Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-06T12:53:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Adriana Andrade.pdf: 2860120 bytes, checksum: 9c25748f97bf9e85c8b9bcc05e3f32d5 (MD5) / CAPES / O vírus da dengue (DENV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, apresentando quatro sorotipos denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. No Brasil, a infecção pelo DENV-4 ressurgiu em 2010, após 31 anos, expondo a população ao alto risco de desenvolvimento da dengue grave, devido à co-circulação dos quatro sorotipos. Nesse contexto, os anticorpos monoclonais (AcM) apresentam-se como uma ferramenta importante devido à sua potencial aplicação como ferramenta biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi a produção e caracterização de AcM contra DENV-4. A metodologia para a produção de AcM foi desenvolvida por Köhler e Milstein (1975). Resumidamente, os animais de experimentação foram hiperimunizados com antígeno viral DENV-4, obtidos a partir da multiplicação do vírus em células de cultura C6/36, e subsequente concentração e precipitação com polietilenoglicol 8000. A triagem dos sobrenadantes dos hibridomas para reatividade ao DENV-4 foi realizada pelo Ensaio Imunoenzimático (ELISA), e a caracterização dos AcM foi realizada pelas técnicas de ELISA, Dot-Blot, Imunofluorescência Indireta (IFI), Western-Blot. Um total de dez hibridomas foram obtidos e os AcM produzidos foram denominados A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1, H12. Os AcM apresentaram diferentes perfis de reatividade frente aos diversos testes de detecção antigênica, demonstrando um reconhecimento direcionado principalmente para prM. Em conclusão, este estudo mostra o potencial de utilização dos AcM produzidos como insumo biotecnológico; sejam em estudos a respeito do vírus e sua patogênese, sejam em uma possível aplicação como ferramenta imunodiagnóstica. / Dengue virus (DV) is an arbovirus belonging to family Flaviviridae, genus Flavivirus, with four serotypes named DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. In Brazil, the infection by DENV-4 reemerged in 2010 after 31 years, exposing the population at high risk for developing severe diseases because of the co-circulation of the four serotypes. The monoclonal antibodies (AcM) are important tools due to its potential application in biotechnology. The aim of this work was to produce and to characterize of AcM against DENV-4. The methodology to produce AcM was developed by Köhler and Milstein (1975). Briefly, experimental animals were hyperimmunized with DENV-4 viral antigen obtained to virus multiplication in C6/36 culture cells and subsequent concentration and precipitation with polyethylene glycol 8000. ELISA test was performed to screen hybridoma supernatants for reactivity to DENV-4, and the characterization of AcM was performed by ELISA, Indirect Immunofluorescence (IFI), Dot-Blot and Western-Blot techniques. A total of ten hybridomas were obtained producing AcM named A2, B1, B4, C11, D2, E4, F10, F12, H1 and H12. AcM showed different reactivity profiles in the tests, showing a dominant recognition to prM. In conclusion, this study shows the potential use of AcM produced as biotechnology tool; to study the virus and its pathogenesis, or a possible application in immunodiagnostic assays.

The genus Hantavirus, family Bunyaviridae, includes rodent-borne viruses that are transmitted to humans by inhalation of rodent secretions and excreta, or through direct contact with an infected rodent. They are associated with hemorrhagic fever and renal syndrome (HFRS) and with Hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS). In Brazil, more than 1,500 HCPS cases have been recorded, since 1993. In this study, it was investigated the presence of hantavirus antibodies in the population of Alagoas. For this, it was carried out an active surveillance for acute cases of hantavirus infection in hospitals of Alagoas State and also it was analyzed sera samples sent by LACEN-AL, from patients suspected of having other diseases, such as dengue and leptospirosis. In addition, it was investigated the presence of memory antibodies IgG to hantavirus in rural workers from Coruripe-AL, by performing a pilot study of serological survey in Usina Coruripe. Sera samples were tested by an enzyme immunoassay (ELISA) in house for detection of hantavirus antibodies, using a recombinant N protein of Araraquara hantavirus as antigen. Of the 64 samples analyzed by serology from patients who were classified as suspected of HCPS or HFRS, none was positive for IgM anti-hantavirus, however, one (1,56%) was reagent for IgG anti-hantavirus. In the survey for antibodies in 124 patients with leptospirosis confirmed by LACEN-AL it was found three (2,42%) samples that were reagent for IgG to hantavirus and none of them was reagent for IgM. In the 170 patients with clinical suspicion of dengue but non-reagent for NS1 the survey for both IgM and IgG to hantavirus was negative. The pilot study of serological survey in Coruripe showed immunity against hantavirus in 10 (4%) of 250 studied workers, among which five attested that had never lived or travelled out of state of Alagoas. Taken together, our findings suggest the circulation of hantavirus in the state and its silent occurrence in the region, causing inapparent infections, or even symptomatic, but that remain undiagnosed. This study is pioneer in the surveillance for hantavirus in the state of Alagoas. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hantavirus são vírus zoonóticos principalmente de roedores silvestres, pertencentes à família Bunyaviridae, os quais são transmitidos para seres humanos pela inalação de secreções ou excretas de roedores infectados ou pelo contato direto com os mesmos. Estes vírus podem causar graves doenças como a Febre Hemorrágica com Síndrome Renal (FHSR) e a Síndrome Pulmonar e Cardiovascular (SPCVH). No Brasil, já foram notificados mais de 1500 casos, desde 1993. Neste estudo, investigou-se a presença de anticorpos anti-hantavírus na população alagoana. Para isso, com finalidade diagnóstica, realizou-se uma busca ativa de casos agudos em hospitais de Alagoas e analisou-se amostras séricas encaminhadas pelo LACEN-AL, provenientes de pacientes suspeitos de outras enfermidades, como dengue e leptospirose. Também, foi investigada a presença de anticorpos de memória da classe IgG para hantavírus, em trabalhadores rurais de Coruripe/AL, em um estudo piloto para inquérito sorológico na Usina Coruripe. Para detecção dos anticorpos anti-hantavírus, amostras de soros foram submetidas a um teste imunoenzimático (ELISA) caseiro, utilizando-se como antígeno uma proteína N recombinante do hantavirus Araraquara. Foram estudadas 608 amostras séricas divididas nos seguintes grupos: 1- Pacientes internados, que se encaixavam nos critérios de suspeita clínica de hantavirose; 2- Pacientes com leptospirose; 3- Pacientes com suspeita clínica de dengue; 4- Estudo piloto para inquérito sorológico. Das 64 amostras séricas analisadas por sorologia procedentes de pacientes que se enquadravam como caso suspeito de SPCVH ou FHSR, nenhuma foi reagente para IgM anti-hantavirus, porém, uma (1,56%) foi reagente para IgG anti-hantavirus. Na pesquisa dos anticorpos em 124 pacientes com leptospirose confirmada pelo LACEN-AL foram encontrados três (2,42%) amostras reagentes para IgG anti-hantavirus e nenhuma reagente para IgM. Nos 170 pacientes com suspeita de dengue cuja pesquisa NS1 foi não reagente, não foram detectados nem IgG nem IgM anti-hantavírus. O estudo piloto do inquérito sorológico em Coruripe mostrou imunidade para hantavírus em 10 (4%) dos 250 trabalhadores estudados, dentre os quais, cinco alegaram nunca terem morado ou viajado para fora do Estado de Alagoas. Tomados em conjunto, nossos achados sugerem a circulação de hantavírus no estado e sua ocorrência silenciosa na região, causando infecções inaparentes, ou ainda, sintomáticas, mas que permanecem sem diagnóstico. Esse trabalho é pioneiro na busca por hantavirose no estado de Alagoas.

O parvovírus suíno (PPV) apresenta grande importância, principalmente em fêmeas nãoimunes, por causar perdas reprodutivas significativas. O primeiro trabalho foi desenvolvido sobre forma de revisão, e serviu como base para realização dos estudos seguintes. O segundo trabalho foi conduzido para determinar a resposta de anticorpos para PPV em 127 leitoas após a vacinação, avaliar a transferência de imunidade passiva e estimar a queda de anticorpos colostrais para PPV na leitegada. Foi realizada coleta de sangue nas leitoas em: (A) antes da primeira vacinação para PPV, (B) após a segunda dose; (C) no parto e (D) durante a segunda gestação. Além disto, colostro também foi coletado (E). Três leitões de cada fêmea foram selecionados e amostras de sangue foram coletadas: antes de mamar o colostro, 7, 21, 57, 87 e 128 dias de idade, a fim de verificar o declínio da imunidade passiva e estimar a meia-vida de anticorpos para PPV. O número de fetos mumificados, natimortos, nascidos vivos e nascidos totais do primeiro e segundo parto foram analizados. Os anticorpos para PPV foram testados por inibição da hemaglutinação (HI) e enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), a fim de verificar a concordância entre estes dois métodos. A possível associação entre os títulos de anticorpos das fêmeas e dos leitões no soro e no colostro com os dados reprodutivos também foi investigada. A maioria das fêmeas (85,83%) tiveram anticorpos para PPV antes da vacinação, mas depois da vacina, todas as fêmeas soroconverteram. Aos sete dias de idade a maioria dos leitões apresentaram anticorpos para PPV e em torno dos 57 dias de idade somente 35,29% dos leitões eram positivos, alcançando a nulidade de anticorpos para PPV aos 87 dias de idade. A meia-vida estimada dos anticorpos colostrais foi 29,80 dias. A correlação entre o soro dos leitões e da fêmea no momento do parto foi r=0,77 (P<0,001) e com o colostro o valor de r foi 0,72 (P<0.001). A concordância entre os testes de ELISA e HI foi moderada (Spearman’s ρ= 0,89 e R2= 0.67). Houve diferença somente no número de mumificados entre o primeiro e segundo parto (P<0,001). O terceiro trabalho objetivou avaliar o perfil de anticorpos para PPV em diferentes sistemas de reposição de leitoas, correlacionando com dados reprodutivos. Cento e cinquenta 11 nulíparas com duas doses de vacina para PPV foram selecionadas de três sistemas de reposição diferentes: quarto sítio - A (n=36), granja receptora do quarto sítio - B (n=57) e granja multiplicadora - C (n=57). Os anticorpos para PPV foram medidos utilizando um teste de ELISA. Houve diferença entre as três granjas com relação ao título de anticorpos (P<0,05). Ao comparar os dados reprodutivos entre as granjas, houve diferença entre elas no número de nascidos totais e nascidos vivos, mas não foi observada diferença no percentual de natimortos e de mumificados (P>0,05). A correta preparação da leitoa, objetivando a proteção no momento da cobertura é fundamental para alcançar bom desempenho reprodutivo, independente do sistema de reposição utilizado. / Porcine parvovirus (PPV) has a great importance because causes significantly reproductive losses, mainly in non-immune gilts. The first study was developmented as a review, and served as a basis to carry out the following studies. The second study was conducted to determine the antibody response for PPV of 127 gilts in field conditions after vaccination, to evaluate the transfer of passive immunity and to estimate the decay of acquired colostral antibodies to PPV in the littermate. Gilts were bled at: (A) before the first vaccination to PPV, (B) after the second dose; (C) at farrowing and (D) during the second pregnancy. Added to these, colostrum was also collected (E). Three piglets of each gilt were selected and blood samples were collected: prior to initial colostrum intake, 7, 21, 57, 87 and 128 day-old, in order to verify the decrease of passive immunity and estimate the half-life of PPV antibodies. The number of mummified fetus, stillbirths, born alive and total born were analyzed from first and second parturition. The PPV antibodies were tested both with haemagglutination inhibition (HI) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to study the agreement between these methods. The possible association between gilts and piglets antibody titers in serum and colostrum with reproductive data was also investigated. Most gilts (85.83%) had antibodies to PPV before vaccination, but after vaccine, all gilts seroconverted. At 7 day-old most part of piglets had PPV antibodies and around 57 days-old only 35.29% of piglets were positive, reaching the PPV antibodies nullity at 87 days-old. The estimated average half-life of acquired colostral antibodies was 29.80 days. The correlation between piglets serum with gilt serum at farrowing time was r=0.77 (P<0.001) and with colostrum the r value was 0.72 (P<0.001). The agreement between ELISA and HI tests was moderate (Spearman’s ρ= 0.89 and R2= 0.67). The only difference between first and second parturition was observed on mummified fetuses (P<0.001). The objective of the third study was to evaluate the PPV antibodies profile in different gilts replacement systems, correlating with reproductive data. A hundred and fifty gilts with two doses of 13 PPV vaccine were selected from three different gilts replacement systems: Fourth site - A (n=36), fourth site receiver herd - B (n=57) and a farm producing dam lines - C (n=57). The PPV antibodies were measured by an ELISA test. There were a difference on antibody titers among the three herds (P<0.05). When we compared the reproductive data among herds, there were difference on total born and born alive, but this difference was not observed on the percentual of stillbirths and mummified (P>0.05). The correct gilt preparation, aiming the protection on mating time is fundamental to reach a great reproductive performance, independent of the replacement gilt system used.

Com o objetivo de avaliar as características operacionais da quantificação do RNA do vírus da hepatite C (VHC) pelo método do DNA ramificado (bDNA) e correlacionar a taxa de viremia com aspectos demográficos, laboratoriais e histopatológicos da doença hepática crônica C, foram estudados prospectivamente, no período de julho de 1991 à julho de 1992, 1 07 pacientes provenientes do ambulatório do Serviço de Hepatologia da Universidade de Miami, Flórida, E.U.A.. Todos apresentavam elevação das aminotransferases por mais de seis meses, anticorpos anti-VHC positivos por ELISA 11 e RIBA 11, RNA do VHC positivo por reação em cadeia da polimerase pós-transcriptase reversa (RT-PCR) e diagnóstico histopatológíco de hepatite crônica ou cirrose. Quanto ao sexo, 68 dos 107 (63,6%) pacientes eram homens e 39 (36,4%) eram mulheres. A idade variou entre 29 e 84 anos (média de 46,2 +/- 12,6 anos). Com relação à cor, 93 dos 107 (86,9%) pacientes eram brancos, 13 (12,1%) eram pretos e 1 (0,9%) amarelo. Como controles, foram selecionados 41 indivíduos com anticorpos anti-VHC negativos por ELISA li e RIBA 11 e negativos para oRNA do VHC por RT-PCR, compreendendo 11 pacientes avaliados ambulatorialmente no mesmo período (6 com cirrose biliar primária e 5 com hepatite crônica B), além de 30 voluntários saudáveis. Do total de 107 pacientes positivos para o RNA do VHC por RT-PCR, o teste bONA foi positivo em 88 (sensibilidade de 82,2%), sendo negativo em todos os controles (especificidade de 1 00% ). A concordância observada entre ambos os testes foi de 87,2%, com índice "kappa" de 0,74. A correlação entre os aspectos demográficos e o grau de atividade histopatológica mostrou que os pacientes com cirrose (CIR) possuíam idade média significativamente superior aqueles diagnosticados como hepatite crônica ativa (HCA) (52,4 +/- 14,3 versus 46,8 +/- 12,3 anos; p<0,02) ou hepatite crônica persistente (HCP) (52,4 +/- 14,3 versus 40,8 +/- 8,9 anos; p<0,0002). A m.édia da aminotransferase do aspartato (AST) mostrou-se significativamente superior no grupo CIR quando comparado aos grupos HCA (139,5 +/- 81,4 versus 96,4 +/- 40,2 UI/I; p<0,009) e HCP (139,5 +/- 81,4 versus 87,5 +/- 40,2 UI/I; p<0,009). A quantificação do RNA do VHC por bDNA não apresentou relação com os aspectos demográficos e laboratoriais dos pacientes com doença hepática crônica C. Porém, com relação a atividade histopatológica, observou-se que os indivíduos do grupo HCA apresentaram taxa média de viremia significativamente superior aos grupos HCP (16.908.490 +/- 13.654.660 versus 3.796.030 +/- 8.075.090 eq RNA-VHC/ml; p<O,OOOO) e CIR (16.908.490 +/- 13.654.660 versus 4.200.030 +/- 5.543.480 eq RNA-VHC/ml; p<O,OOOO). Concluindo, entre os vários resultados que confirmam dados anteriores ou ampliam os conhecimentos relativos a alguns aspectos da doença hepática crônica C, destaca-se a elevação progressiva da idade com relação à progressão da atividade histopatológica, a concordância substancial entre a quantificação viral por bDNA e a detecção do RNA do VHC por RT-PCR, além do achado de maior taxa média de viremia nos pacientes com HCA em relação aos demais grupos, aqui objetivamente demonstrada.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A ImunodefiCiência Comum Variavel (ICV) e a Agamaglobulinemia Ligada ao X (XLA) sao imunodefiCiências primarias (IDP´s) classificadas como defiCiências de anticorpos resultando em hipogamaglobulinemia. Em semelhanca com outras doencas cronicas, as IDPÆs podem cursar com disturbios inflamatorios, endocrinos e com a exacerbacao do estresse oxidativo. Com a melhoria nos protocolos de atendimento clinico houve impacto positivo na sobrevida destes pacientes, surgindo assim preocupacao com o risco para o desenvolvimento de outras doencas cronicas, como as cardiovasculares. Objetivos: Avaliar o perfil lipidico e a concentracao serica da apolipoproteina A-I (apo A-I) e da particula pequena e densa do LDL-c (sdLDL), e relaciona-las com biomarcadores associados ao risco de doenca cardiovascular dos pacientes com ICV e XLA. Casuistica e Metodos: Foram avaliados, por meio de estudo transversal e controlado, 24 pacientes atendidos no Departamento de Pediatria da UNIFESP e 12 controles saudaveis pareados por idade e sexo com os pacientes. Foram realizadas a avaliacao antropometrica e dosagens sericas de colesterol total (CT) e as fracoes HDL-c e LDL-c, com analise da apo A-I e quantificacao de sdLDL, triglicerideos (TG), proteina C reativa (CRP), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e as enzimas relacionadas ao risco cardiovascular mieloperoxidase (MPO), proteina de transferencia de ester de colesterol (CETP) e a lecitina colesterol aciltransferase (LCAT). Resultados: As concentracoes da CRP (p=0,008) e TNF-alfa (p<0,001) foram significativamente mais elevadas, enquanto o HDL-c (p=0,025) e a apo A-1 (p=0,013) foram significantemente mais baixas nos pacientes comparativamente aos controles. No grupo de pacientes foi observada correlacao negativa e significante entre o HDL-c e o TNF-alfa (r=-0,406; p=0,049) e os TG (r=-0,641; p=0,001). Verificou-se diferenca estatisticamente significante para a idade (p= 0,024), indice de massa corporal (p=<0,001), circunferencia abdominal (p=0,001), TG (p=0,020), MPO (p=0,036) e TNF-alfa (p=0,045) quando se comparou entre os pacientes a presenca ou nao de dislipidemia para HDL-c. Conclusao: Os pacientes com IDPÆs demonstraram risco cardiovascular elevado caracterizado pela elevacao de marcadores inflamatorios em associacao com enzimas que participam da oxidacao de lipoproteinas. A identificacao precoce dessas alteracoes permite o estabelecimento de medidas de prevencao e tratamento visando a reducao do risco cardiovascular nesses pacientes / FAPESP: 2011/13336 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Objetivo: Detectar a prevalência da hepatite C nas unidades de diálise em Maceió. Métodos: 569 pacientes com Doença Renal Crônica (DRC) em programa regular de hemodiálise (HD) em 6 clínicas de diálise foram incluídos. A análise laboratorial constou da pesquisa do anticorpo do vírus da hepatite C (anti-HCV) ELISA-3ª (ensaio imunoenzimático de 3ª geração) nos pacientes. Nos casos positivos para o anti-HCV, foi realizada a transcrição reversa seguida da amplificação do c-DNA em cadeia RT-PCR (HCV-RNA). Resultados: Detectaram-se 66/569 pacientes com sorologia positiva, o que corresponderia a uma prevalência de 11,6%, porém, quando realizamos a RT-PCR nos pacientes com anti-HCV positivo, o percentual da viremia encontrada é de 39,5% (26/66). Conclusões: O anti-HCV, por sua sensibilidade e baixo custo, deve ser realizado entre os portadores de DRC como teste para screening e que a RT-PCR, por ser um exame de maior especificidade, deve ser usado para a confirmação de resultados positivos e verificação de falsopositivos encontrados no ELISA-3ª. / Purpose: The objective of this study was to detect the prevalence of hepatitis C in the units of dialysis in Maceió. Methods: 569 patients with Doença Renal Crônica (DRC) in regular program of hemodiálise (HD) in 6 clinics of dialysis had been enclosed. The laboratorial analysis consisted of the research of the antibody of the virus of hepatitis C (anti-HCV) ELISA-3ª (imuno-enzymatic assay of 3ª generation) in the patients. In the positive cases for anti-HCV, reversa followed of the amplification of cDNA in chain RT- PCR was carried through the transcription (HCV-RNA). Results: 66/569 patients with positive sorologia had detected themselves, what she would correspond to a prevalence of 11,6%, however, when we carry through the RT-PCR in the patients with anti-HCV positive, the percentage of the joined viremia is of 39,5% (26/66). Conclusions: We conclude that the RT-PCR, for being an examination of bigger especificidade, must be used for the confirmation of positive results and verification of false-positives found in the ELISA-3ª. However, anti-HCV, by its sensitivity and low cost, must be carried through enters the DRC carriers as test for screening. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10645.pdf: 540710 bytes, checksum: 5f5de7e771c848ceae0f6cfc22f8c4e2 (MD5) / A imunização gênica pode contornar alguns problemas encontrados na imunização protéica, quais sejam as dificuldades na obtenção do antígeno purificado e a reatividade da resposta imune (r.i.) com a forma nativa do antígeno. O gene que codifica o antígeno de interesse, carregado por um vetor, é injetado no animal e a proteína é expressa in vivo, com a estrutura tridimensional apropriada, favorecendo a produção de anticorpos específicos. Entretanto, o esquema de imunização gênica pode determinar a eficácia da vacina de DNA. No presente estudo, comparamos quatro protocolos de imunização gênica, usando três antígenos diferentes: dois deles guardam grande homologia na escala filogenética, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) e human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), e um de origem vegetal, o inibidor de serina protease extraído de Bauhinia bauhinioides (BbKi). Para tanto, grupos de camundongos Balb/c foram imunizados com DNA plasmideal carregando o gene hVEGF165, hFGF-2 ou BbKi. No primeiro protocolo, imunizamos os animais via intraesplênica (i.s.); no segundo, via intramuscular (i.m.); no terceiro, via i.m. seguida de eletroporação (ep); e no quarto, via i.m. seguida de ep em animais préimunizados com células modificadas para expressar os respectivos antígenos. Soros de animais imunizados foram analisados por ELISA para detecção da presença de anticorpos anti-hVEGF165, anti-hFGF-2 ou anti-BbKi. Os resultados mostraram que a imunização i.s. não provocou r.i. humoral detectável em nossas condições. Por outro lado, análises estatísticas indicaram que a ep melhorou muito a r.i. à imunização i.m. e que três imunizações gênicas seguidas de ep produzem o mesmo efeito que duas da mesma forma em animais pré-imunizados com células transfectadas para expressar o antígeno correspondente. Nossos resultados mostraram que todos os protocolos funcionaram de maneira similar para os três antígenos estudados e que a imunização gênica via i.m. seguida de ep foi o esquema de imunização mais vantajoso. Ainda, a r.i. à imunização i.m. seguida de ep foi comparável à obtida por imunização protéica no caso da proteína vegetal. Finalmente, esses achados permitiram selecionar um protocolo eficiente de imunização gênica que torna possível a obtenção de anticorpos na falta da proteína purificada. / Gene immunization may bypass some difficulties found with protein immunogen, such as the obtainment of purified antigen and the immune response reactivity to its native conformation. Thus, antigen encoding DNA inserted into a vector is inoculated into animal and the protein expressed in vivo with the appropriate three-dimensional structure stimulates the production of specific antibodies. However, the gene immunization methods may determine the efficacy of DNA vaccine. The present study compared four protocols of DNA immunization, using three different antigens: two of them phylogenetically conservative, human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) and human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), and other from vegetal origin, Kunitz-type serine protease inhibitor from Bauhinia bauhinioides (BbKi). For this, Balb/c mice were immunized with plasmid DNA encoding hVEGF165, hFGF-2 or BbKi genes. In the first protocol, animals were immunized by intrasplenic (i.s.) pathway; in the second, intramuscularly (i.m.); in the third, i.m. injections were followed by electroporation (ep); and in the fourth, i.m. injections followed by ep were performed in animals pre-immunized with antigen-transfected cells. Sera were analyzed by ELISA to detect the presence of anti-hVEGF165, -hFGF-2 or -BbKi antibodies. Results showed that i.s. immunization did not elicit detectable humoral immune response in our conditions. On the other hand, statistical analyses revealed that the ep improved the immune response to i.m. immunization and that three DNA immunizations followed by ep elicited the same effect obtained by two i.m. immunizations followed by ep in pre-immunized animals with antigentransfected cells. Our results showed that all protocols worked similarly for the three studied antigens and that i.m. gene immunization followed by ep was the more advantageous protocol. In addition, the immune response to i.m. immunization followed by ep was comparable to that obtained by protein immunization. Finally, these data allowed us select an efficient DNA immunization protocol that makes possible the antibody obtainment in the lack of purified protein. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Melanomas se destacam entre os tumores sólidos por apresentar alto potencial de malignidade e incidência crescente, especialmente entre indivíduos jovens. Identificação de marcadores moleculares em melanomas é de enorme interesse para uso clínico e para estudos relacionados ao seu desenvolvimento. A linhagem de melanoma murino B16 tem sido amplamente empregada visando melhor compreensão do processo metastático. Objetivo: identificar moléculas na superfície de células B16, empregando anticorpos monoclonais, que apresentem função biológica importante para essas células, bem como investigar expressão de moléculas reconhecidas pelos mesmos mAbs em melanoma humano. Métodos: camundongos C57Bl/6 foram imunizados com células B16 irradiadas para produção de híbridos produtores de mAb. Resultados: após fusão foi obtido mAb da classe IgM, designado G12F2, que reconheceu uma única banda de aproximadamente 230 kDa em extrato total de células B16. A molécula era expressa na superfície celular e não por células não tumorigênicas, como fibroblastos ou melanócitos melan-a. Células não tumorigênicas, derivadas de melan-a, também não a expressaram ao passo que células tumorigênicas, de mesma origem, expressaram-na em grande quantidade. Variante menos metastática da linhagem B16 expressou menor quantidade desta molécula quando comparado à variante mais metastática. A neutralização da molécula de 230 kDa com mAb G12F2 inibiu proliferação, migração e invasão por células B16 in vitro. Também nestas condições, G12F2 promoveu atividade citolítica contra células B16, mediada por complemento. Por outro lado, adição in vitro de mAb G12F2 em nada alterou adesão das células B16 à fibronectina e laminina, ou adesão célula-célula. In vivo, o tratamento com mAb G12F2 inibiu crescimento do nódulo tumoral e formação de metástases pulmonares. Quando testado contra extrato de tumores de origem humana, como carcinoma e melanoma, mAb G12F2 reconheceu banda de 75 e 67 kDa, respectivamente. Por fim, foi demonstrado que mAb inibiu proliferação de células de melanoma humano in vitro. Conclusões: a molécula de 230 KDa parece ter importância durante crescimento do melanoma murino; identificação de molécula homóloga em melanoma humano fornecerá subsídios para diagnóstico e protocolos visando imunoterapia. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T17:32:40Z No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T17:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) Previous issue date: 2003 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O diagnóstico de certeza da leishmaniose visceral (LV) só é conseguido através da demonstração do parasito diretamente ou em cultura o que implica em procedimentos demoradc» envolvendo certo risco e/ou dor. Este estudo tem como objetivos a produção de AcMc diVí^ã-Leishmania chagasi, padronização de um ensaio de imunohistoquímica para visualização de amastigotas de Leíshmania utilizando AcMc e verificação do potencial de um ELISA de inibição utilizando AcMc em quantificar amastigotas de Leishmania. [MATERIAIS E MÉTODOS] Camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno de amastigotas de L chagasi ou com a proteína recombinante Lc-13 cujo gene foi clonado de uma biblioteca de cDNA de L chagasi. Os esplenócitos destes animais foram fundidos com células SP 2-0 através de polietilenoglicol. Estes, juntamente com um AcMc já disponível, o 5A9H8, foram usados em um ensaio de imunohistoquímica utilizando fígado de hamster infectado com L chagasi parafinado fixado em formalina, testando-se diferentes protocolos de exposição de epitopos. Também com os mesmos AcMc foi realizado um ELISA de inibição a fim de quantificar amastigotas de /.e/s/?/nan/a.[RESULTADOS] Foram encontrados dois clones reativos em cada fusão; o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. Os AcMc 10B4/6 e o 10D8 são ambos lgG1, reconhecem antígenos com peso molecular entre 47 e 57 kDa e são possivelmente idênticos. Foi encontrada marcação de amastigotas, em tecidos infectados, com os seguintes AcMc: 5A9H8, em seções pré-tratadas com calor, e o 10B4/6 e o 10D8, em seções pré-tratadas com pronase. No ELISA de inibição o AcMc 5A9H8 mostrou-se capaz de detectar no mínimo 10® parasitos por poço de placa de microtitulação. / The certainty of diagnosis in visceral leishmaniasis is only achieved through the direct demonstration of parasites in culture, implying in long procedures and in risks and/or pain for the patients. The objectives of this study is the production of anti-Leishmania chagasi monoclonal antibodies (mAb), standardization of an immunohistochemical assay for allowing the visualization of Leishmania amastigotes using the mAb, and finding out the potential of a mAb-based inhibition ELISA for quantifying Leishmania amastigotes. [MATERIAL & METHODS] BALB/c mice were immunized with L chagasi amastigote antigens or with a recombinant protein denominated Lc13, the gene of which was cloned from a L chagasi amastigote cDNA library. Splenocytes from these animals were obtained and fused with SP 2-0 myeloma cells by using polyethylene glycol. The mAb produced by the hybrid cells, together with an available mAb (5A9H8), were used in an immunohistochemical assay, using paraffin sections of infected hamster liver. Different protocols for the exposition of epitopes were evaluated. One of the mAb was also used in an inhibition ELISA to quantify Leishmania amastigotes. [RESULTS] Two anti-amastigote mAb-producing clones were obtained in each fusion, the 10B4/6 and the 10D8 mAb in the first and the 2C10D5 and the 11E8H7 mAb in the second. The 10B4/6 and the 10D8 mAb, obtained from the fusion of myeloma with splenocytes of an animal immunized with lysed amastigotes, were both lgG1, recognized the same antigens, with molecular weights ranging from 47 to 57 kDa, and were possibly identical, o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. The following mAb stained amastigotes in infected tissues in an im mu noperoxidase reaction: the 5A9H8, using heat-treated sections, and the 10B4/6 and the 10D8, in pronase-treated sections. The 5A9H8 mAb detected a minimum of 10® parasites per well In the inhibition ELISA.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-07-09T20:27:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_final_Tatiane_Santos.pdf: 4286215 bytes, checksum: d62ff8feaeb36d552e6e5741e6b2d916 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-09T20:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_final_Tatiane_Santos.pdf: 4286215 bytes, checksum: d62ff8feaeb36d552e6e5741e6b2d916 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz / Para avaliação dos parâmetros de segurança do preparado vacinal r-Sm14 contra a esquistossomose, testes pré-clínicos e clínicos devem ser realizados. O presente estudo tem por objetivo avaliar a segurança do antígeno recombinante Sm14 e do adjuvante LIPID-A (GLA) quando administrado em coelhos subcutaneamente utilizando múltiplas doses. O teste toxicológico do antígeno vacinal r-Sm14 foi realizado de acordo com o protocolo toxicológico adotado e desenvolvido por BAS Evansville e Corixa Corporation (2002), segundo as normas do FDA Good Laboratory Practice Regulations (21CFR Part 58) e CPMP guidance documents (CPMP/SWP/465/95 E CPMP/ICH302/95). Neste estudo, 24 coelhos (Oryctolagus cuniculus) da raça Nova Zelândia, sendo 12 machos e 12 fêmeas foram distribuídos em 4 grupos. Cada grupo foi composto por três coelhos machos e três fêmeas imunizados com antígeno r-Sm14 expresso em Pichia pastoris (Grupo A/Sm14Pp+GLA), antígeno r-Sm14 expresso em Escherichia coli (Grupo B/Sm14Ec + GLA), adjuvante GLA-SE (Grupo C) e PBS (Grupo D/controle). Foram avaliados diariamente o aspecto físico dos animais, o nível de estresse, consumo de alimentos e água; semanalmente, variação da evolução ponderal; e, antes e após as inoculações, por meio de sangrias, parâmetros bioquímicos e hematológicos. Ao final do teste todos os animais foram eutanasiados para investigação anatomopatológica. Os animais não apresentaram mudanças significativas no aspecto físico e no nível de estresse. Não houve diferença de peso estatisticamente significativa entre os grupos e todos os resultados encontrados estão de acordo com os dados fisiológicos esperados para coelhos. Os pesos de todos os órgãos e estruturas e a maioria dos parâmetros bioquímicos e hematológicos analisados se encontravam dentro da normalidade. A análise anatomopatológica evidenciou ausência de alterações macroscópicas e histopatológicas significativas na pele do local das imunizações e em todos os órgãos analisados. Alguns animais, inclusive do grupo controle, apresentaram pequenos focos de calcificação nos rins, comuns em coelhos, associados às condições nutricionais. Portanto, nenhum dado indicativo de qualquer ação tóxica provocada pela imunização com diferentes formulações da proteína r-Sm14 e/ou adjuvante foi encontrado, demonstrando uma completa segurança do preparado vacinal, dentro das condições experimentais apresentadas. / To assess the safety parameters for preparing a vaccine against schistosomiasis from recombinant r-Sm14, pre-clinical and clinical tests must be carried out. The aim of this study was to evaluate the safety of the r-Sm14 antigen and the adjuvant LIPID-A (GLA) when administered subcutaneously to rabbits in multiple doses. The toxicological test of the vaccine antigen r-Sm14 was performed according to the protocol developed and adopted by BAS Evansville and Corixa Corporation (2002), according to the standards of the FDA Good Laboratory Practice Regulations (21CFR Part 58) and the CPMP guidance documents (CPMP/SWP/465/95 and CPMP/ICH302/95). A total of 24 rabbits (Oryctolagus cuniculus) of the New Zealand breed were used (12 males and 12 females), distributed in four groups. Each group was composed of three males and three females, immunized with the r-Sm14 antigen expressed in Pichia pastoris (Group A/Sm14Pp+GLA), the r-Sm14 antigen expressed in Escherichia coli (Group B/Sm14Ec + GLA), the adjuvant GLA-SE (Group C) and PBS (Group D/control). The animals’ physical appearance, stress level and food and water consumption were assessed daily, while the weight evolution was measured weekly. Finally, the biochemical and hematological parameters were analyzed by means of blood tests before and after the inoculations. At the end of the test, all the animals were euthanized for anatompathological examination. The animals did not show significant changes in physical appearance and stress level. There also was no significant weight difference among the groups and all the data were in accordance with the physiological data expected for rabbits. The weights of all the organs and structures and the majority of the biochemical and hematological parameters analyzed were within the normal range. The anatomopathological examination revealed the absence of macroscopic and histopathological changes in the skin at the vaccination site and in all the organs analyzed. Some animals, including in the control group, presented small calcification foci in the kidneys, common in rabbits, associated with the nutritional conditions. Therefore, no signs of any toxic action caused by the immunization with the different formulations of the protein r-Sm14 and/or adjuvant were found, demonstrating the complete safety of the vaccine preparation, under the described experimental conditions.