e anti-LPS foi confirmada. Existe uma correlação positiva entre os anticorpos reativos com as três bactérias, e entre os anticorpos anti-bactéria e anti-LPS. As concentrações de IgM anti-LPSs foi mais alta que IgG, o que está de acordo com o mecanismo imune esperado para um antígeno timo-independente. As concentrações de anti-LPS 0157 foram altas, apesar da baixa freqüência da bactéria 0157 em nosso meio. Os ensaios de 18 mostraram anticorpos reativos com bandas antigênicas sugestivas de fatores de virulência. A origem destes em nossa população poderia ser o contato com bactérias da microbiota ou do ambiente, de animais ou alimentos. Alternativamente, nossa população pode estar exposta à EHEC mais freqüentemente do que imaginado até agora. / Gastroenteritis is still an important public health problem in developing countries and Escherichia coli are frequent agents of diarrhea. Brazilian adults present antibodies reactive with the principal virulence factors of enteropathogenic E. coli (EPEC), which have many genetic and antigenic similarities with enterohemorrhagic E. coli (EHEC), that may be responsible for complications following diarrhea, as haemolytic uremic syndrome (HUS) and hemorrhagic colitis (HC). Both bacteria present a common pathogenic mechanism, with the formation of “attaching and effacing” lesion in microvilis’ enterocytes, mediated by virulence factors codified by the patogenicity island LEE, as Intimin, Tir e Esps. Lipopolysaccharides (LPS) are components of outer membrane and important virulence factors of Gram-negative bacteria including E. coli. The infection with EHEC O157 results in the production of serum antibodies to the O157 LPS antigens, and usually they are indicators of recent infection. In this work we investigated IgG and IgM serum antibodies reactive with EHEC O157:H7, EHEC O111:H- and EPEC O111:H- antigens in healthy Brazilian adults, living in São Paulo. Serum samples were collected from 200 healthy adults (blood donors) and a pool was formed with 100 samples. The antibody levels were determined by ELISA for 100 individual serum samples by means of a whole cell ELISA with the three bacteria and an anti-LPS ELISA for the determination of the concentrations of specific antibodies anti-LPS O111 and O157, using the serum pool as control, in relation to the total IgG and IgM concentrations determined simultaneously. The results were submitted to statistical analysis. The repertoire of IgG and IgM antibodies to the three bacteria was investigated by immunoblotting (IB). The presence of anti-bacterial and anti-LPS seric antibodies was confirmed. There is a positive correlation between the titers of antibodies reactive with the three bacteria and between anti-bacteria and anti-LPS antibodies. The concentrations of IgM anti-LPSs were significantly higher than IgG, which is in accordance with the immune mechanism expected to a thymus-independent antigen. Surprisingly the concentrations of anti-LPS O157 were high taking into account the low frequency of O157 bacteria isolation in our country. The IB assays showed the presence of antibodies, mainly IgG, reactive with many antigenic bands suggestive of virulence factors. The origin of anti-EHEC antibodies in our population could be the contact with microbiota or environment bacteria, and animal or human E. coli strains, pathogenic or not. Alternatively, our people may be exposed to EHEC more frequently than previously thought.

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Serpa_Gisele_M.pdf: 3619704 bytes, checksum: 1feef42faa8bb785a83f4c9f481a438c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Anticorpos monoc1onais são imunoglobulinas secretadas por uma célula híbrida, chamada hibridoma, que é fonnada pela fusão de um linfócito (produtor de anticorpos) e uma célula de mieloma, o que faz do hibridoma uma célula produtora de anticorpos virtualmente imortal. Os anticorpos monoc1onais têm sido utilizados nas áreas analítica e terapêutica, o que implica na necessidade de obtenção de anticorpos de alta pureza. Muitos estudos têm sido realizados visando a purificação de anticorpos monoc1onais, e destacam-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, hidrofóbicas e de a:f11Údade. Neste trabalho aplicou-se a cromatografia em membranas de álcool polietileno-vinílico, derivatizadas com ácido iminodiacético (IDA), com íons metálicos imobilizados na purificação de anticorpos monoc1onais IgGl a partir de sobrenadante de cultura celular. Para determinar as melhores condiçôes de adsorção e eluição, foram testados os íons Cu2+, Ni2+, Zn2+ e C02+, na presença de diferentes sistemas tamponantes. A seletividade dos metais, em cada um dos sistemas, foi determinada através de eletroforese SDS-PAGE e testes ELISA das frações dos picos de proteína obtidos. A melhor condição de purificação foi a alimentação de sobrenadante de cultura celular previamente precipitado e dialisado com solução de sulfato de amônio, em coluna contendo PEVA-IDA-Zn2+, em presença de tampão Tris-HCI 50 mM a pH 7,0 e eluição por aumento de concentração de Tris. A partir das isotermas de adsorção, determinou-se a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação do complexo IDA­Zn2+-IgGl que de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir, mostraram uma alta capacidade de adsorção (63,4 mg/g de membrana seca) e uma constante de dissociação (8,lxlO-6 M) característica de sistemas de média afinidade. Foram também determinadas as curvas de ruptura para o processo proposto, através de experimentos de fIltração a diferentes vazões de alimentação, utilizando um módulo contendo as fibras ocas com Zn2+ imobilizado, construído em nosso laboratório / Abstract: Monoc1onal antibodies are immunoglobulins produced by a hybrid cell ca11ed hybridoma. These cells result from the fusion of lymphocytes with malignant myeloma cells. Hybridomas cells express both the lymphocyte's property of specific-antibody production and the immortal character of the myeloma cells. Monoc1onal antibodies have been used in analy1ica1 and therapeutica1 areas. This application needs high1y pure antibodies. Many techniques have been studied focusing monoc1onal antibodies purification. These techniques inc1ude ion exchange, hydrophobic and affinity chromatography. In this study, we applied polyethylenevinyl alcohol (PEV A) membranes in the purification of monoc1onal antibody from cell culture supem.atant. These membranes were derivatized with the quelant agent, iminodiacetic acid (IDA). We evaluated the adsorption and purification of monoc1onal antibodies on the matrix with different immobilized metal ios, Cu2+, Ni2+, Zn2+ and C02+ and with different buffers. According to SDS­PAGE electrophoresis and ELISA analysis, the higher selectivity was obtained in the presence of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,0 and with elution by increasing Tris concentration, with immobilized Zn2+, wich provided the purification of IgG with traces of albumin. The adsorbent capacity and the dissociation constant of the complex IDA-Zn2+-IgGI were determinated from adsorption isotherms. According to the Langmuir model, the results indicated that the matrix presents high adsorption capacity (63,4 mg/g de chy membrane) and a dissociation constant (8,1 x 10-6 M) characteristic for intermediate affinity systems. We also evaluated the breaktrough curves for PEVA-IDA-Zn2+ membrane chromatography for the antibodies purification using different flow rates. These breaktrough CUIVes are important to sca1e up procedure / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8067_1.pdf: 2863981 bytes, checksum: c052a8dab422808863f0e213e2a49701 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / INTRODUÇÃO: O vírus Epstein-Barr, um herpesvírus que infecta mais de 90% da população mundial, pode desencadear ou agravar alterações auto-imunes, assim como pode anteceder o aparecimento das manifestações clínicas e imunológicas do Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES). Como os auto-anticorpos parecem exercer papel central na patogênese do LES, é importante correlacionar a presença e o título de anticorpos anti-EBV com a atividade do LES. OBJETIVO: Verificar a associação entre atividade do Lúpus Eritematoso Sistêmico, por meio dos critérios do SLEDAI, e a avidez das imunoglobulinas IgG anti-EBV. PACIENTES E MÉTODOS: Foi realizado estudo tipo caso-controle, envolvendo 66 pacientes, atendidos no ambulatório de Reumatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC-UFPE), no período janeiro de 2002 a fevereiro de 2003, distribuídos em dois grupos: caso, composto por 22 pacientes com LES em atividade e SLEDAI > 4, e controle, integrado por 44 pacientes com doença inativa, diagnosticada por SLEDAI ? 4. A presença e o índice de avidez de anticorpos IgG anti-EBV foram determinados pela técnica de ELISA. (Enzygnost? anti-ebv Dade Behring), no Setor de Virologia do Laboratório de Imunologia Keizo Asami (LIKA). Os índices de avidez e respectivas classificações da infecção foram: < 20, infecção reativada; entre 20 e 40, infecção indeterminada, > 40, infecção passada. RESULTADOS: Identificou-se positividade no teste de detecção de IgG para EBV em 21 (95,5%) casos e em 40 (90,9%) controles. O índice de avidez alcançou valores ?40 em 54 (88,5%) pacientes, sendo 34 (85%) do grupo controle e 20 (95,2%) do grupo caso; esteve entre 20 e 40 exclusivamente em 5 (12,5%) pacientes do grupo controle, e foi inferior a 20 em 2 (3,3%) pacientes. Adotando-se 20, 30 ou 40 como ponto de corte do índice de avidez, para diagnóstico de reativação da infecção por EBV, detectou-se terem sido classificados como infecção reativada, respectivamente, 1 (4,8%) paciente do grupo caso e 1 (2,5%) do grupo controle; 1 (4,8%) do grupo caso e 4 (10%) do grupo controle, 1 (4,8%) no grupo caso e 5 (12,5%) no grupo controle. CONCLUSÃO: A modificação do ponto de corte não alterou a distribuição dos pacientes com infecção ativa do grupo caso, mas o fez no grupo controle. Não ter sido possível demonstrar, no presente trabalho, associação entre a atividade do EBV e a do LES corroborou relatos semelhantes na literatura consultada. Esse fato parece indicar que a não eliminação dos linfócitos B infectados se deve a falha no mecanismo de apoptose ou na ação de linfócitos T citotóxicos permitindo a progressão do LES

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_leonardo_monte.pdf: 1685536 bytes, checksum: 2128191ebf9a0b395668fcbb7af16da9 (MD5) Previous issue date: 2009-05-11 / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria belonging to the Leptospira genus. Several mammals may carry the agent, and rats are the most important source of human infection in urban settings. The wide spectrum of clinical manifestations varies from mild cases, with fever and headaches, to severe presentations, with liver and kidney failure, which may lead to death. As a result of the various degrees of severity, leptospirosis is frequently mistaken, in its acute stage, with other tropical diseases such as influenza and dengue. The microscopic agglutination test (MAT) is considered the gold standard when diagnosing leptospirosis; however, the test presents limitations regarding sensitivity in the acute phase of the disease. Recently, surface proteins LigA and LigB have been identified to be related with leptospiral virulence. These proteins have been characterized as adhesins, with a proteic structure similar to Escherichia coli intimin and Yersinia pseudotuberculosis invasin, which are important virulence factors in these organisms. The goal of this study was to produce and characterize monoclonal antibodies (MAbs) against a truncated fragment of approximately 54 kDa, named rLigBrep, that comprise a identical portion of LigA and LigB (domains 2-7). The 5 MAbs obtained were of the IgG1 (2) and IgG2b (3) isotypes and their affinity constants for rLigBrep varied from 7 x 107 M-1 to 4 x 108 M-1. The MAbs were able to react with the native antigen in L. interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130 by indirect immunofluorescence, immunoblotting, whole-cell ELISA and immunoelectron microscopy. These results allow concluding that these MAbs are important tools for studies aiming understanding the role of Lig proteins in Leptospira pathogenesis and in the development of tests for diagnosis of leptospirosis. / A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas pertencentes ao gênero Leptospira. Diversos mamíferos podem albergar o agente, sendo o rato a principal fonte de infecção para humanos no ambiente. As manifestações clínicas da doença variam desde os sintomas leves, como febre e dores de cabeça, até os mais graves com insuficiência renal e hepática que podem levar o indivíduo à morte. Esse amplo espectro de sintomas faz com que a leptospirose seja freqüentemente confundida em sua fase aguda com outras doenças febris, como gripe e dengue. O teste de aglutinação microscópica (MAT) é considerado o padrão ouro para o diagnóstico laboratorial da leptospirose, entretanto, o teste apresenta limitações relacionadas com a sensibilidade na fase aguda da doença. Recentemente, as proteínas de superfície LigA e LigB foram identificadas e relacionadas com a virulência de leptospiras patogênicas. Estas proteínas foram caracterizadas como adesinas, possuindo estrutura protéica semelhante a intimina de Escherichia coli e invasina de Yersinia pseudotuberculosis, que são importantes fatores de virulência nestes microrganismos. O objetivo desse estudo foi produzir e caracterizar anticorpos monoclonais (MAbs) contra um fragmento truncado de aproximadamente 54 kDa, que codifica a região idêntica das proteínas LigA e LigB (domínios 2-7), denominado rLigBrep. Foram obtidos 5 MAbs dos isotipos IgG1 (2) e IgG2b (3), com afinidades por rLigBrep que variaram entre 7 x 107 M-1 e 4 x 108 M-1. Foi comprovado através de imunofluorescência indireta, immunoblotting, ELISA whole-cell e microscopia imunoeletrônica que os MAbs foram capazes de detectar o antígeno nativo presente em L. interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Estes resultados permitem concluir que os MAbs produzidos são importantes ferramentas para serem utilizados em estudos que visam entender o papel das proteínas Lig na patogênese das leptospiras e em testes diagnósticos para leptospirose.