Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Paulo César Gomes / Banca: Claudia Vianna Maurer Morelli / Banca: Valeria Valente / Resumo: A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica e oportunista, causada pelas leveduras capsuladas das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, afetando tanto pacientes imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Uma propriedade importante do gênero Cryptococcus é a capacidade de formação de biofilmes. A resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos traz a necessidade da busca de novas terapias. Desta forma, o nosso grupo vem trabalhando com moléculas antifúngicas derivadas de fontes naturais, como as chalconas, onde foi verificado que C. neoformans é sensível a algumas destas moléculas. Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a 3'- chalcona como antifúngico contra C. gattii em situação planctônica e biofilme, como também a eficiência e toxicidade em modelos animais alternativos como Danio rerio (Zebrafish) e Galleria mellonella, propondo uma nova alternativa para o tratamento. In vitro, os resultados para a forma planctônica do fungo mostraram que a 3'- chalcona foi mais eficaz para a cepa 118, com concentração inibitória mínima (CIM) de 0,96 µg/mL e para a cepa 56990 de C. gattii, a molécula mostrou ação potente com CIM entre 1,95 e 3,90 µg/mL. No ensaio de formação do biofilme com as duas cepas, observou-se uma atividade metabólica crescente até 72 horas e uma biomassa e matriz extracelular que alcançou seu máximo nas 48 horas. Em seguida, foi feita a avaliação da atividade da 3'- chalcona contra a formação do biofilme maduro após 48 horas, apresenta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Criptococose is a fungal, systemic and opportunistic infection mainly caused by capsulated yeast of the species Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, affecting immunocompetent and immunocompromised patients. An important property of the genus Cryptococcus is the biofilm formation, which can be considered a virulence factor and resistance. The resistance of biofilms to antifungal agents brings the need to search new therapies. Thus, our group has been working with antifungal molecules derived from natural sources such as chalcones, where it was found that C. neoformans is sensitive to some of these molecules. For this fact, the objective of this study was to test the 3'- chalcone as antifungal against C. gattii in planktonic and biofilm forms, as well as efficiency and toxicity in alternative animal models like Danio rerio (Zebrafish) and Galleria mellonella, proposing a new alternative for treatment. In vitro, the results for the planktonic form of the fungus showed that the 3'- chalcone was more effective for the 118 strain, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.96 µg/mL. For the strain 56990 of C. gattii the molecule showed potent activity with MIC values between 1.95 and 3.90 µg/mL. Biofilm formation assay for both strains had an increased metabolic activity within 72 hours and a biomass and extracellular matrix which reached its maximum in 48 hours. Then, the evaluation of the activity of the 3'-chalcone against the formation of mature biofilm was made after 48 hours, showing inhibition at a concentration of 62.5 µg/mL for ATCC strain and 31.2 µg/mL against the isolated 118. Also, the growth of biofilm against to amphotericin B (AmB) was evaluated, obtained as a result of inhibition at all concentrations for the two strains and against fluconazole were resistant. In vivo, the results of toxicity in zebrafish embryos revealed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A criptococose tem emergido como importante infecção oportunista em pacientes imunossuprimidos e imunocompetentes causando principalmente a neurocriptococose. Cryptococcus neoformans, um dos agentes, é uma levedura capsulada comumente encontrada em infecções do sistema nervoso central em pacientes HIV positivos. No mercado há fármacos para o tratamento dessas infecções, porém problemas são verificados quanto ao espectro de ação, custos e efeitos adversos. As plantas são usadas na medicina por longa data constituindo-se de uma ótima alternativa para busca de substâncias que podem ser utilizadas na formulação de novos antifúngicos. Neste estudo foram avaliados vários extratos, frações e substâncias puras do projeto BIOTA frente à cepa ATCC de C. neoformans, bem como em isolados clínicos com perfil de sensível e resistente frente ao fluconazol. Também foi feita a padronização e aplicação da metodologia do "tabuleiro de xadrez" para verificação de atividade sinérgica, aditiva, indiferente e antagônica entre as frações de plantas de interesse, bem como a molécula pedalitina associada com outras substâncias de origem vegetal e com as drogas sintéticas fluconazol e anfotericina B. Os que apresentaram melhores concentrações inibitórias mínimas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryptococcosis is a disease that has emerged as an important opportunistic infection in immunocompromised and immunocompetent patients mainly causing cryptococcal meningitis. Cryptococcus neoformans, one of the agents, is encapsulated yeast most commonly found in central nervous system infections in HIV patients. There are drugs on the marketplace for the treatment of these infections, but problems are related to spectrum of action, costs and adverse effects. Plants are used in medicine for a long time and they are a great alternative to look for substances that can be used to develop new antifungal agents. In this study we evaluated several extracts, fractions and pure substances from BIOTA project against the ATCC strain of C. neoformans, as well as clinical isolates with sensible and resistant profile to fluconazole. The standardization and application of the methodology of the chessboard technique was developed to verify synergistic, additive, indifferent and antagonistic activities among the fractions of the selected plants, and the molecule pedalitin associated with other natural compounds and the synthetic drugs fluconazole and amphotericin B. The substances that presented the best minimum inhibitory concentrations were selected to verify the fungi protein profile before and after contact with the plant substance and adhesion profile to cells (pneumocytes) A549. Among the plants studied, Pterogyne nitens, specie that belongs to the family Fabaceae, which has the active substance called pedalitin, presented a significant antifungal activity against the isolates of C. neoformans including resistant. Suspensions of C. neoformans with and without treatment with fluconazole and in contact with pedalitin were analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis. These treatments revealed changes in the expression... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Coorientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maristela Pereira / Banca: Maysa Furlan / Mestre

Fungos filamentosos com capacidade de produzir micotoxinas podem estar presentes em alimentos, desde o cultivo até o produto após industrialização. Devido a isso, estratégias para controlar o crescimento fúngico devem ser investigadas, a fim de evitar o desenvolvimento desses microrganismos, bem como a produção de suas toxinas nos alimentos. Neste trabalho, duas abordagens para o controle de fungos toxigênicos foram avaliadas. A primeira estratégia foi a utilização de bactérias provenientes de diferentes ambientes aquáticos, sendo que 10 linhagens de Bacillus spp. e a linhagem Pseudomonas sp. 4B foram testadas quanto à influência sobre os parâmetros de crescimento (taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos) de fungos toxigênicos (Aspergillus e Penicillium) e formação de micotoxinas. Todas as bactérias foram capazes de inibir o crescimento dos fungos em meio de cultura, apresentando halos de inibição variando de 1,0 até 15,7 mm. Bacillus sp. P11 apresentou resultados mais expressivos em relação às demais linhagens do gênero Bacillus com maiores valores de redução na maioria dos parâmetros de crescimento. Além disso, Bacillus sp. P11 e Pseudomonas sp. 4B apresentaram efeito sobre as taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos, com níveis de redução acima de 43,3, 32,1 e 84,1% respectivamente. Mesmo assim, as demais linhagens também apresentaram resultados satisfatórios sobre esses parâmetros. Estas bactérias também reduziram a síntese de aflatoxina B1 e ocratoxina A em mais de 94 e 63%, respectivamente, quando cultivadas simultaneamente com os fungos produtores de cada micotoxina. Adicionalmente, a capacidade de Bacillus sp. P11 em produzir os lipopeptídeos iturina A (167,9 mg/mL de extrato butanólico) e surfactina (361,9 mg/mL de extrato butanólico) foi confirmada. Estes compostos podem ter contribuído para a atividade antifúngica desta bactéria. A segunda estratégia investigada neste estudo para controlar o desenvolvimento de fungos toxigênicos foi o emprego de nanofibras de poli-ɛ-caprolactona (PCL) incorporadas com cetoconazol e natamicina como material antimicrobiano. Nesta abordagem, as nanofibras foram produzidas pela técnica de eletrofiação e posteriormente caracterizadas e avaliadas quanto ao seu potencial antifúngico. Nanofibras funcionalizadas com cetoconazol ou natamicina apresentaram atividade antifúngica contra os isolados toxigênicos uma vez que zonas de inibição variando de 6 a 44 mm foram observadas. Além disso, as análises de microscopia eletrônica e espectroscopia demonstraram que a incorporação dos antifúngicos não altera de forma expressiva as principais características das nanofibras. Também foi possível verificar a capacidade de liberação controlada dos antifúngicos durante 72 h de contato das nanofibras com diferentes soluções simulantes. Valores próximos a 80 e 45 μg/mL de cetoconazol e natamicina, respectivamente, foram observados em solução de Tween 20 (5%). Portanto, o processo de eletrofiação foi capaz de agregar propriedades antifúngicas às nanofibras de PCL. Os resultados demonstraram que as bactérias e os nanomateriais investigados neste estudo são promissores para o controle de fungos toxigênicos e produção de micotoxinas. / Filamentous fungi that have the potential to produce mycotoxins may be present in food, from cultivation to after industrialization. Therefore, several strategies to control fungal growth must be investigated in order to avoid the development of these microorganisms and the production of their toxins in food. In this work, two approaches to toxigenic fungi control were evaluated. The first one was the use of bacteria from different aquatic environments as biocontrol agents in which 10 Bacillus spp. strains and the Pseudomonas sp. 4B strain were tested in relation to the effect on growth parameters (mycelial growth, sporulation and spore germination rates) of toxigenic fungi (Aspergillus and Penicillium) and mycotoxin formation. All bacteria were able to inhibit the fungal growth in culture medium with inhibition zones ranging from 1.0 to 15.7 mm. It was also observed that Bacillus sp. P11 had better results compared to other Bacillus strains with larger reduction values in most of growth parameters. Furthermore, Bacillus sp. P11 and Pseudomonas sp. 4B exhibited effect on mycelial growth, sporulation and spore germination rates with reduction values above of 43.3, 32.1 and 84.1%, respectively. Even so, the other strains also showed satisfactory results on these parameters. Finally, these bacteria reduced the synthesis of aflatoxin B1 and ochratoxin A at levels above 94 and 63%, respectively, when co-cultivated with each mycotoxin producing fungi. Additionally, the ability of Bacillus sp. P11 to produce lipopeptides such as iturin A (167.9 mg/ml of butanolic extract) and surfactin (361.9 mg/ml of butanolic extract) was confirmed. These compounds may have contributed to antifungal activity of this bacterium. The second investigation of this work in order to control the growth of toxigenic fungi was the use of poly-ε-caprolactone nanofibers incorporated with ketoconazole and natamycin as antimicrobial material. In this approach, nanofibers were produced by the electrospinning technique and subsequently characterized and evaluated for their antifungal potential. Both nanofibers functionalized with ketoconazole and natamycin showed antifungal activity against toxigenic isolates since inhibitory zones ranging from 6 to 44 mm were observed. In addition, scanning electron microscopy and infrared spectroscopy analysis showed that the antifungals incorporation does not change the characteristics of nanofibers. It was also possible to verify the ability of controlled drug release during 72 h of nanofibers contact with different simulants solutions. Values near 80 and 45 μg/ml of ketoconazole and natamycin, respectively, were observed in the solution containing 5% Tween 20. Therefore, the electrospinning process was able to provide antifungal properties to the nanofibers. The results showed that bacteria and nanomaterials investigated in this study are promising for developing control strategies of toxigenic fungi and mycotoxin production.

Orientador: Angelica Zaninelli Schreiber, Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T13:48:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Loyola_AnaBeatrizAlkmimTeixeira_D.pdf: 5844968 bytes, checksum: 4d27c47d59746710e359ef7d4b61f1b7 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus são fungos hialinos, saprófitas, encontrados no solo e na vegetação em decomposição e têm sido, crescentemente, relatados em casos de infecções sistêmicas ou disseminadas. A patogenicidade destes fungos oportunistas está na alta concentração dos microconídios no ar, facilitando a sua inalação. Infecções por Fusarium spp são altamente resistentes à terapia disponível, com prognostico desfavorável e taxa de mortalidade em torno de 57% dos casos. Vários relatos têm descrito a tolerância in vitro, ou resistência, de espécies de Aspergillus aos agentes antifúngicos após falha terapêutica com anfotericina B. A infecção por Aspergillus sp em pacientes imunossuprimidos apresenta taxa de mortalidade em torno de 86%, independente do tratamento antifúngico. Assim, testes de suscetibilidade a antifúngicos são de estrema importância. O teste de microdiluição, utilizando suspensão de conídios, foi recentemente padronizado pelo CLSI. No entanto, em regra, as infecções causadas por fungos filamentosos são caracterizadas pela presença de hifas no tecido infectado, sendo portanto, a realização do teste de suscetibilidade com hifas, de grande interesse clinico. A concentração inibitória mínima (CIM) de vários agentes antifúngicos pode ser determinada pela observação da inibição de crescimento de um hifa isolada. Há poucos relatos na literatura sobre a medição automatizada do crescimento de hifas de Aspergillus sp. e nenhum relato para hifas de Fusarium sp. pelo sistema 'BioCell-tracer POT. MARCA REGISTRADA¿... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Aspergillus and Fusarium species are hyaline moulds that are usually found in the soil and plants. These organisms have emerged as a cause of disseminated invasive disease. It has been suggested that airborne conidia might invade the respiratory tract with primary lung or sinus localisation Fusarium species are largely resistant to available chemotherapy and are correlated with poor prognosis and lethal outcome in 57% of the cases. Several reports have described in vitro tolerance or resistance of Aspergillus spp to antifungal infection in immunossupressed patients shows mortality around 86%, independente of antifungal treatment. Antifungal susceptibility testing of filamentous fungi has therefore become more importante. Since most infections caused by filamentous fungi are characterized by the presence of hyphal elements in the tissue, the monitoring of hyphal susceptibility might be of clinical interest. The MICs of several antifungal agents cam be determined based on the growth rate of a single hypha. There are only few reports for automatic growth evaluation for Aspergillus spp and no reports for Fusarium spp using the 'BioCell-tracer POT. MARCA REGISTRADA¿ system. In this work, we selected four clinical isolates of Aspergillus and four clinical isolates of Susarium. For all strains we prodeeded microdilution and hypha susceptibility antifungal evaluation with amphotericin B and itraconazole...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Jose Francisco Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anibal_PaulaCristina_M.pdf: 2168298 bytes, checksum: 97eb6e5c3daa9ef33ad620dedafac901 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A cavidade oral abriga uma complexa comunidade de microrganismos que podem estar aderidos aos dentes, à mucosa epitelial ou formando biofilme. A maioria desses microrganismos são comensais, com uma minoria causando infecções oportunistas. Dentre esses microrganismos, encontramos as leveduras do gênero Candida, principalmente em indivíduos imunocomprometidos; o principal agente etiológico da cárie dental Streptococcus mutans e, apesar da presença controversa, o patógeno oportunista Staphylococcus aureus. Diante do desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos, há uma grande preocupação relacionada a qual tipo de tratamento utilizar no combate às infecções provocadas por esses microrganismos. O emprego de extratos brutos de plantas tem merecido a atenção de pesquisadores de vários países, já que podem inibir o crescimento bacteriano e fúngico por diferentes mecanismos quando comparados aos antimicrobianos, justificando a pesquisa em questão. As plantas utilizadas nesta pesquisa foram a Mentha piperita, Rosmarinus officinalis, Tabebuia avellanedae, Arrabidaea chica, Syzygium cumini e Punica granatum, extraídas com os solventes diclorometano e metanol, os quais foram eliminados em rotaevaporador, para a obtenção dos extratos brutos, a fim de se avaliar sua concentração inibitória mínima (CIM) frente a essas cepas de microrganismos. Os resultados obtidos revelaram-se promissores com as espécies de Candida testadas, principalmente com o extrato metanólico, cuja inibição apresentou atividade com alta sensibilidade das leveduras, porém essa mesma atividade não ocorreu entre as bactérias. Esses dados indicam a necessidade da ampliação do conhecimento sobre as espécies de plantas com potencial antimicrobiano, além de se testar extratos mais purificados e com propriedades farmacológicas ativas contra organismos microbianos. De qualquer forma, estes resultados nos levam a considerar esses extratos vegetais como fontes valiosas para a descoberta de novas moléculas bioativas empregadas para o tratamento alternativo no combate aos agentes microbianos, principalmente àqueles resistentes às drogas antifúngicas e antibacterianas convencionais / Abstract: The oral cavity is a source of a complex microorganisms community that may adhere to teeth, epithelial mucosa or form biofilms. Most of these strains are thought to be commensal, and a small number cause opportunistic infections. Among these microorganisms Candida yeast is the most commom in immunocompromised patients; Sretptococcus mutans is regarded as the primary etiologic agent of dental caries and, although considered controversial the presence, Staphylococcus aureus is also mentioned as an opportunistic pathogen in the oral cavity. Considering the frequent use of antifungal and antibiotics as antimicrobial agents, the development of resistance to these drugs has become an important and worrying factor for the treatment of the infections caused by these microorganisms. The use of crude plants extracts has been a researcherâ?¿s concern from all over the world, since they may inhibit the bacteria and fungi growing by different mechanisms present in the conventional antimicrobials, becoming an important source of investigation. The plants used in this research were Mentha piperita, Rosmarinus officinalis, Tabebuia avellanedae, Arrabidaea chica, Syzygium cumini and Punica granatum, extracted with dichloromethane and methanol solvents, followed by a minimal inhibitory concentration (MIC) evaluation. The data obtained with Candida strains were promising, specially with the methanolic extract that showed activity in a higher sensibility, but the same activity did not occur among the bacterias. This information increases our knowledge of the crude plants extracts effect against microbial organisms. Nevertheless, the results of this study indicated that these extracts are a promising source for the alternative treatment against the microbial agents, specially for those resistant to the conventional antimicrobial agents / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T21:59:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReichertLima_Franqueline_M.pdf: 2034183 bytes, checksum: 203b846210e23f42a824280eb3cadda2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O gênero Cryptococcus engloba duas espécies consideradas patogênicas: C.neoformans e C.gattii. Apesar dos avanços na área médica, a criptococose permanece uma das infecções fúngicas sistêmicas mais importantes no Brasil. Anfotericina B (AMB) associada a flucitosina (5FC) é a terapia de indução indicada porém, no Brasil, 5FC não está disponível e o tratamento segue somente com AMB ou em associação com fluconazol (FCL). Este trabalho avaliou a ocorrência de espécies e os genótipos de isolados clínicos de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP em um período de 5 anos; isolados ambientais coletados na cidade de Campinas-SP e o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos sozinhos contra isolados clínicos e ambientais e o efeito de combinações de antifúngicos frente a isolados clínicos de Cryptococcus spp.. A identificação de espécies e genótipos foi realizada por testes bioquímicos, Restriction Fragment Length Polymorphism do gene URA5 (URA5-RFLP) e sequenciamento da região Internal Transcribed Spacer (ITS) do DNA ribossomal. Testes de suscetibilidade para AMB, 5FC, FCL, voriconazol (VRC), itraconazol (ITC) e terbinafina (TRB) isolados foram realizados conforme CLSI M27-A3 (2008). Os testes com antifúngicos combinados (AMB+5FC; AMB+FCL; AMB+TRB; FCL+TRB), foram realizados pelo método do "tabuleiro de xadrez" para determinação do Coeficiente de Inibição Fracional (CIF) para avaliar o tipo de interação entre as substâncias (sinergismo, indiferença ou antagonismo). Dentre 75 isolados clínicos reativados, foram identificados 66 C.neoformans e 9 C.gattii. Todos C.gattii pertenceram ao genótipo VGII enquanto que 62 isolados de C.neoformans ao genótipo VNI e apenas 4 ao genótipo VNII. Foram obtidos 92 isolados ambientais de Cryptococcus, pertencentes às espécies C.neoformans (genótipo VNI), C.laurentii, C.albidus, C.flavescens e Cryptococcus spp.. Os valores dos intervalos de CIM para C.neoformans clínicos foram AMB: ? 0,125-1 µg/mL; 5FC: ? 0,125-2 µg/mL; FCL: 0,25-8 µg/mL; VRC: ? 0,015-0,125 µg/mL; ITC: 0,03-0,25 µg/mL e TRB: 0,125-2 µg/mL. Intervalos de CIM para C.gattii variaram de 0,25-1 µg/mL para AMB; 0,5-4 µg/mL para 5FC; 2-16 µg/mL para FCL; 0,06-0,25µg/mL para VRC; 0,06-0,5 µg/mL para ITC e 0,5-4 µg/mL para TRB. Foram observados elevados valores de CIM para os antifúngicos 5FC e FCL frente aos isolados ambientais de C.albidus e C.laurentii. O genótipo VNI de C.neoformans clínico mostrou 75,80% de interação sinérgica para AMB+5FC; 79,03% para AMB+FCL; 77,42% para AMB+TRB e 95,16% para FCL+TRB. O genótipo VNII apresentou 100% de sinergismo em todas as combinações. C.gattii (VGII) apresentou 88,9% de sinergismo nas combinações AMB+5FC e AMB+FCL; 100% para AMB+TRB e FCL+TRB. Não foi observado efeito antagônico nas combinações de antifúngicos. Foi observado bom desempenho nas combinações realizadas, especialmente naquelas envolvendo a TRB para ambas as espécies C.neoformans e C.gattii. O genótipo VNI foi o predominante entre os genótipos que afetam os pacientes com criptococose na região de Campinas. Em infecções de difícil tratamento ou que não respondem aos antifúngicos convencionais, a combinação de diferentes antifúngicos como AMB+TRB ou FCL+TRB podem vir a ser uma alternativa em países onde 5FC não está disponível, como no Brasil. Mais estudos são necessários para avaliar o papel dos genótipos na sensibilidade aos antifúngicos, assim como estudos de combinações de antifúngicos in vitro e in vivo para que novas estratégias possam ser empregadas no tratamento da criptococose / Abstract: Cryptococcus genus comprises two species considered pathogenic: C.neoformans and C.gattii. Despite advances in the medical field, cryptococcosis remains one of the most important systemic fungal infections in Brazil. Amphotericin B (AMB) associated with flucytosine (5FC) induction therapy is indicated but, in Brazil, 5FC is not available and treatment follows only with AMB or in combination with fluconazole (FCL). This study evaluated the prevalence of species and molecular subtypes of clinical isolates from patients treated at the Hospital of UNICAMP in a period of 5 years; environmental isolates collected in Campinas ¿ SP and in vitro antifungal susceptibility profile of antifungal agents alone against clinical and enviromental isolates of Cryptococcus spp. and the effect of combinations of antifungal agents against clinical isolates of Cryptococcus spp.. The species identification and subtyping was performed by biochemical tests, Restriction Fragment Length Polymorphism of URA5 gene (RFLP - URA5) and sequencing of the Internal Transcribed Spacer region (ITS) of ribosomal DNA. Susceptibility tests for AMB, 5FC, FCL, voriconazole (VRC), itraconazole (ITC) and terbinafine (TRB) isolated were performed according to CLSI M27-A3 (2008). Combined antifungals tests (AMB +5FC; AMB+FCL; AMB +TRB, FCL+TRB), were performed by the "Checkerboard" method to determine the Fractional Inhibitory Coefficient index (FIC) to assess the type of interaction between substances (synergism, indifference or antagonism). Among the 75 viable clinical isolates, 66 were identified as C.neoformans and 9 as C.gattii. All C.gattii belonged to subtype VGII while 62 isolates belonged C.neoformans VNI genotype and only 4 VNII. 92 environmental isolates of Cryptococcus were obtained. The species C.neoformans (subtype VNI) C.laurentii, C.albidus, C.flavescens and Cryptococcus spp.were identified. The MIC range values of clinical C.neoformans for AMB were: ? 0.125 -1 µg/mL; 5FC: ? 0.125 to 2 µg/mL; FCL: 0.25-8 µg/mL; VRC: ? 0.015 to 0.125 µg/mL; ITC: 0.03 to 0.25 µg/mL and TRB: 0.125 to 2 µg/mL. MIC for C.gattii ranged from 0.25-1 µg/mL for AMB; 0.5-4 µg/mL for 5FC; 2-16 µg/mL for FCL; 0.06 to 0.25 µg/mL for VRC; 0.06 to 0.5 µg/mL for ITC and 0.5-4 µg/mL for TRB. High MIC values were observed for FCL and 5FC against environmental isolates of C.albidus and C.laurentii. The VNI C.neoformans genotype showed 75.80 % of synergistic interaction for AMB+5FC; 79.03 % for AMB + FCL; 77.42 % for AMB + TRB and 95.16 % for FCL+TRB. The VNII genotype showed 100% synergism in all combinations. C.gattii (VGII) showed 88.9 % of synergism in combinations AMB+5 FC and AMB+FCL; 100 % for AMB+TRB and TRB+FCL. No antagonistic effect was observed in all evaluated antifungal combinations. Good performance was observed in all combinations performed, especially those involving TRB for both C.neoformans and C.gattii species. The VNI was the predominant genotype among genotypes affecting patients with cryptococcosis in Campinas region. In difficult to treat infections or unresponsive to conventional antifungal agents, the combination of different antifungals so as AMB+FCL or TRB+TRB may become an alternative in countries where 5FC is not available, as in Brazil. More studies are needed to evaluate the role of genotypes in sensitivity to antifungal agents, as well as antifungal agents combination studies in vitro and in vivo so that new strategies can be employed in the treatment of cryptococcosis / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Urease of Helicobacter pylori is an important virulence factor implicated in the pathogenesis of many clinical conditions, such as chronic gastritis, peptic ulceration, and gastric cancer. Many urease inhibitors have been discovered, like phosphorodiamidates, hydroxamic acid derivatives, and imidazoles. Despite good activities at the enzyme level and excellent kinetic properties most of them have not been used as therapeutic agents in vivo because of their side effects, toxicity and instability. This has led to much attention to focus on exploring the novel urease inhibitory activities of natural products because of their low toxicity and good bioavailability. Honey, a natural product has been used in folk medicine due to its antitumor, antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory properties. The aims of this study were to isolate, characterise, purify urease produced by H. pylori and investigate the inhibitory effects of solvent honey extracts on its enzymatic activity. Urease was found to be both surface-associated and cytoplasmic. Maximum cytoplasmic urease activity was found to occur after 72 hr whereas maximum extracellular urease activities were found to occur after 96 hr. Characterization of the crude cytoplasmic urease revealed optimal activity at a pH of 7.5 and temperature of 40°C. The kinetic parameters Vmax and Km were 45.32 U ml-1 and 61.11 mM respectively.The honey extracts inhibited the activity of the crude urease in a concentration dependent manner. The Lineweaver-Burk plots indicated a non-competitive type of inhibition against H. pylori urease. The two honey extracts gave promising inhibitory activities against urease of H. pylori. Thus the results of this study delineates that inhibition of urease can ease development in therapeutic and preventative approaches based on the enzymatic activity of this Helicobacter protein.

This study is interested in properties of fungal transglycosylases, specifically Phr1, Phr2 and Crh2. These enzymes are involved in the remodelling of yeast cell walls due to their cleavage of structural donor polysaccharides and transfer of their fragments to the other acceptor (poly)saccharide molecules. The mammalian cells do not contain cell walls, nor cell wall transglycosylases, that´s why these enzymes are possible targets for antifungal agents. In this diploma thesis the effect of 67 commercially available inhibitors on Phr1 and Phr2 enzymes was studied by rapid screening. In the case of the Phr1 enzyme, two inhibitors showed a potential effect which was subsequently tested by size exclusion chromatography column incorporated into HPLC device. None of the inhibitors were found to have an inhibitory effect on Phr1 or Phr2 enzymes in contrast to DMSO in which all inhibitors were dissolved. The mode of action of Phr enzymes was also studied by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. The first method allowed to monitor the formation of products only in the later stages of the reaction, but more sensitive size exclusion chromatography showed the product formation at the beginning of the reaction. Phr1 cleaved the donor substrate near the non-reducing end and forms small fragments that are transfered to labeled acceptors during the whole reaction. Phr2 utilized random action pattern, thus creating products with higher molecular weight from the beginning of reaction. The effect of the polymerization degree of acceptor on it´s affinity with the Crh2 was also studied. The Michaelis-Menten constants showed no effect of acceptor lenght on the affinity between enzyme and substrate.

Orientador: Ana Claudia Pavarina / Resumo: O fungo Candida albicans, em situações de desequilíbrio imunológico no hospedeiro, pode se tornar um patógeno oportunista e provocar infecções. Tendo em vista a resistência que os microrganismos desenvolveram a fármacos convencionais, a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) vem apresentando resultados promissores como uma terapia alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial que aPDT possuiu em desenvolver resistência, tolerância ou susceptibilidade em C. albicans em associação com o Photodithazine (PDZ- 25 µg/L; 660 nm; 18 J/cm2) e Curcumina (CUR- 40 µg/L; 455 nm; 18 J/cm2) plaqueados em meio sem e com suplementação de Fluconazol (8 µg/L). C. albicans (ATCC 90028) em culturas planctônicas e biofilme foram submetidas à aplicações sucessivas de aPDT (10 aplicações), como também, a ciclos de recuperação e re-cultivo das colônias que sobreviveram ao tratamento até o momento que não houvesse mais células viáveis para a recuperação e continuação das aplicações. O plaqueamento foi realizado em placas de Ágar Sabourand Dextrose suplementadas ou não com Fluconazol, e os valores das unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL) foram determinados. O teste de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) foi realizado nos primeiros e últimos ciclos de aPDT. O perfil biomolecular das células sobrevivetes as aplicações 1, 4 e 7 de aPDT mediada por PDZ foi investigado através do teste de RT-qPCR. Foi observado no grupo tratamento de aPDT (P+L+) mediada por P... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus Candida albicans, in situations of immune imbalance in the host, can become an opportunistic pathogen and cause infections. Because of the resistance that microorganisms have developed to conventional drugs, Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has shown promising results as an alternative therapy. The main goal of this study was to evaluate the potential of aPDT to develop resistance in C. albicans in association with Photodithazine (PDZ-25 µg/L; 660 nm; 18 J/cm2) and Curcumin (CUR-40 µg/L; 455 nm; 18 J/cm2) grown with and without Fluconazole (8 µg/L). C. albicans (ATCC 90028), in planktonic and biofilm cultures, were submitted to successive applications of aPDT (10 applications), as well as cycles of recovery and re-cultivation of colonies that survived treatment until no longer viable cells were present for application recovery and continuation. Plating was performed on Sabourand Dextrose Agar plates supplemented or not with Fluconazole, and values of colony forming units per milliliter (CFU/mL) were determined. The reactive oxygen species (ROS) production test was performed in the first and last cycles of aPDT. The biomolecular profile of surviving cells as applications 1, 4 and 7 of PDZ-mediated aPDT was investigated using the RT-qPCR test. PDZ-mediated treatment of aPDT (P+L+) was observed to reduce approximately 6.8 log10 in planktonic cultures and approximately 6.2 log10 in C. albicans biofilm in both methodologies used. In the aPDT (C+L+) treatment gr... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Resumo: A esporotricose é uma micose de distribuição mundial, decorrente da implantação traumática do fungo Sporothrix. Atualmente, é considerada uma zoonose emergente, de impactos à saúde pública, sendo os gatos os principais animais afetados e associados à transmissão aos humanos. O estudo objetivou identificar casos de esporotricose em gatos no município de São José do Rio Preto/SP, com identificação da espécie circulante, além de analisar os fatores clínicos e epidemiológicos, e de suscetibilidade aos antifúngicos. Amostras de secreções e/ou biópsias de animais com lesões e sintomas da doença foram analisadas por técnicas micológicas, fenotípicas e moleculares de identificação do fungo. O método de microdiluição em caldo foi utilizado para identificar o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos. Os aspectos clínicos e epidemiológicos foram avaliados com base em informações contidas nas fichas de investigação. No período estudado, foram coletadas 245 amostras de gatos sintomáticos à esporotricose, sendo o fungo Sporothrix isolado em 189 (77, 2%) amostras. Na análise fenotípica, para todos os isolados, foi encontrado padrão morfofisiológico compatível com a espécie S. brasiliensis, sendo esse achado confirmado por técnica molecular. Na análise de suscetibilidade aos antifúngicos, em geral, a terbinafina foi o fármaco com melhor desempenho de atividade antifúngica, seguido pelo cetoconazol e itraconazol. A população de felinos domésticos analisada era composta, em sua maioria, por ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a worldwide mycosis, resulting from the traumatic implantation of the fungus Sporothrix. It is currently considered an emerging zoonosis with public health impact, and cats are the main animals affected and associated with transmission to humans. The aim of this study was to assess the cases of feline sporotrichosis in São José do Rio Preto, Brazil, to identify the circulating species, to analyze clinical and epidemiological factors, and evaluate the susceptibility to antifungal drugs. Secretion and/or biopsies samples from animals with lesions and sporotrichosis symptoms were analyzed by mycological procedures, and the isolates were identified by phenotypic and molecular techniques. The broth microdilution method was used to identify the antifungal susceptibility profiles. Clinical and epidemiological aspects were evaluated based on information contained in the research sheets. During the studied period, 245 samples of cats symptomatics of sporotrichosis were collected, and Sporothrix was isolated in 189 (77.2%) samples. According to the phenotypic analysis, all isolates exhibited the morphophysiological pattern of S. brasiliensis, this finding was confirmed by molecular technique. Regarding the antifungal susceptibility testing, terbinafine was, in general, the antifungal which exhibited the best activity, followed by ketoconazole and itraconazole. The domestic feline population analyzed was mostly male (180; 73.5%), adults (236; 96.3%), street (131; 53.5%... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre