Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Em vista do crescimento de infecções fúngicas oportunisticas causadas por Fusarium spp. e da resistência do fungo aos antifúngicos frequentemente utilizados, o estudo visa avaliar o perfil de sensibilidade das associações entre terbinafina, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B frente a 20 isolados clínicos e ambientais de Fusarium solani, e verificar fatores associados a virulência como pesquisa de melanina na parede celular e a produção das enzimas extracelulares proteinase, fosfolipase, lipase e DNAse. Anfotericina B associada à itraconazol demonstrou efeito sinérgico em 15% dos isolados, sendo 33% de origem ambiental e 65% de origem clínica. Efeitos sinérgicos foram obtidos contra 10% dos isolados na associação entre anfotericina B e cetoconazol e contra 5% na associação entre anfotericina B e terbinafina. Nossos resultados revelaram efeitos aditivos e indiferentes contra as cepas testadas nas associações entre terbinafina e derivados azólicos. Não foi detectada presença de melanina na parede de F. solani. As culturas de F. solani clínicas e ambientais apresentaram atividade enzimática de proteinase positiva após coloração com ácido acético e negro de amido, com formação de halos ao redor da colônia na proporção de 30% e 45% respectivamente. Atividades enzimáticas de lipase, fosfolipase e DNAse não foram detectadas, contudo, não é possível afirmar que F. solani não produza essas enzimas, considerando que as mesmas podem ser mantidas intracelularmente e não liberadas para o meio. / Despite of the increase of opportunistic fungal infections caused by Fusarium spp. and their resistance to antifungal drugs, the aims of this study were to evaluate susceptibility profiles of 20 clinical and environmental isolates of Fusarium solani against the associations among terbinafine, itraconazole, ketoconazole and amphotericin B, and to verify the presence of associated virulence factors as melanin and extracellular enzymes (proteinase, phospholipase, lipase and DNAse). Amphotericin B combined with itraconazole showed synergism against 15% of the isolates, 33% of these was from the environment and 65% from clinical cases. Synergistic effect was observed against 10% of strains tested by association between amphotericin B and ketoconazole and against 5% in association between anphotericin B and terbinafine. The associations between terbinafine and azole derivatives showed additive effect and no difference against the samples. Presence of melanin in the F. solani cell wall was not observed. Both, clinical and environmental isolates expressed enzymatic activity of proteinase in 30% and 45% of cases. Enzymatic activity of lipase, phospholipase and DNAse were not detected; however, it was not possible to state that F. solani do not produce these enzymes, as they could manteined intracellularly and would not released to the environment. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 86.pdf: 4313185 bytes, checksum: 841992629bd3bcc0ae5285c8796f0995 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Faculdade de Farmácia, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Infecções invasivas são um problema crescente em hospitais terciários no Brasil e no mundo. Dentre os diversos agentes etiológicos encontrados no ambiente hospitalar, o gênero Candida tem sido o terceiro ou quarto patógeno mais isolado. De maneira geral, infecções fúngicas invasivas estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade, dificuldades de diagnóstico, resistência a antimicrobianos, extensão do tempo de internação e aumento dos custos hospitalares. O presente trabalho objetivou avaliar o desempenho de métodos fenotípicos e moleculares na identificação de espécies de Candida recuperadas de casos de infecção hospitalar e descrever seus perfis de susceptibilidade a drogas antifúngicas através de metodologias de referência e comerciais. Para tanto, 113 isolados clínicos (108 Candida spp., 2 Rhodotorula glutinis e 1Trichosporon sp.) de 100 pacientes hospitalizados no estado do Rio de Janeiro foram submetidos a provas em CHROMagar, do tubo germinativo e do clamidósporo, análises bioquímicas em aparelho VITEK e identificação molecular por multiplex-PCR. A susceptibilidade ao fluconazol, itraconazol e anfotericina B foi avaliada conjuntamente pelos métodos de difusão em ágar (CLSI/M44-A e CECON) e microdiluição em caldo (CLSI/M27-A2 e EUCAST/E.Dis.7.1) conforme os protocolos de referência do CLSI e EUCAST, bem como pelas instruções do fabricante do método comercial CECON. Com relação às características demográficas dos pacientes, 47% eram do sexo masculino e 37% do sexo feminino, a maioria se encontrava na faixa de 0-20 anos (33%) e as leucemias foram os principais processos de base (20%). Candida albicans (41,5%), C. parapsilosis (29,2%), C. guilliermondii (10,6%) e C. tropicalis (9,7%) foram as espécies mais isoladas, considerando a totalidade dos espécimens clínicos. Em cultura de sangue, C. albicans (38,4%) também foi preponderante. A identificação cromogênica mostrou 100% de sensibilidade e especificidade para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei. As provas do tubo germinativo e do clamidósporo para identificação de C. albicans apresentaram 89,4% de sensibilidade e 100% de especificidade. Os testes bioquímicos permitiram a detecção correta e completa de 78,8% dos isolados. A multiplex-PCR identificou adequadamente todas as espécies para os quais primers tinham sido desenhados. Alta taxas (≥92,9%) de susceptibilidade aos 3 antifúngicos testados foram observadas em todas as metodologias empregadas. Resistência foi verificada apenas em C. krusei e Rhodotorula glutinis frente ao fluconazol. No entanto, concentrações inibitórias mínimas (CIM) mais elevadas foram, igualmente, encontradas em itraconazol. O cálculo do coeficiente de correlação intraclasse (CCI) demonstrou alta correlação (0,88-0,97) entre todos os métodos utilizados para avaliação das susceptibilidades aos antifúngicos. Os resultados apresentados demonstraram que C. albicans foi a espécie mais prevalente e também que, depois de C. albicans, C. glabrata, C. krusei e C. lambica foram as espécies menos susceptíveis aos antifúngicos azólicos. Além disto, o CHROMagar e a multiplex-PCR foram os mais efetivos na identificação preliminar e na identificação definitiva dos isolados clínicos, respectivamente. As metodologias de difusão em ágar e microdiluição em caldo foram também efetivas tanto na triagem quanto na confirmação das susceptibilidades. / Invasive infections are a increasing problem in tertiary care hospital in the Brazil and in the world. The predominant etiologic agents in the nosocomial environment include the genus Candida that is the third ou fourth most common isolate. In generaly, invasive fungal infections are associated with high morbidity and mortality, difficulties in the diagnosis, acquisition of resistance, prolonged hospital stay, and high hospitalar costs. The aim of the present work was to evaluate the performance of phenotypic and molecular methods in the identification of Candida spp. isolated from nosocomial infection cases as well as to describe their antifungal drug susceptibility profliles by reference and commercial methodologies. For this, 113 clinical isolates (108 Candida spp., 1 Rhodotorula glutinis, 1 Trichosporon sp.) from 100 hospitalized patients in the Rio de Janeiro state were submmited to CHROMagar, germ tube and chlamydospore testing, biochemistry analysis in VITEK equipament, and molecular identification by multiplex-PCR. The susceptibility to fluconazole, itraconazol, and amphotericin B was evaluated by disk-diffusion method (CLSI/M44-A, CECON) and broth microdilution method (CLS/M27-A2, EUCAST/E.Dis.7.1.) according to the CLSI and EUCAST reference protocols and the manufacturer’s instructions, in case of CECON. Relatively of the demographic patient characteristics, 47% were male, 37% were female, the majority was between 0-20 years (33%), and leukemias were the main base diseases (20%). Candida albicans (41,5%), C. parapsilosis (29,2%), C. guilliermondii (10,6%) e C. tropicalis (9,7%) were the most frequently isolated Candida species from all clinical specimens. In hemoculture C. albicans (38,4%) was prevalent. The chromogenic identification showed susceptibility and specificity of 100% to C. albicans, C. tropicalis, and C. krusei. The germ tube and chlamydospore formation to C. albicans identification presented sensibility of 89,4% and specificity of 100%. The biochemistry tests were capable to correct and complete detection of 78% of the isolates. All Candida species could be accuracely identified by using the designed species-specific primers by multiplex-PCR analysis. High rates (≥92,9%) of susceptibility to 3 antifungal drug tested were verified for all methodologies. Resistance was found only in C. krusei and Rhodotorula glutinis to fluconazole. However high minimum inhibitory concentrations (MIC) were found to itraconazole as well. The intraclass correlation coefficient (ICC) showed high correlation (0,88-0,97) between all methods used to antifungal susceptibility evaluation. The results demonstrated that C. albicans was the most predominant specie, and also that after C. albicans, C. glabrata, C. krusei and C. lambica were the less susceptibility to azoles drug. Besides this, CHROMagar and multiplex-PCR were more effective in the preliminar and definitive identification of clinical isolates, respectively. The disk-diffusion and broth microdilution methods were effective to screening and confirm the susceptibilities.

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:37:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 maria_carvalho_ipec_mest_2012.pdf: 3003635 bytes, checksum: 510838807146764c9ee0f462f0cf0ea7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Dentre as espécies de Candida não-albicans, Candida parapsilosis vem emergindo como importante patógeno de infecções fúngicas invasivas com disseminação hematogênica nas últimas décadas em diferentes continentes, principalmente, na Europa e na América Latina. C. parapsilosis foi considerada por muito tempo um complexo de três grupos distintos nomeados I, II e III. Tavanti et al (2005), baseado na tipagem da sequência multilocus (MLST), propôs o reconhecimento dos grupos II e III, como duas novas espécies: C. orthopsilosis e C. metapsilosis, respectivamente, mantendo o grupo I como C. parapsilosis stricto sensu. Até agora só tem sido possível distinguir essas três espécies por análise molecular. Métodos comerciais para testes de susceptibilidade aos antifúngicos vêm sendo utilizados para avaliar o comportamento de Candida spp. frente às drogas de uso clínico, incluindo o Etest® e o sistema Vitek® 2. Neste trabalho, estes dois métodos foram comparados ao método de referência de microdiluição em caldo pelo CLSI (M27-A3) para determinar a susceptibilidade in vitro de isolados clínicos do complexo psilosis aos fármacos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, voriconazol e itraconazol. Um total de 53 isolados do complexo psilosis oriundos de hemoculturas obtidas de pacientes hospitalizados no município do Rio de Janeiro, entre 1998 e 2006, associados a episódios de fungemia, foram analisados Cinquenta e um isolados foram discriminados pela PCR, utilizando primers espécie-específicos, e dois isolados, pelo sequenciamento, sendo caracterizados como C. parapsilosis stricto sensu (75,4%), C. orthopsilosis (20,8%) e C. metapsilosis (3,8%). Os testes de susceptibilidade aos antifúngicos indicaram que a maioria dos isolados de C. parapsilosis stricto sensu foi sensível a todos os fármacos testados. Entretanto, um único isolado de C. parapsilosis stricto sensu apresentou uma CIM = 2 [g/mL para a anfotericina B. Três isolados de C. orthopsilosis apresentaram CIM entre 2 e 8 [g/mL para o fluconazol pelo Etest® e Vitek® 2 e CIM entre 0,19 e 0,25 [g/mL para o itraconazol pelo Etest®. Os isolados de C. metapsilosis foram sensíveis a todos os fármacos testados. A concordância essencial entre Etest® ou Vitek® 2 com CLSI foi excelente (100%), exceto para o itraconazol (90,9%). Por outro lado, a concordância categórica foi 72,7% para o itraconazol pelo Etest® e 100% para os outros fármacos por ambos os métodos. Para anfotericina B, a concordância categórica foi de 100% para o Etest® e de 97,5% pelo Vitek® 2 em relação ao CLSI. Este estudo reforça a importância dos métodos Etest® e Vitek® 2 que podem ser empregados nos laboratórios rotineiros de microbiologia clínica para monitorar e detectar diferenças no perfil de susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis / Among non-albicans Candida species, Candida parapsilosis has emerged as an important agent of invasive fungal infections, and several cases associated with fungemia have been reported worldwide in last decade, mostly in Europe and Latin America. For many years, C. parapsilosis has been characterized as a complex composed of three genetically distinct groups (groups I, II, and III). Tavanti et al. (2005) based on multilocus sequence typing (MLST) technique, proposed the recognition of groups II and III as two different species: C. orthopsilosis and C. metapsilosis, respectively, maintaining the group I as C. parapsilosis sensu stricto. Up to now only has been possible to distinguish these three species just by molecular analysis. Commercial antifungal susceptibility methods including Etest® and Vitek® 2 system have been used to test the antifungal susceptibility of Candida spp. In this study, these methods were compared to the CLSI broth microdilution (BMD) reference method to determine in vitro susceptibility of clinical C. parapsilosis complex isolates to amphotericin B, fluconazole, voriconazole, and itraconazole. A total of 53 C. parapsilosis complex isolates from blood cultures obtained of patients who were hospitalized in the city of Rio de Janeiro between 1998 and 2006 associated with episodes of fungemia were analysed. Fifty-one isolates were discriminated by PCR using species-specific primers and two isolates by sequencing, being characterized as C. parapsilosis sensu stricto (75.4%), C. orthopsilosis (20.8%), and C. metapsilosis (3.8%). Antifungal susceptibility tests indicated that most of C. parapsilosis sensu stricto isolates were susceptible to all tested drugs. However, a single C. parapsilosis sensu stricto isolate presented MIC = 2 [g/ml for amphotericin B. Three C. orthopsilosis isolates showed MIC between 2-8 [g/ml for fluconazole by Vitek® 2 and MIC between 0.19-0.25 [g/ml for itraconazole by Etest®. C. metapsilosis isolates were susceptible to all tested drugs. The essential agreement between the Etest® or Vitek® 2 with the CLSI BMD for all drugs was excellent (100%), except for itraconazole (90.9%). The categorical agreement was 72.7% for itraconazole by Etest®, 97.5% for amphotericin B by Vitek® 2, and 100% for the other drugs by both methods compared with CLSI BMD. This study reinforces the importance of Etest® and Vitek® 2 methods in routine clinical microbiologycal laboratories to survey and detect differences in the profile of the antifungal susceptibility of C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis, and C. metapsilosis isolates.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.

Introdução: Dados sobre a relação entre a farmacocinética do fluconazol (FCZ) e anfotericina B (AMB) no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a hipertensão intracraniana (HIC) não se encontram disponíveis na literatura. Objetivos: Avaliar a influência da pressão intracraniana na concentração dos antifúngicos AMB e FCZ no LCR de pacientes com meningite criptococócica internados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), no período de 1 ano. Métodos: Foram estudados 15 pacientes com meningite criptococócica durante os primeiros 14 dias de tratamento com AmB (1 mg/kg/dia) e FCZ (800 mg/dia). As amostras de LCR foram obtidas por meio de punções lombares de rotina realizadas nos dias 1, 7 e 14 da terapia antifúngica, respectivamente. Os valores das pressões intracranianas de abertura foram obtidos no momento de cada punção lombar. Os níveis de AmB e FCZ no LCR foram medidos pela metodologia de cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A concentração inibitória mínima (CIM) para AmB, FCZ, voriconazol (VRZ) e flucitosina (5-FC) de cada isolado de Cryptococcus sp. foi realizada de acordo com o as normas descritas no documento M27-A3, do CLSI, publicado em 2008. Resultados: Entre os 15 pacientes incluídos no estudo, C. gattii foi isolado do LCR de 2 pacientes e C. neoformans foi isolado do LCR de 13 pacientes apresentaram. A condição de imunossupressão encontrada foi a AIDS, seguida de transplante de órgão sólido. Nove pacientes apresentaram cultura negativa de LCR no 14º dia de terapia antifúngica. Os níveis de AmB no LCR foram indetectáveis para a maioria das amostras de LCR durante os 14 dias de terapia antifúngica. Os níveis de FCZ no LCR aumentaram progressivamente do dia 1 ao dia 14 de terapia. Seis pacientes apresentaram HIC no dia 1, com variação da pressão de abertura entre 100 mmH2O e 650 mmH2O no respectivo dia. A pressão intracraniana não interferiu nas concentrações de FCZ no LCR. Não observamos correlação entre a HIC e as concentrações de AMB e FCZ no LCR de acordo com a correlação de Spearman (Spearman p= 0.122). Conclusão: São necessários mais estudos para avaliar o papel da HIC na eficácia terapêutica de diferentes agentes antifúngicos em pacientes com meningite criptococócica. / Introduction: Data considering the relationship between pharmacokinetics of fluconazole (FCZ) and amphotericin B (BPA) in cerebrospinal fluid (CSF) and intracranial hypertension (IH) are not available in the literature. Objectives: To evaluate the influence of intracranial pressure on the concentration of the antifungals AMB and FCZ in the CSF of patients with cryptococcal meningitis admitted at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), within a period of one year. Methods: Fifteen patients with cryptococcal meningitis were studied during the first 14 days of treatment with AmB (1 mg / kg / day) and FCZ (800 mg / day). CSF samples were obtained by means of routine lumbar punctures performed on days 1, 7 and 14 of antifungal therapy, respectively. The values of intracranial opening pressures were obtained at the time of each lumbar puncture. The levels of AmB and FCZ in the CSF were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) methodology. The minimum inhibitory concentration (MIC) for AmB, FCZ, voriconazole (VRZ) and flucytosine (5-FC) of each isolate of Cryptococcus sp. was performed according to CLSI guideline M27-A3, published in 2008. Results: Among the 15 patients included in the study, C. gattii was isolated from the CSF of 2 patients and C. neoformans was isolated from the CSF of 13 patients presented. The immunosuppressive condition found was AIDS, followed by solid organ transplantation. Nine patients presented negative CSF culture on the 14th day of antifungal therapy. AmB levels in the CSF were undetectable for most of the CSF samples during the 14 days of antifungal therapy. CSF FCZ levels increased progressively from day 1 to day 14 of therapy. Six patients presented IH on day 1, with variation of the opening pressure between 100 mmH2O and 650 mmH2O on the respective day. Intracranial pressure did not interfere with CSF on FCZ concentrations. We did not observe a correlation between IH and the concentrations of AMB and FCZ in the CSF according to the Spearman correlation (Spearman p = 0.122). Conclusion: Further studies are needed to evaluate the role of IH in the therapeutic efficacy of different antifungal agents in patients with cryptococcal meningitis.

Plantas do gênero Hypericum (Hypericaceae) são reconhecidas fontes de moléculas com fins terapêuticos. Para espécies nativas do sul do Brasil, atividades como antifúngica e antinociceptiva já foram relatadas, atribuídas principalmente a compostos extraídos em suas frações lipofílicas como derivados de floroglucinol, benzopiranos e benzofenonas. Neste estudo, o potencial sinérgico entre frações lipofílicas de H. carinatum e o fármaco fluconazol, frente a fungos leveduriformes emergentes, foi avaliado por duas metodologias distintas: checkerboard e isobolograma. Para isolados de Candida krusei e C. famata o efeito da associação foi superior ao do fármaco isolado. Dessa forma, o perfil de suscetibilidade observado sugere que a fração esteja auxiliando a ação do fármaco. Ainda abordando o potencial terapêutico de espécies de Hypericum, a investigação da atividade antinociceptiva (via oral) do benzopirano HP1 de H. polyanthemum, quando incorporado em nanoemulsões, foi avaliada. Os resultados demonstraram que HP1 pode ser adequadamente incorporado em nanoemulsões, dada sua solubilidade no núcleo oleoso. Em relação ao efeito antinociceptivo, nanoemulsões contendo HP1 demonstraram o mesmo efeito do composto livre, em magnitude, porém em dose inferior. A redução da dose ativa sugere que uma melhor solubilização do composto possa ter ocorrido quando o mesmo está inserido em nanoemulsões. Nesse contexto, estudos de permeabilidade intestinal ex vivo (Ussing chambers) de HP1, na sua forma livre e incorporado em nanoemulsões, foram realizados. Os resultados demonstraram que a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, quando incorporado em nanoemulsões, foi cerca de 4 vezes maior em relação a forma livre. Além disso, experimentos de lipólise in vitro mostraram que enzimas presentes no trato gastrointestinal são hábeis em hidrolisar nanoemulsões a espécies coloidais, mais solúveis e facilmente absorvíveis pelas células intestinais. Ainda, a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, na sua forma livre, no sentido absortivo foi maior que no sentido secretório indicando que transportadores ativos estão, ao menos em parte, auxiliando a absorção deste composto pelas células intestinais. Dessa forma, com vistas a elucidar o provável transportador ativo de HP1, dada a semelhança estrutural deste benzopirano com moléculas canabinoides e a relação existente entre os sistemas opioide e canabinoide, a influência deste último na absorção de HP1 foi investigada. Os resultados demonstraram que o benzopirano HP1 pode estar relacionado ao sistema canabinoide, mas a natureza dessa ligação, seja de transporte, agonismo/antagonismo ou físico-química, não foi possível de ser elucidada. Os resultados obtidos nesta tese são relevantes à medida que espécies de fungos leveduriformes emergentes se mostram cada vez mais resistentes aos fármacos comumente utilizados. Além disso, a importância destes resultados se dá pela viabilidade de incorporação do benzopirano HP1 em nanoemulsões e a capacidade desses sistemas em reduzir a dose ativa no benzopirano HP1 por uma maior solubilização do composto e assim, melhor absorção. Dessa maneira, os resultados deste trabalho representam o alto potencial biológico de espécies de Hypericum e abrem possibilidade para mais estudos utilizando estas plantas. / Plants from genus Hypericum (Hypericaceae) are recognized as a source of therapeutical agents. To south Brazil species, acitivities like antifungal and antinociceptive had already been demonstrated, attributed mainly to compounds from lipophilic fractions as phloroglucinol derivatives, benzophenones and benzopyrans. In this study, antifungal potential of lipophilic fractions of H. carinatum and fluconazole against emerging yeasts was evaluated by two methodologies for multiple dose-response analyzes: checkerboard and isobologram. To Candida krusei and C. famata isolates the effect of association was higher than the effect of fluconazole alone. Thus, the susceptibility profile observed for these species suggests that, somehow, the fractions are facilitating the action of drug. Still on therapeutical potential of Hypericum species, the antinociceptive study of a benzopyran (HP1) isolated from H. polyanthemum, incorporate in nanoemulsions, was evaluated. The results demonstrated that HP1 could be incorporated in a nanoemulsion system, given the high solubility in the oil core. Regarding the antinociceptive effect, HP1 loaded in nanoemulsions showed the same effect of free form, in magnitude, at lower doses. These results suggest a better solubilization of HP1 when loaded in nanoemulsions, and, thus, better absorption by organism. In this context, ex vivo intestinal permeability studies (Ussing chambers) of HP1 free form and loaded in nanoemulsions were performed. The results showed that the intestinal permeability of HP1 loaded in nanoemulsions were about 4 times higher than HP1 free form. Besides, the intestinal permeability of HP1 free form in absorptive direction was higher than secretory direction indicating that active transporters are, at least in part, involved in HP1 intestinal absorption. Thus, in order to elucidate the probable active transporter of HP1 and since its structure looks like a cannabinoid molecule and there is a relation between the opioid and cannabinoid pathways, the influence of intestinal cannabinoid system in HP1 absorption was investigated. The results indicated that the benzopyran HP1 may be related to cannabinoid system, but the nature of this interaction: transport, agonism/antagonism or physico-chemical is still unknown. The outcomes obtained are relevant since the resistance of emerging yeast species to available drugs, used for a variety of fungal infections, is increasing. The importance of these findings lies also in the feasibility of incorporating HP1 into nanoemulsions, and the capacity of these systems in reduce the antinociceptive active doses, by higher solubilization, and thus, absorption. Then, together the results represent the high biological potential of Hypericum species and open new possibilities to further studies with these plants.

In the last two decades it has been seen a large increase in blood stream infections by Candida spp. The candidemias are associated with high morbidity and mortality, as well as the increase in hospital costs. The phenomenon of resistance highlights the importance of performing tests for susceptibility to antifungal agents. Such tests are improving constantly in an attempt to standardize their interpretations. This study evaluated the susceptibility of Candida spp. isolated from candidemias during a period of 15 years divided into three periods of five years in Santa Maria, RS, Brazil, interpreting minimum inhibitory concentrations according to the proposal of the CLSI and the new breakpoints recently proposed by Pfaller et al. Among the 525 isolates during the three periods, C. parapsilosis was the predominant species (49.14%), followed by C. albicans (34.47%), C. tropicalis (8.19%), C. glabrata (3.61%), C. lusitaniae (1.90%), C. guilliermondii (1.71%) and C.krusei (0.95%). During the study period and considering the two criteria, 136 non-susceptible isolates were found. According to CLSI, we identified 40 (7.61%) non-susceptible isolates, from wich 19 (3.61%) were resistant. According to Pfaller et al., 96 (18.28%) isolates presented themselves as nonsusceptible, being 11 (2.09%) resistant. All isolates were susceptible to amphotericin B and 3 presented themselves dose-dependent or intermediate suscpetible to flucytosine and caspofungin. Resistance was detected only among the azole antifungals: itraconazole (2.09%), fluconazole (1.14%) and voriconazole (0.38%). The isolation of species resistant to the antifungal agents used was not a prominent feature in this study. Detecting a higher number of non-susceptible species highlighted the relevance of evaluating of susceptibility tests by new breakpoints in order to find a more efficient therapy. / Nas últimas duas décadas observou-se um grande aumento nas infecções de corrente sanguínea por Candida spp. As candidemias estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade, bem como ao incremento nos custos hospitalares. O fenômeno da resistência evidencia a importância da realização de testes de suscetibilidade aos agentes antifúngicos. Tais testes estão aprimorando-se constantemente na tentativa de uniformizar suas respectivas interpretações. O presente estudo avaliou a suscetibilidade de Candida spp. isoladas de candidemias por um período de 15 anos divididos em três períodos de cinco anos, em Santa Maria, RS, Brasil, interpretando as concentrações inibitórias mínimas de acordo com a proposta do CLSI e os novos breakpoints recentemente propostos por Pfaller et al. Entre os 525 isolados nos três períodos avaliados, C. parapsilosis foi a espécie predominante (49,14%), seguida por C. albicans (34,47%), C. tropicalis (8,19%), C. glabrata (3,61%), C. lusitaniae (1,90%), C. guilliermondii (1,71%), e C. krusei (0,95%). Durante o período estudado e considerando-se os dois critérios, foram detectados 136 isolados não sensíveis. Segundo o CLSI, foram identificados 40 (7,61%) isolados não sensíveis, sendo 19 (3,61%) resistentes. De acordo com Pfaller et al., 96 (18,28%) isolados apresentaram-se como não sensíveis, sendo 11 (2,09%) resistentes. Todos os isolados foram sensíveis a anfotericina B e 5 e 3 isolados apresentaram-se intermediários a flucitosina e caspofungina, respectivamente. Resistência foi detectada somente entre os antifúngicos azólicos: itraconazol (2,09%), fluconazol (1,14%), e voriconazol (0,38%). O isolamento de espécies resistentes aos agentes antifúngicos utilizados não foi uma característica marcante no presente estudo. Este estudo permitiu uma melhor visão da epidemiologia local. A detecção de um maior número de espécies não sensíveis ressaltou a relevância da avaliação dos testes suscetibilidade através dos novos breakpoints a fim de ser direcionada a uma terapia mais eficiente.

A atividade de catalase em Candida albicans tem sido sugerida como um mecanismo de resistência ao antifúngico anfotericina B. Neste contexto, poucos são os estudos de enzimas como catalase e superóxido dismutase em leveduras do gênero Candida expostas a diferentes situações. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o efeito da exposição de Candida a antineoplásicos, íons metálicos e antifúngicos como fluconazol e anfotericina B sobre a atividade dessas enzimas. Os resultados apontaram que o antineoplásico metotrexato aumentou a atividade da catalase em C. albicans, que íons metálicos como cobre, zinco, manganês e ferro produzem um efeito variável na atividade de superóxido dismutase, bem como, um efeito variável de um íon no acúmulo de outro. Também verificamos através de nossos resultados que a indução de resistência ao fluconazol e anfotericina B aumentam a atividade de catalase e superóxido dismutase em C. albicans e C. dubliniensis. Esses resultados sugerem que o antineoplásico metotrexato e a indução de resistência a anfotericina B e fluconazol podem gerar um estresse oxidativo em leveduras do gênero Candida que possivelmente se adaptam a esse estresse aumentando seus mecanismos de defesa antioxidante. Esse efeito pode induzir a uma maior resistência desses organismos ao ataque de células fagocíticas do hospedeiro. / Catalase is an enzyme that has been suggested to be involved in resistance mechanisms to antifungal drug such as amphotericin B. There are few studies focusing on catalase and superoxide dismutase in yeasts, such as Candida, exposed to different situations. Thereby, the aim of the present study was to investigate the effect of exposing Candida to antineoplastic drugs, metallic ions and antifungial drugs, namely fluconazole and amphotericin B, on catalase and superoxide dismutase activities. Results show that methotrexate induced catalase activity in C. albicans and that metallic ions, such as copper, zinc, manganese and iron produced a variable effect on superoxide dismutase activity of C. albicans, as well as a variable effect in the uptake of one ion on another. We also showed that fluconazole and amphotericin B resistance increased catalase and superoxide dismutase activity in C. albicans and C. dubliniensis. These results suggest that methotrexate as well as the induction of fluconazole- and amphotericin B-resistance may induce oxidative stress in yeasts such as Candida, which may adapt by increasing antioxidant defense mechanisms. This effect may induce a major resistance of this yeast to phagocytic cell attack.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-28T22:13:37Z No. of bitstreams: 1 2018_MarceloFontanadaSilveira.pdf: 3385271 bytes, checksum: b191ac30caef53d7fbe3dcc38e016154 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-09-04T22:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_MarceloFontanadaSilveira.pdf: 3385271 bytes, checksum: b191ac30caef53d7fbe3dcc38e016154 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T22:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_MarceloFontanadaSilveira.pdf: 3385271 bytes, checksum: b191ac30caef53d7fbe3dcc38e016154 (MD5) Previous issue date: 2018-08-28 / Este trabalho avaliou a influência dos metabólitos secundários das espécies de madeiras da Caatinga Pterodon abruptus, Diptychandra aurantiaca, Terminalia fagifolia, Machaerium acutifolium e Aspidosperma multiflorum, na resistência ao ataque de quatro fungos apodrecedores: Trametes versicolor, Pycnoporus sanguineus, Gloeophyllum trabeum e Gloeophyllum striatum. As espécies de madeira foram submetidas ao ensaio de apodrecimento acelerado em laboratório de acordo com ASTM D 2017/05. Em relação ao ataque dos quatro fungos, as espécies Pterodon abruptus e Diptychandra aurantiaca foram classificadas como altamente resistentes e a espécie Machaerium acutifolium foi classificada como resistente. Terminalia fagifolia foi classificada como altamente resistente aos fungos P. sanguineus, G. trabeum e G. striatum, e resistente ao T. versicolor. Aspidosperma multiflorum foi resistente aos fungos de podridão branca e moderadamente resistente aos fungos de podridão parda. De cada espécie madeireira foram obtidos metabólitos secundários pela maceração com metanol, seguida da separação em quatro extratos em razão da polaridade dos solventes utilizados: nhexano, diclorometano, acetato de etila e 1-butanol. Esses extratos foram utilizados para avaliar seu potencial antifúngico em testes de inibição por difusão em placas de Petri. Este teste apresentou resultados semelhantes ao alcançados nos testes de apodrecimento acelerado para todas as espécies, com exceção da T. fagifolia. Quanto aos metabólitos secundários, os compostos presentes no extrato metanólico bruto e extrato hexânico apresentaram maior atividade antifúngica. O estudo se mostrou útil para avaliação de metabólitos secundários com potencial antifúngico em cada um dos extratos de diferentes polaridades. / This work evaluated the influence of secondary metabolites of the Caatinga wood species Pterodon abruptus, Diptychandra aurantiaca, Terminalia fagifolia, Machaerium acutifolium and Aspidosperma multiflorum, on the resistance against four wood decaying fungi Trametes versicolor, Pycnoporus sanguineus, Gloeophyllum trabeum and Gloeophyllum striatum. The wood species were submitted to the laboratory accelerated rotting test in accordance with ASTM D 2017/05. In relation to the attack of the four wood decaying fungi, the species Pterodon abruptus and Diptychandra aurantiaca were classified as highly resistant and the specie Machaerium acutifolium was classified as resistant. Terminalia fagifolia was classified as highly resistant to fungi P. sanguineus, G. trabeum and G. striatum, and resistant to T. versicolor. Aspidosperma multiflorum was resistant to white rot fungi and moderately resistant to brown rot fungi. From each species, secondary metabolites were obtained by maceration in methanol, followed by separation in four extracts due to the polarity of the solvents used: nhexane, dichloromethane, ethyl acetate and 1-butanol. These extracts were used to evaluate their antifungal potential on Petri dishes diffusion inhibition tests. This test presented similar results to those obtained in laboratory accelerated rotting test for all species, except for T. fagifolia. For the secondary metabolites, the compounds present in the crude methanolic extract and hexane extract presented higher antifungal activity. The test proved to be useful for the evaluation of secondary metabolites in each one of separated extracts with antifungal potential.

As regiões costeiras estão sendo ameaçadas por apresentarem uma exploração desordenada e predatória de seus recursos naturais alterando a biodiversidade. Leveduras fazem parte do ecossistema marinho, entretanto algumas espécies estão associadas à micoses superficial, subcutânea e/ou sistêmicas. O objetivo deste estudo foi quantificar leveduras, isolar e caracterizar Trichosporon spp., em amostras água de mar e areia em três regiões costeiras do estado de São Paulo: Baixada Santista, Canal de São Sebastião e Ubatuba. Foram coletadas 126 amostras de água de mar e areia. As áreas foram caracterizadas usando parâmetros microbiológicos. A contagem de leveduras variou de <1 a 1.300UFC/100mL em água de mar e <1 a 3.200UFC/g em areia. As leveduras isoladas foram identificadas usando a metodologia tradicional e testes genotípicos. De um total de 102, 30,5% foi confirmado pelo API ID 32C, 40,2% pelo auxanograma e 63,7% pelo PCR. Os isolados identificados pelo PCR foram seqüenciados e 41,5% foram Trichosporon spp. / Coastal regions are being threatened because they have a predatory and uncontrolled exploitation of natural resources by changing biodiversity. Yeasts are part of the marine ecosystem, though some species are associated with superficial mycoses, subcutaneous and / or systemic. The objective of this study was to quantify yeast, isolation and Trichosporon spp. In samples of sea water and sand in three regions of the state of São Paulo: Santos, Canal de São Sebastião and Ubatuba. We collected 126 samples of sea water and sand. The areas were characterized by microbiological parameters. Yeast counts ranged from <1 to 1.300UFC/100mL in sea water and <1 to 3.200UFC / g in sand. The yeasts were identified using the traditional methods and genotypic tests. From a total of 102, 30.5% was confirmed by API ID 32C, by 40.2% and 63.7% auxanograma PCR. The isolates identified by PCR were sequenced and 41.5% were Trichosporon spp.