Candida spp. constitui o grupo mais importante de fungos patogênicos oportunistas, que está associado a elevadas taxas de mortalidade. As principais espécies causadoras de infecções sanguíneas são: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis. Conhecer a distribuição das espécies e padrões de suscetibilidade aos antifúngicos é fundamental para o estabelecimento de medidas de controle da candidemia. A patogenicidade dessas leveduras depende de alguns fatores de virulência como a capacidade de escapar dos mecanismos de defesa do hospedeiro e a capacidade de formação de biofilme. Biofilmes são comunidades microbianas organizadas aderidas a uma superfície sólida, biótica ou abiótica, e envolvidas por uma matriz polissacarídica extracelular. Eles podem apresentar resistência a antimicrobianos e ser fontes de infecções crônicas e persistentes, e a sua relação fungo-hospedeiro é pouco conhecida. O objetivo desse estudo foi avaliar o impacto da formação de biofilme sobre o perfil de suscetibilidade a antifúngicos, de espécies de Candida isoladas em episódios de candidemia no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Foram isoladas 70 amostras de Candida spp. através de hemoculturas, e características dos pacientes foram avaliadas, através da análise dos prontuários médicos. A espécie mais prevalente foi C. albicans, seguida por C. parapsilosis (sensu latu), C. glabrata e C. tropicalis a menos frequente. A Concentração Inibitória Mínima dos antifúngicos anfotericina B (AMB), caspofungina (CAS), fluconazol (FLC) e voriconazol (VOR) foi determinada em células planctônicas dos 70 isolados de Candida spp., de acordo com as diretrizes do CLSI. Dentre os isolados, um de C. albicans foi resistente ao FLC e VOR; todos os isolados de C. glabrata e um isolado de C. parapsilosis foram suscetíveis dose dependente ao FLC, dois isolados de C. glabrata foram suscetíveis dose dependente à CAS e um isolado de C. tropicalis foi suscetível dose dependente ao VOR. A capacidade de formação de biofilme pelos isolados foi analisada, e de acordo com a atividade metabólica, todos os isolados de C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis foram capazes de formar biofilme em placas de poliestireno, em 24 horas, e 50% dos isolados de C. parapsilosis não foram capazes de formar biofilme. Biofilmes de cada espécie foram visualizados por microscopia eletrônica de varredura, e demonstraram diferenças estruturais de acordo com cada espécie. A Concentração Erradicatória Mínima dos antifúngicos aos biofilmes de todos os isolados foi determinada. AMB e CAS mostraram atividade contra biofilmes de Candida spp., contudo, biofilmes de certos isolados requereram concentrações maiores que as necessárias para inibir o crescimento de células planctônicas; FLC e VOR, no geral, não possuem ação eficaz contra biofilmes de Candida spp.. Quando isolados de C. albicans, com diferentes perfis de formação de biofilme, foram avaliados quanto a sua virulência in vivo no hospedeiro invertebrado Galleria mellonella, foi obervada uma tendência de maior virulência no grupo de isolados previamente classificados com alta formação de biofilme. Os resultados obtidos refletem a influência da formação de biofilme na suscetibilidade dos isolados clínicos aos antifúngicos comumente utilizados na prática médica / Candida spp. is part of the most important group of opportunistic pathogenic fungi, which is associated with high mortality rates. The main species causing bloodstream infections are: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis. The knowledge about these species´ distribution and their antifungal susceptibility profiles is essential to establish measures to control candidemia. The pathogenesis of these yeasts depends on some virulence factors, such as their ability to escape host defense and their capacity of forming biofilm. Biofilms are organized microbial communities adhered to a biotic or abiotic solid surface and surrounded by an extracellular matrix; they can be resistant to antimicrobial agents and the source of chronic and persistent infections, and its fungal-host relationship is still little known. The aim of this study was to evaluate the impact of biofilm formation on antifungal susceptibility profile of Candida species isolated from candidemia episodes at the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A total of 70 Candida spp. samples were isolated through blood culture, and the patients\' characteristics were evaluated through the analysis of their medical records. The most isolated species was C. albicans, followed by C. parapsilosis (sensu latu), C. glabrata, and C. tropicalis the least frequent. The Minimal Inhibitory Concentration for the antifungal agents amphotericin B (AMB), caspofungin (CAS), fluconazole (FLC) and voriconazole (VOR) were determined in planktonic cells for the 70 Candida spp. isolates, following CLSI guidelines. Among the isolates, one C. albicans isolate was resistant to FLC and VOR; all the C. glabrata and one C. parapsilosis isolates were susceptible dose dependent to FLC; two C. glabrata isolates were susceptible dose dependent to CAS, and one C. tropicalis isolate was susceptible dose dependent to VOR . The isolates´ ability to form biofilm was analyzed and according to the metabolic activity, all the C. albicans, C. glabrata and C. tropicalis isolates were able to form biofilm in polystyrene plates, in 24 hours, and 50% of the C. parapsilosis isolates were not able to form biofilm. Biofilms of each species were visualized through scanning electron microscopy and structural differences were seen according to each species. The Minimal Eradication Concentrations of the antifungal to the biofilms were determined. AMB and CAS showed activity against Candida spp. biofilms, however, some isolates needed concentrations much higher than the used to inhibit planktonic growth; FLC and VOR in general were not efficient against Candida spp. biofilms. When C. albicans isolates, which showed different biofilm formation profiles, were tested about their in vivo virulence using the invertebrate host Galleria mellonella, it was possible to observe a propensity of the high biofilm formers isolates to be more virulent. The results reflect the effect of biofilms on clinical isolates susceptibility to antifungal drugs commonly used during medical practice.

Trichosporon spp. são patógenos oportunistas emergentes que causam alta mortalidade entre pacientes imunocomprometidos. A presente investigação teve como objetivos avaliar aspectos ecológicos relacionados à colonização humana e animal; testar 28 amostras de Trichosporon através de métodos de caracterização laboratorial clássica, detectar a atividade enzimática extracelular e avaliar a suscetibilidade desses isolados contra os antifúngicos. A expressão de melanina e glucuronoxylomanana (GXM) em parede celular foi estudada em T. asahii., Trichosporon inkin e T. asahii foram isolados da região perigenital de duas mulheres e dois tamanduás, respectivamente. Microbiologicamente, as amostras investigadas (28) apresentaram características morfológicas e fisiológicas compatíveis com as descritas na literatura. Pouca especificidade na identificação de Trichosporon spp. foi verificada em CHROMagar Candida® e API ID 32C®. O estudo da atividade de exoenzimas demonstra a relevância na produção de lipase. Não foi possível detectar a expressão de melanina em T. asahii. No entanto, GXM foi expressa por amostra-padrão e isolado clínico da mesma espécie. Embora os pontos de corte não estejam, ainda, bem estabelecidos para Trichosporon spp., os testes sugerem valores elevados de concentração inibitória mínima (CIM) para anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Voriconazol demonstrou maior eficácia contra Trichosporon spp. A maior parte das amostras apresentou resistência a caspofungina. / Trichosporon spp. are emergent opportunistic pathogens that cause high mortality among immunocompromised patients. The aim of the study was to evaluate ecological aspects related to human and animal colonization; to test 28 samples of Trichosporon spp. on classic laboratorial characterization, detection of the extracellular enzymatic activity and antifungal susceptibility (E-test®). Melanin and glucuronoxylomanan (GXM) wall expression was studied in T. asahii. Trichosporon inkin and T. asahii were isolated from perigenital area of two women and from the haircoat of two anteaters, respectively. Microbiologically, the samples studied (28) have presented morphological and physiological characteristics according to descriptions of the literature. Few specificity on identification of Trichosporon spp. was verified at CHROMagar Candida® and API ID 32C® commercial tests. The extracellular enzymatic activity showed the relevance of lipase production. The melanin wall expression was not verified in T. asahii.. On the other hand, GXM was expressed by the control and the clinical sample, both of the same specie. Though the sensibility break points were still not established for Trichosporon spp., the tests indicate high values of minimal inhibitory concentration (MIC) for amphotericin B, fluconazole, itraconazole and cetoconazole. Voriconazole showed the best results against Trichosporon spp. The most part of the samples was resistant to caspofungin.

O fungo fitopatogênico hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura-de-Bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao), é um dos maiores responsáveis pela contribuição do declínio da produção brasileira de cacau e constitui um problema fitopatológico em todas as regiões cacauicultoras. O gênero Solanum, do qual faz parte o tomate, berinjela, batata entre outros, é bem conhecido na literatura por conterem compostos que exibem atividade biológica tais como antifúngica, antiviral, moluscida, anticancerígena entre outras. O presente trabalho explorou o potencial de extrato bruto de folhas de Solanum lycopersicum como agente inibidor no controle de crescimento e desenvolvimento de três biotipos de M. perniciosa (cacau, solanácea e liana). Através de ensaios biológicos e métodos cromatográficos foi identificado o metabólito secundário -tomatina como responsável pela atividade antifúngica. Este glicoalcalóide, que apresentou potente atividade antifúngica em ensaios in vitro, foi utilizado como agente de controle no desenvolvimento do fungo e manifestação dos sintomas em plantas in vivo, onde foi verificado uma redução significativa no número de plantas com sintomas. / The hemibiotrophic phytopathogenic fungi Moniliophthora perniciosa, agent of witches broom disease of cocoa (Theobroma cacao) is one of the major responsible for the Brazilian cocoa production decay and it is a phytopathological problem in every cocoa yield area. Solanum genera, from each belongs tomatoes, eggplants, potatoes, among others, is well known as producer of biological activity such as antifungal, antiviral, anti mollus, anticancer, etc. This study explored the potential of crude extract leaves from Solanum lycopersicum as an inhibitor agent for the control of growing and development of three M. perniciosa biotypes. By the use of biological assays and chromatography, -tomatine, a secondary metabolite was identified as responsible for antifungal activity. This glycoalcaloid presented great antifungal activity on in vitro assays and it was used on the control and development of witches broom symptoms in vivo, where a significant reduction of symptomatic plants could be observed.

Este estudo avaliou a incidência e distribuição de Candida spp. isoladas de casos de infecção hospitalar no período entre 2005 to 2007, em um hospital público infantil, em São Paulo. Brasil. As amostras foram isoladas de sangue, urina e outros materiais biológicos (36,6%, 37,12% e 26,52%, respectivamente). As análises micromorfológicas e bioquímicas revelaram que a distribuição por espécie foi 62,12% Candida albicans, 37,88% não-albicans. Uma maior incidência de amostras de C. albicans foi observada em casos de candidúria (53,62%) enquanto espécies não-albicans foram mais prevalentes em candidemia (71,43%) (p < 0.05). A respeito da produção enzimática, 68,94%, 47,73%, 65,91% e 66,67% foram positivas para proteínase, fosfolipase, lipase e hemolisina. Em relação aos antifúngicos, para Anfotericina B, 96,97% dos isolados mostraram e para 5- fluorcitosina foi observado o maior índice de resistência. Os fatores de risco identificados para candidemia hospitalar foram as doenças pré-existentes, terapia antibiótica de largo espectro e a presença de cateter venoso central. / This study evaluated the incidence and distribution of Candida spp. identified from cases of nosocomial infection in the period from 2005 to 2007, in a public children\'s hospital in São Paulo, Brazil. The strains were isolated from the blood, urine and other biological specimens (36,6%, 37,12% and 26,52%, respectively). Micromorphological and biochemical analyses revealed that the overall distribution by species was 62,12% Candida albicans, 37,88% non-albicans. A higher incidence of C. albicans strains was observed in cases of candiduria (53,62%) while non-albicans species were more prevalent in cases of candidemia (71,43%) (p < 0.05). Concernig the production of enzymes, 68,94%, 47,73%, 65,91% and 66,67% presented positive proteinase, phospholipase, lipase and hemolin activity. In relation to antifungal for the Amphotericin B, 96,97% of isolates showed sensitivity and for 5- fluorocytosine was observed the biggest index of resistence. The Risk factors identified for nosocomial candidemia was underlying disease, therapy with broad-spectrum antibiotics and the presence of a central venous catheter.

A paracoccidioidomicose (PCM), doença sistêmica de caráter granulomatoso, é causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb). A gp43 secretada pelo Pb, possui um trecho específico de 15 aminoácidos designado como (P10), é reconhecido por linfócitos T. No presente trabalho, avaliamos a ativação da resposta imune e o efeito aditivo da imunização com o peptídeo P10, em camundongos induzidos à imunossupressão com dexametasona. Os resultados indicam um efeito aditivo da imunização com P10 e o tratamento com as drogas em camundongos BALB/c imunossuprimidos e infectados; associado a redução da carga fúngica no pulmão, baço e fígado desses animais, detectamos aumento de citocinas proinflamatorias, no homogenato de pulmão e no sobrenadante de cultura celular. Animais imunossuprimidos e imunizados com P10 apresentaram um aumento significativo na produção de Óxido Nítrico (NO). A eficiencia na resposta levou a um aumento na sobrevida de 100%. Estes resultados sugerem que o P10, representa uma alternativa promisoria na geração de uma vacina anti-PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides brasiliensis (Pb). The gp43 secreted by Pb has a 15-mer peptide designated as P10 that is recognized by T lymphocytes. In the present work we evaluated the activation of immune response and the additive effect of P10 immunization in BALB/c mice induzed to immunossupression with Dexamethasone. Results indicate an additive effect of P10 immunization and the treatment with drugs in BALB/c mice immunosuppressed and infected; associated with a significant reduction in fungal burden in the lung, spleen and liver of these animals. Also, we detected an increase of proinflammatory cytokines such as IFN-<font face=\"symbol\">g, TNF-<font face=\"symbol\">a e IL-12, in lung homogenates and cell culture supernatant. Immunosuppressed animals that were immunized with P10 showed an increase in the Nitric Oxide production. The efficiency of response led to a 100% survival in animals immunized with P10 and treated with antifungal drugs. Our results suggest that P10 represents a promising alternative of anti-PCM vaccine generation.

A contaminação de dornas por leveduras selvagens pode prejudicar o rendimento e a produtividade da produção industrial de etanol, inexistindo métodos eficientes para o controle deste tipo de contaminação. Facilidade, rapidez e o baixo custo seriam características desejáveis para o controle de leveduras que eventualmente contaminam o processo de fermentação. Com este objetivo, TAVARES (1989) desenvolveu um processo de produção de etanol com o controle de leveduras contaminantes, que utiliza um híbrido M606 de Saccharomyces cerevisiae de alta produtividade e resistente a nistatina, um antifúngico de amplo espectro que pode ser usado para garantir a pureza genética do inóculo industrial. Para facilitar a identificação de leveduras GOMES et al. (2000), utilizaram a propriedade de fluorescência expressada pelo gene GFP \"Green Fluorescent Protein\" sob o controle do promotor da da ADH2 em baixas concentrações de glicose. Associar estas duas propriedades em uma levedura industrial permitiria manter a pureza do inóculo e facilitaria a sua identificação. Com este objetivo, foram efetuados experimentos de transformação genética do híbrido M606 com o plasmídio pYGFP3 construído por Gomes et al (2000), sem obter o sucesso desejado. Por isto, como passo inicial para obtenção de ambas propriedades em híbrido altamente produtivo, optou-se pela metodologia de cruzamentos entre uma linhagem segregante haplóide resistente a nistatina M606-2c(n) e a linhagem X2904- GFP3 portadora do plasmídio pYGFP3. Alguns híbridos deste cruzamento natural foram selecionados, para posterior avaliação do nível de resistência à nistatina, da estabilidade do plasmídio pYGFP3 e da capacidade fermentativa. Verificou-se que os híbridos selecionados (P16, P34 e P42) foram capazes de crescer numa concentração de 10mg.L-1 de nistatina. Contudo, detectou-se instabilidade do plasmídio pYGFP3 em todos os híbridos selecionados. Os híbridos P34 e P42 demonstraram uma capacidade fermentativa inferior às linhagens controle, o que pode ser explicado pela fragilidade do sistema de membranas decorrente da natureza da resistência à nistatina. O híbrido P16 não apresentou diferenças na capacidade de fermentação em relação as linhagens controle. Apesar de obter híbridos resistentes a nistatina expressando o gene GFP3, verifica-se que há necessidade de modificar o plasmídio pYGFP3 tornando-o integrativo no genoma da levedura, para permitir a estabilidade do gene GFP3. / Vats contamination by wild yeasts can harm the efficiency and the productivity of ethanol industrial production and there are not efficient methods to control this type of contamination. Easiness, speed and the low cost would be desirable characteristics for the control of yeasts that eventually contaminate the fermentation process. With this aim, TAVARES (1989) developed an ethanol production process with the control of spoilage yeasts contaminants, that uses a Saccharomyces cerevisiae hybrid M606, of high productivity and resistant to the nystatin. It´s a wide spectrum antifungal that can be used to guarantee the genetic purity of the industrial inoculum. To facilitate the yeasts identification, GOMES et al. (2000) used the fluorescence property expressed by the GFP gene \"Green Fluorescent Protein\", that is controlled by the promoter of ADH2 in a low glucose concentrations. The association of these two properties in an industrial yeast strain would allow to maintain the purity of the inoculum and it would facilitate its identification. With this aim, an assay of genetic transformation of hybrid M606 with pYGFP3 plasmid built by Gomes et al (2000) was made, but it had not success. Therefore, as initial step for obtaining of both properties in hybrid highly productive, It was opted for the methodology of crossings between a nystatin resistant haploid segregant strain M606-2c(n) and the strain X2904-GFP3(n) harboring of the plasmid pYGFP3. Some hybrids were selected of this natural crossing, with subsequent evaluation of nystatin resistance level, stability of the pYGFP3 plasmid and fermentative capacity. The selected hybrids (P16, P34 and P42) were capable to grow in a concentration of 10mg.nystatin L-1. However, plasmidial instability of the pYGFP3 was detected in all the selected hybrids. The hybrids P34 and P42 showed a smaller fermentative capacity than control strain, which can be explained by the fragility of the membranes system due to the nature of the resistance to the nystatin. The hybrid P16 did not showed difference in the fermentative capacity to the strain control. In spite of obtaining resistant hybrid to the nystatin expressing the GFP3 gene, there is a need to modify the pYGFP3 plasmid, turning it integrative in the yeast genome to allow the gene stability GFP3.

A ocorrência de leveduras do gênero Candida spp. constitui uma ameaça a saúde bucal de pacientes oncológicos submetidos ao tratamento antineoplásico. Diante do exposto,objetivou-se no estudo avaliar as variáveis clínicas de pacientes oncológicos portadores ou não de Candida spp. na saliva; estimar a prevalência dessas cepas, avaliar a atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais e, determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos. Foram coletadas amostras de salivas de pacientes oncológicos, com e sem mucosite. A saliva foi submetida a diluição decimal seriada até 10-3 e semeada em meio de cultura (CHROMagarTM Candida) para quantificação das unidades formadoras de colônias por mililitro de saliva (UFC/mL). Também, realizaram-se provas bioquímicas específicas para identificação das espécies. Na avaliação da atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais (Periogard®, Cepacol® Cool Ice e Clorexidina a 0,12%) utilizouse a Diluição Inibitória Máxima (DIM). O perfil de sensibilidade destas cepas a anfotericina B e fluconazol foi realizado pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) por meio das fitas Etest®. Na análise estatística utilizou-se os testes não paramétricos de McNemar e Wilcoxon, com nível de significância (=0,05). Totalizou-se 34 pacientes dos quais 79,4% eram masculinos e 19(55,9%) estavam com mucosite. Das amostras de saliva 9(26,5%) eram positivas para Candida spp.. Evidenciou-se 12 cepas distintas de Candida spp., sendo 7(20,6%) C. albicans, 3(8,8%) C. glabrata e 2(5,9%) C.tropicalis. A mucosite foi mais freqüente 66,7% nos portadores de Candida. Comparando os resultados da DIM foi possível verificar que o Cepacol® Cool Ice apresentou os melhores resultados. A Clorexidina a 0,12% teve a pior atividade, sendo que 4 (11,8%) das cepas não foram inibidas na diluição de 1:10. Com relação ao perfil de sensibilidade, todas cepas foram sensíveis a anfotericina B e 2 (5,9%) das cepas de Candida glabrata apresentaram sensibilidade dose dependente ao fluconazol. Pesquisas adicionais são necessárias sobre o uso de antissépticos na manutenção da saúde bucal desses pacientes, especialmente, considerando o elevado risco de mucosite. / The occurrence of Candida spp. is a threat to the oral health of cancer patients undergoing antineoplastic treatment. This study described the clinical variables of cancer patients with or without Candida spp. in the saliva; determined the prevalence of these strains, and assessed mouthwashes antimicrobial activity and the sensitivity profile to antifungals. Saliva samples of cancer patients, with or without mucositis, were collected. Saliva was subject to serial decimal dilution up to 10-3 and sowed in culture (CHROMagarTM Candida) to quantify the number of colony forming units per milliliter of saliva (CFU/mL). Specific biochemical tests were also done to identify the species. The Maximum Inhibitory Dilution (MID) was used to assess the antimicrobial activity of the mouthwashes (Periogard®, Cepacol® Cool Ice and 0.12% Chlorhexidine). The sensitivity profile of the strains as to amphotericin B and fluconazole was done by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using Etest® strips. Non-parametric McNemar and Wilcoxon tests were used for statistical analysis, with level of significance (= 0.05). Of the 34 patients, 79.4% were male and 19 (55.9%) had mucositis. 9(26.5%) tested positive for Candida spp. in the saliva. Regarding the diversity of species, the study evidenced 12 different strains of Candida spp., 7 (20.6%) C. albicans, 3(8.8%) C. glabrata and 2 (5.9%) C. tropicalis. Mucositis was more common in patients with Candida, 66.7%. Comparing the MID results, it was verified that Cepacol® Cool Ice presented better results than other products. The worst activity was presented by 0.12% Chlorhexidine, 4(11.8%) of the strains were not inhibited at 1:10 dilution. As to the sensitivity profile, all strains were sensitive to amphotericin B and 2 (5.9%) strains of Candida glabrata were Dose-Dependent Sensitive to fluconazole. Additional research is needed to broaden the scientific evidences of the use of antiseptics in the maintenance of these patients oral heath, especially considering the high risk of mucositis.

As regiões costeiras estão sendo ameaçadas por apresentarem uma exploração desordenada e predatória de seus recursos naturais alterando a biodiversidade. Leveduras fazem parte do ecossistema marinho, entretanto algumas espécies estão associadas à micoses superficial, subcutânea e/ou sistêmicas. O objetivo deste estudo foi quantificar leveduras, isolar e caracterizar Trichosporon spp., em amostras água de mar e areia em três regiões costeiras do estado de São Paulo: Baixada Santista, Canal de São Sebastião e Ubatuba. Foram coletadas 126 amostras de água de mar e areia. As áreas foram caracterizadas usando parâmetros microbiológicos. A contagem de leveduras variou de <1 a 1.300UFC/100mL em água de mar e <1 a 3.200UFC/g em areia. As leveduras isoladas foram identificadas usando a metodologia tradicional e testes genotípicos. De um total de 102, 30,5% foi confirmado pelo API ID 32C, 40,2% pelo auxanograma e 63,7% pelo PCR. Os isolados identificados pelo PCR foram seqüenciados e 41,5% foram Trichosporon spp. / Coastal regions are being threatened because they have a predatory and uncontrolled exploitation of natural resources by changing biodiversity. Yeasts are part of the marine ecosystem, though some species are associated with superficial mycoses, subcutaneous and / or systemic. The objective of this study was to quantify yeast, isolation and Trichosporon spp. In samples of sea water and sand in three regions of the state of São Paulo: Santos, Canal de São Sebastião and Ubatuba. We collected 126 samples of sea water and sand. The areas were characterized by microbiological parameters. Yeast counts ranged from <1 to 1.300UFC/100mL in sea water and <1 to 3.200UFC / g in sand. The yeasts were identified using the traditional methods and genotypic tests. From a total of 102, 30.5% was confirmed by API ID 32C, by 40.2% and 63.7% auxanograma PCR. The isolates identified by PCR were sequenced and 41.5% were Trichosporon spp.

Despite therapeutic advances, opportunistic fungal infectious diseases have increased in prevalence and have become a universal public health problem. Candida albicans (CA) is a commensal fungus that under certain environmental conditions can act as an opportunistic pathogen and colonize mucous membranes and tissues causing local and systemic infections. The emergence of drug resistant strains, as well as the increase of immunosuppressed patients, has limited therapeutic options. Therefore the aim of this study was to evaluate 1) The antifungal activity of Punicalagin (P), alone or in combination with Nystatin (N), against two CA strains. 2) The cytotoxicity effect of P and N, as well as the combination of both, on human primary cells. In the first step, yeasts of CA ATCC 90028 and SC5314 were exposed to P and N for 24 hours. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of P (50 g/mL) and N (3.9 g/mL) were determined by the broth microdilution assay. The Checkerboard Assay was performed to verify the synergism between the combinations (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 and P/2 N/2), which were selected from the 56 combinations initially tested. The fungal metabolism was assessed by the metabolic reduction assay XTT (24h) and Minimum Microbicidal Concentration (MMC) was determined by Colony-forming unit (CFU/mL, 24h). The evaluation of virulence factors gene expression was amplified and quantified by PCR real time (Polymerase Chain Reaction-RT-qPCR, only for P/8 N/4 in 24h). The analysis of proteins related to essential biological processes of the fungus was performed by LC-MS/MS (24h). MIC and MMC of P were significantly reduced in the presence of N, indicating synergism between both. Once the antifungal potential of P was verified, we proposed to evaluate whether this drug acts through the same mechanism of action of N, altering the permeability of the cell membrane of the fungus (binding ergosterol). The evaluation of gene expression has demonstrated upregulation of some genes that may be related to a defense mechanism associated with stress or cell death. The proteomics analysis revealed alterations in the expression of several proteins in the fungi exposed to P/8 N/4 in relation to negative control, correlated with important biological processes, such as, energy metabolism, stress response, drug metabolism, among others. In the second step, cytotoxicity assays involving P and N, as well as the combination of both, were undertaken on human palate epithelial cells (HPEC) and human gingival fibroblasts cells (HGF) by Alamarblue dye. Similarly, P cytotoxicity was reduced when used in combination with N. Based on these in vitro results, the synergistic antifungal activity produced between P and N suggested that the combination of drugs, at the concentrations tested, may be a topical therapeutic or preventive alternative to be used in cases of superficial candidiasis, such as denture stomatitis. / Apesar dos avanços terapêuticos, doenças infecciosas por fungos oportunistas têm aumentado em prevalência e tornaram-se um problema universal de saúde pública. Candida albicans (CA) é um fungo comensal que, sob certas condições ambientais, pode atuar como um patógeno oportunista e colonizar mucosas e tecidos causando infecções locais e sistêmicas. O surgimento de cepas resistentes às drogas convencionalmente utilizadas, assim como aumento de pacientes imunodeprimidos, tem limitado as opções terapêuticas. Portanto o objetivo deste estudo foi avaliar: 1) a atividade antifúngica de Punicalagina (P), com ou sem a associação de Nistatina (N), contra duas cepas de CA. 2) O efeito citotóxico de P e N, assim como suas combinações, em culturas primárias humanas de células epiteliais de palato (CEPH) e de fibroblastos gengivais (FGH). Na primeira etapa, leveduras de CA ATCC 90028 e SC5314 foram expostas a P e N, por 24 horas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de P (50 g/mL) e N (3,9 g/mL) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O Ensaio Checkerboard foi realizado para verificar o sinergismo entre as combinações (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 e P/2 N/2), as quais foram selecionadas a partir de 56 combinações inicialmente testadas. O metabolismo fúngico foi avaliado pelo método do XTT (24h) e a Concentração Mínima Microbicida (CMM) foi realizada através de Unidades formadoras de colônias (UFC/mL, 24h). A avaliação da expressão gênica de fatores de virulência foi amplificada e quantificada por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase-RT-qPCR, apenas para P/8 N/4 em 24h). A análise proteômica para identificação de proteínas alteradas foi realizada por LC-MS/MS (24h). A MIC e MMC de P foram significativamente reduzidas na presença de N, indicando sinergismo entre ambas. Confirmado o potencial antifúngico, o Ensaio de mecanismo de ação (teste do ergosterol) foi realizado e não foi confirmada a ação de P através da ligação ao ergosterol. A avaliação da expressão gênica demonstrou regulação positiva de alguns genes que pode estar relacionado a um mecanismo de defesa associado ao estress ou a morte celular. A análise proteômica revelou proteínas diferencialmente expressas nos fungos expostos a P/8 N/4 em relação ao controle negativo (sem tratamento), as quais estão relacionadas ao processo de metabolismo energético, resposta ao estress e metabolismo de drogas, dentre outros. Na segunda etapa, CEPH e FGH foram expostas a P e N e suas combinações por 24h para realização dos ensaios de viabilidade por Alamarblue. Combinada à N, a Punicalagina apresentou-se menos citotóxica do que de forma isolada. Com base nesses resultados in vitro, o sinergismo antifúngico produzido entre P e N sugere que a combinação das drogas pode ser uma alternativa terapêutica tópica para ser utilizada nos casos de candidose localizada, como por exemplo, a estomatite protética.

Objetivando estudar o perfil fenotípico de leveduras mantidas em banco de microrganismos de Cryptococcus neoformans, 40 cepas de origem clínica e 44 de origem ambiental foram escolhidas aleatoriamente. As cepas passaram por tipagem bioquímica para diferenciação em C. neoformans e C. gattii, e dentre as cepas clínicas 90% foram tipadas como C. neoformans e 10% como C. gattii, já dentre as cepas ambientais 95,5% foram C. neoformans e 4,5% C. gattii. As cepas cepas que foram positivas no teste bioquímico para C. gattii passaram por tipagem molecular (PCR-RFLP) e verificou-se que apenas quatro cepas eram realmente C. gattii (VGII), e duas outras C. neoformans (VNI e VNIII). Quando estudado os fatores relacionados a virulência, todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras de fosfolipase, sendo que cepas de origem clínica produziram essa enzima em maior quantidade. Todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras da enzima protease e todas também apresentaram intensidade de cor da colônia ( melanização). Quando avaliado a espessura capsular in vitro todas apresentaram cápsula, das cepas clínicas, 67% apresentaram cápsula média e das ambientais 70%. Quando avaliado a sensibilidade aos antifúngicos pelo métodos E-test todas as cepas clínicas e ambientais foram sensíveis aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, voriconazol e posoconazol. O itraconazol também foi testado e apresentou cepas sensíveis à droga, porém uma cepa clínica e duas ambientais tiveram classificação dose dependente. Destacamos que a fosfolipase poderia ser usada como um marcador fenotípico para o complexo Cryptococcus neoformans e uma correta identificação das culturas mantidas em banco de microrganismos é necessário. / Aiming to study the phenotypic profile of yeasts maintened in stock culture identified as Cryptococcus neoformans, 40 clinical and 44 environmental strains, were chosen ran domly. The strains had undergone biochemical typing for differentiation as C. neoformans and C. gattii. Among the clinical strains 90% were typed as C. neoformans and 10% as C. gattii, already among the environmental strains were 95,5% C. neoformans and 4,5% C. gattii. The strains thah were positive in biochemical test for C. gattii underwent molecular typing (PCR-RFLP) and found that only four strain were actually C. gattii (VGII) and two other C. neoformans (VNI and VNII). When the factors related to virulence were studied, both the clinical and environmental strains were phospholipase positive but the clinical strains produced a greater amount of this enzyme. All strains were both clinical and environmental production of protease and also showed an intensity colony color (melanization). When the thickness of the capsule was evaluated, all of it showed a capsule, from the clinical strains 67% had an average capsule and from environmental strains 70% had an average capsule. When assessed by sensitivity to antifungal by E-test method all clinical and environmental strains were sensitive to the anphotericine B, ketoconazole, fluconazole, voriconazole and posoconazole. Itraconazole was tested and the samples showed drug sensitive-strains. We point out that phospholipase production would be used as marked to C. neoformans complex and a correct identification of strains maintened in stock culture is necessary.