Os processos industriais de produção de álcool existentes no Brasil reutilizam o fermento em ciclos fermentativos consecutivos. Paralelamente, o excedente produzido pela multiplicação das células de levedura durante esse processo é seco e comercializado, principalmente no mercado externo, como ingrediente para ração animal. As práticas usualmente utilizadas nas indústrias para reduzir a contaminação bacteriana são o tratamento ácido do creme de levedura e a aplicação de antibióticos. Porém, desde que foram detectados altos níveis de resíduos de antibióticos na levedura destinada à ração animal, seu uso tem sido condenado pela comunidade internacional. Desde então as indústrias brasileiras têm buscado alternativas aos antibióticos para o controle da contaminação bacteriana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da própolis sobre as bactérias do gênero Lactobacillus fermentum e Bacillus subtillis, que são alguns dos contaminantes da fermentação alcoólica. O maior pico de produção de compostos fenólicos totais foi com uso de etanol 76% como solvente, à 58°C por 50 minutos, apresentando 68,95 mg de CFT/g de própolis e um halo de inibição de 6 e 5mm para Bacillus e Lactobacillus, respectivamente. As faixas das variáveis que maximizaram o teor alcoólico foi o processo fermentativo conduzido a 32°C, com 41 g de células de leveduras/L, em um meio contento 18,5°Brix. Apesar do antimicrobiano comercial ter apresentado maior eficiência na redução da contaminação (94,46% e 97,40% para Lactobacillus e Bacillus, respectivamente), o extrato de própolis tem potencial para ser utilizado no controle dos contaminantes bacterianos presentes nas fermentações etanólicas, sendo responsável por redução de 54,24% e 67,02% para Lactobacillus e Bacillus, respectivamente. / The industrial processes of ethanol production in Brazil reuse yeast fermentation in consecutive cycles. In parallel, the surplus produced by the multiplication of yeast cells during this process is dried and sold, mainly in foreign markets as an ingredient for animal feed. The practices commonly used in industry to reduce bacterial contamination are the acid treatment of the yeast cream and the application of antibiotics. However, since they were detected high levels of antibiotic residues in yeast destined for animal feed, its use has been condemned by the international community. Since then Brazilian industries have sought alternatives to antibiotics to control bacterial contamination. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of the extract of propolis on bacteria of the genus Lactobacillus and Bacillus, which are some of the contaminants of fermentation. The highest peak production of phenolic compounds was using 76% ethanol as solvent at 58°C for 50 minutes, with 68,95 mg of CFT/g of propolis and a halo of inhibition of 6 and 5mm for Bacillus and Lactobacillus, respectively. The ranges of variables that maximized the alcoholic fermentation was conducted at 32°C with 41g of yeast cells/L in media containing a 18,5°Brix. Despite having larger commercial antimicrobial effectiveness in reducing contamination (94,46% and 97,40% for Lactobacillus and Bacillus, respectively), the extract of propolis has potential to be used in the control of bacterial contaminants present in the ethanolic fermentation, and responsible for reduction of 54,24% and 67,02% for Lactobacillus and Bacillus, respectively.

O aumento na incidência de infecções fúngicas e a alta toxicidade ou elevado índice de resistência associado aos antimicóticos comerciais, criou um mercado carente de novas drogas. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) surgem como uma alternativa promissora ou fonte de conhecimento por desempenhar ação inibidora de crescimento e/ ou letal contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas e/ ou vírus, além de atividade antitumoral e efeito imunomodulador. Como os mecanismos pelos quais eles o fazem são diferentes daqueles das drogas não peptídicas, os AMPs estão pouco associados ao desenvolvimento de resistência microbiana. A hemoglobina (Hb) é uma fonte de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 (Hb33-61) da cadeia α da Hb bovina foi o primeiro AMP descrito a ser gerado in vivo no trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus. Nossos estudos posteriores usando CD e H1-RMN revelaram que a amidação C-terminal deste fragmento o tornava ainda mais ativo que o primeiro e que em presença de micelas de SDS o Hb33-61a apresenta uma dobra β na porção N-terminal (Lys40-Phe43) e outra (Ser49- Ser52) seguida de α-hélice no C-terminal (Ala53-Ala60), bem como um segmento Pro44-Leu48 capaz de mover-se independentemente e agir como uma dobradiça. Nossas investigações usando análogos sintéticos truncados do Hb33-61a mostraram que o Hb40-61a poderia ser sua porção mínima ativa por apresentar comportamento conformacional idêntico. Nossos estudos subsequentes enfocando as suas propriedades evidenciaram a sua capacidade de causar morte rápida de cepas de Candida, incluindo C. albicans resistentes ao fluconazol e extravasamento de conteúdo e formação de poros em LUVs, revelando sua ação permeabilizante de membrana. Em continuidade ao estudo do Hb40-61a, investigamos no presente trabalho as suas propriedades e o seu mecanismo de ação contra C. albicans. Para isso, sintetizamos, purificamos e caracterizamos esta hemocidina, o seu análogo inteiro composto por D aminoácidos (ent-Hb40-61a) e o seu análogo marcado com 5 (6) carboxifluoresceína (FAM-Hb40-61a). Ensaios com eritrócitos humanos confirmaram a baixa atividade hemolítica desses AMPs em meio de alta e baixa força iônica. O análogo ent-Hb40-61a apresentou a mesma atividade antifúngica que o análogo L, evidenciando um mecanismo de ação não-estereoespecífico. Análises de células de Candida tratadas com FAM-Hb40-61a por microscopia confocal mostraram que em ½ MIC e MIC o peptídeo deposita-se na membrana plasmática e é internalizado, respectivamente. Citometria de fluxo demonstrou que na MIC cerca de 97% das células encontram-se marcadas pelo peptídeo, confirmou a influência negativa da alta força iônica em sua atividade, mostrou que a internalização celular na MIC é independente da temperatura e que a alteração no metabolismo energético da célula afeta de maneira negativa a internalização do peptídeo. Ensaios de permeabilidade celular com Syto 09 e iodeto de propídeo confirmaram danos progressivos à membrana plasmática de C. albicans com o aumento da concentração do Hb40-61a. Experimentos usando DiBAC4(5) e de DPH revelaram que o Hb40-61a altera o potencial de membrana e afeta sua fluidez, respectivamente. Imagens preliminares das células tratadas e não tratadas com Hb40-61a por microscopia de força atômica (AFM) sugeriram alterações nas células de C. albicans após tratamento com a hemocidina. Medidas preliminares do diâmetro médio das células de C. albicans revelaram que elas diminuem após o tratamento com o peptídeo, o que pode ser mais um indício de dano à membrana plasmática por formação de poros e extravasamento de conteúdo intracelular. Assim, obtivemos fortes indícios de que o alvo do Hb40-61a é, de fato, a membrana plasmática das células de Candida, de que ele apresenta potencial de uso tópico para tratamento de candidíase e pode servir como modelo para o desenho de novas drogas antimicrobianas, peptídicas ou não, com propriedades ainda mais valiosas e índices terapêuticos mais elevados. Testes preliminares mostraram que é possível a adsorção do Hb40-58a à nanopartículas de PSS e que, em relação ao peptídeo livre, este arranjo mantém a atividade antifúngica com MIC superior e apresenta menor atividade hemolítica. / The increased incidence of fungal infections and the high toxicity or high level of resistance associated with conventional antimycotics created a demand for new drugs. Antimicrobial peptides (AMPs) constitute a promising alternative and/or an important source of knowledge due to their growth inhibitory action and/or lethality against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, parasites and/or viruses. Besides, AMPs display antitumoral and immunomodulator effects. As their mechanisms of action are different from those of non-peptide drugs, AMPs are less associated with the development of antimicrobial resistance. Hemoglobin (Hb) is a source of peptides with diverse biological functions. The fragment 33-61 (Hb33-61) of bovine Hb α chain was the first AMP reported to be generated in vivo in gastrointestinal tract of Boophilus microplus. Our studies of Hb33-61 using CD and H1-NMR showed that amidation of its C-terminal (Hb33-61a) increases its activity; in the presence of SDS micelles, Hb33-61a is characterized by a central hinge joining the C-terminal region (containing a β turn followed by a helical element) to the N-terminal region (that presents only a β turn). Our previous investigations using synthetic truncated analogues of Hb33-61a suggested that Hb40-61a could be its minimal active portion as it presented equal biological and structural properties. Our subsequent studies focusing on its properties showed its ability to quickly kill Candida albicans strains (including those resistant to fluconazole) and to cause leakage of the contents of LUVs and pore formation in GUVs, revealing its membrane permeabilizing action. We further investigated the properties of Hb40-61a and its possible mechanism of action against C. albicans. To do it, we synthesized, purified and chemically characterized it, its all-D analogue (ent-Hb40-61a) and its analogue labeled with 5 (6) carboxyfluorescein (FAM-Hb40-61a). Tests using human erythrocytes confirmed the low toxicity of these hemocidins at high or low ionic strength. The ent-analogue was as active as the all-L compound suggesting a non stereospecific mechanism of action. Confocal microscopy analysis of Candida cells treated with FAM-Hb40-61a showed that at ½ MIC and MIC, the peptide deposits on the plasma membrane and is internalized, respectively. Flow cytometry results showed that at the MIC about 97% of the cells are marked by the peptide, confirmed the negative influence of high ionic strength on its antifungal activity and showed that the cellular internalization at the MIC is partially dependent on ATP, but independent on the temperature. Cell permeabilization assays using Syto 09 and propidium iodide confirmed progressive damage of the membrane as a function of Hb40-61a concentration. Experiments employing DiBAC4 (5) and DPH revealed that the Hb40- 61a alters the membrane potential and affects its fluidity, respectively. Preliminary atomic force microscopy (AFM) images of C. albicans cells before and after treatment with Hb40-61a suggested morphological changes in the plasma membrane. Preliminary measurements of the average diameters of the fungal cells indicated size reduction after treatment with the Hb40-61a probably resulting from pore formation and leakage of cell contents. Thus, we obtained strong evidences that the target of this peptide is indeed the plasma membrane of Candida cells. Thus, this hemocidin have the potential to be used topically for treating candidiasis and/or serve as model for the design of new antimicrobial drugs, peptide or non-peptide, with even more valuable properties and improved therapeutic indexes. Preliminary tests confirmed the possibility of adsorbing Hb40-58a to nanoparticles of polystyrene sulfate (PSS) and that resulting assembly is still active and less hemolytic than the free peptide.

Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico psicrotrófico e consequentemente de grande importância para alimentos conservados em refrigeração. Vários estudos têm demonstrado que é possível utilizar antimicrobianos naturais, como bacteriocinas e compostos fenólicos, para retardar a multiplicação desse patógeno em produtos cárneos refrigerados. Entretanto, sabe-se que a atividade antimicrobiana desses compostos pode ser influenciada pelos componentes da matriz alimentar. Esse trabalho de mestrado pretendeu avaliar a influência dos ingredientes de lingüiça frescal de suíno na ação inibitória de óleo essencial de orégano (OEO) e nisina sobre Listeria monocytogenes. Foram realizados testes com diferentes modelos alimentares preparados com carne suína moída adicionada de cada um dos ingredientes utilizados na fabricação de lingüiça frescal (sais de cura, açúcar, antioxidante, emulsificante, condimentos e NaCl) separadamente, comparando-se os resultados com os obtidos no modelo contendo todos os ingredientes simultaneamente. Pretendeu-se também avaliar a interferência do tempo de contato da nisina e óleo essencial de orégano com os diferentes modelos alimentares na ação antimicrobiana sobre L. monocytogenes. Os resultados indicaram que os antimicrobianos foram capazes de inibir a multiplicação de L. monocytogenes em todos os modelos analisados armazenados à 5ºC por até 72h. Comparando-se todos os modelos compostos por carne adicionada de apenas um dos ingredientes, a maior atividade antilisterial foi observada no modelo composto de carne com antioxidante. Entretanto, essa atividade inibitória foi menor do que a obtida no modelo contendo todos os ingredientes em conjunto. Quanto à influência do tempo prévio de contato entre os antimicrobianos e os modelos estudados na ação antilisterial, observou-se que na formulação com todos os ingredientes a ação foi mais intensa quando o contato foi de 2h. Entretanto, neste modelo o efeito mais duradouro foi obtido com 12h de contato prévio. Nos demais modelos, o maior efeito foi obtido no tempo zero. Os resultados permitem concluir que cada um dos ingredientes da formulação da lingüiça contribui com uma parcela na ação antilisterial do OEO e nisina nesse produto, e que essa ação é influenciada pelo tempo de contato prévio entre os modelos e os agentes antimicrobianos. / Listeria monocytogenes is psychrotrophic pathogen and, consequently, very important for cold-preserved foods. Many studies have demonstrated that natural antimicrobials such as bacteriocins and phenolic compounds can be used to inhibit the growth of this pathogen in refrigerated meat products. However, it is known that the antimicrobial activity of these antimicrobials may be influenced by components of the food matrix. The aim of the present study was to evaluate the influence of the ingredients of \"lingüiça\" in the inhibitory activity of O.E.O. and nisin against L. monocytogenes. The study was carried out with different food models prepared with minced raw pork meat added separately of each ingredient used for manufacturing \"lingüiça\" (curing salts, sugar, antioxidants, emulsifiers, condiments and NaCl), and results were compared to those obtained in a model containing all ingredients simultaneously. The study also aimed to evaluate the interference of the contact time between the food models and the antimicrobials on the effect against L. monocytogenes. Results indicated that the antimicrobials added to the models were able to inhibit the growth of the pathogen at 5ºC up to 72h. Comparing the models, the highest antilisterial activity was observed in the model containing pork meat and antioxidants. However, this inhibitory activity was lower than that observed in the model with all ingredients. What concerns the influence of contact time in antilisterial activity, we observed that in the model containing all ingredients the antilisterial activity was more intense after 2h of contact, but the more lasting effect was observed after 12h of contact. In the other models, the most intense effect was noted in time zero. The conclusions of the study are that each ingredient used in manufacture of \"lingüiça\" has its share in the antilisterial activity of nisin and OEO in this product and that this activity is influenced by the contact time between the food matrix and the antimicrobials.

A identificação de intermediários formados durante os processos de tratamentos de efluentes tem se tornado alvo de estudos. Entretanto, uma das questões mais importantes nos estudos de intermediários formados durante a fotólise ou degradação de fármacos por processos oxidativos avançados publicados atualmente é a concentração inicial utilizada. Altas concentrações dificultam a compreensão da real situação que ocorre na natureza, onde esses compostos são encontrados em baixas concentrações. Dentro deste contexto, o presente estudo, avaliou a pré-concentração de intermediários formados durante a fotólise em solução aquosa e em esgoto sintético da sulfametazina (SMZ), do ciprofloxacino (CIP) e do enrofloxacino (ENR) em diferentes concentrações (25 mg L-1 e 250 μg L-1 para SMZ; 10 mg L-1 e 100 μg L-1 para CIP e ENR) utilizando espectromatria de massas sequencial de alta resolução (Q-ToF e LIT-Orbitrap MS). Foram identificados oito intermediários da fotodegradação da SMZ, dentre estes os de m/z nominal 140 e 229 ainda não relatados na literatura. A metodologia desenvolvida para a SMZ foi aplicada a análises de produtos de transformação vindos de reator anaeróbio. As análises da biodegradação da SMZ permitiram a identificação de três produtos de transformação. O m/z 295 foi comum aos dois processos, fotólise e biodegradação. O m/z 227 foi descrito pela primeira vez como produto de biodegradação anaeróbia da SMZ. Tanto para o CIP quanto para o ENR foram identificados 10 intermediários, apesar da similaridade entre os dois fármacos, apenas um produto de degradação foi comum aos dois, o m/z 346, além do próprio CIP que é intermediário do ENR. Dentre as fases extratoras avaliadas, a Oasis HLB se mostrou mais eficiente na recuperação dos intermediários. A pré-concentração de intermediários formados durante a fotodegradação dos antimicrobianos estudados permitiu a avaliação da degradação destes em concentrações menores do que aquelas atingidas pelos trabalhos já publicados que abordaram rotas de degradação. Os perfis de degradação em diferentes concentrações e em diferentes matrizes apresentam indícios de serem diferente, tanto no perfil quanto na composição proporcional entre os produtos formados. Esses resultados são promissores, visto que permitem uma aproximação às concentrações ambientalmente relevantes. / Identification of intermediate products formed during effluent treatment has become the focus of some studies. However, one of the most important issues during the photolysis of drugs or degradation by advanced oxidation processes is the high and invariable initial concentration of the treated drug. High concentrations, used in currently publications, potentially hinder the understanding of the real situation that occurs in nature, where low concentrations of these drugs are usually found. Here we focused in the identification of the degradation products of sulfamethazine (SMZ), ciprofloxacin (CIP) and enrofloxacin (ENR) obtained by photolysis in aqueous and synthetic wastewater medium. Solid-phase pre-concentration and chromatographic separation of the products obtained during the degradation process at different concentrations (25 mg L-1 and 250 μg L-1 for SMZ ; 10 mg L-1 and 100 μg L-1 for CIP and ENR) was developed in association with high-resolution tandem mass spectrometry (Q-ToF and LIT-Orbitrap MS). Eight photodegradation products of SMZ, among them those of nominal m/z 140 and 229 not reported yet in the literature, were identified. The methodology developed for SMZ was applied to transformation products analysis coming from anaerobic reactor. The biodegradation analysis of SMZ allowed the identification of three transformation products. The m/z 295 was common to processes, photolysis and biodegradation. The m/z 227 was first described as a product of anaerobic biodegradation of SMZ. Both for the CIP as well as for the ENR, ten intermediates have been identified, despite the similarity between the two drugs, only one degradation product is common to both, the one with nominal m/z 346, besides the CIP itself which is an intermediate of ENR. Among the evaluated extracting phases, the Oasis HLB was more efficient in recovering the intermediaries. The pre-concentration of intermediates formed during the photochemical degradation of antimicrobials allowed the evaluation of the degradation at lower concentration than the previously published papers that addressed routes for degradation. The degradation profile at different concentrations and matrices showed evidences of being different, both profile and regarding proportional composition of the products formed. These results are promising, as they provide an approach for application at environmentally relevant concentrations.

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2014-09-25T18:14:21Z No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014JohanPrediger.pdf: 1412383 bytes, checksum: 351464f422d7e0f60807a802dec5db00 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2014-10-06T14:14:36Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014JohanPrediger.pdf: 1412383 bytes, checksum: 351464f422d7e0f60807a802dec5db00 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-06T14:14:36Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_text: 22302 bytes, checksum: 1e0094e9d8adcf16b18effef4ce7ed83 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) 2014JohanPrediger.pdf: 1412383 bytes, checksum: 351464f422d7e0f60807a802dec5db00 (MD5) / Doenças infecciosas são uma das principais causas de morbidade no mundo inteiro, sendo que o uso indiscriminado de antibióticos favorece o desenvolvimento de mecanismos de resistência bacteriana, dificultando o combate às infecções. O número de pacientes infectados por microrganismos resistentes vem aumentando consideravelmente e por isso tem chamado atenção dos serviços de saúde. A presente pesquisa teve como objetivo de verificar a infecção bacteriana e sua resistência aos antibióticos, além da presença de genes produtores de beta-lactamases em um hospital do interior do Rio Grande do Sul. Realizou-se a análise retrospectiva das infecções por bactérias multirresistentes durante o período de janeiro de 2011 a junho de 2012. O isolamento e a identificação das bactérias foram realizados por laboratório terceirizado, e para a avaliação de suscetibilidade aos antimicrobianos foi utilizado o método de difusão de disco, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A análise retrospectiva de 374 amostras mostrou que diferentes bactérias apresentaram resistência a um grande número de antibióticos. Dentre as mais prevalentes no estudo e que também apresentaram maior percentual de resistência estavam: Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli e Pseudomonas spp. Foram coletadas 62 amostras para análise pelo método de triagem para detecção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), por aproximação de discos, onde 45% foram classificadas com produtoras de ESBL. A caracterização molecular feita nestes mesmos isolados, realizada pela técnica de Reação em cadeia da polimerase (PCR) identificou o gene TEM em 70,96% dos isolados, o gene SHV em 56,45% e, o gene CTX-M em 91,93%, dos quais 24,19% confirmaram a presença de gene pertencente ao grupo CTX-M1, 14,51% ao grupo CTX-M2 e 22,58% ao grupo CTX-M9. Com o presente estudo conclui-se que os genes CTX-M e TEM foram os mais prevalentes entre os genes dos isolados avaliados. Além disso, também se observa a presença de outros genes produtores de ESBL nas amostras analisadas fato que pode estar relacionado ao alto nível de resistência a antimicrobianos das bactérias estudadas.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:23Z No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 / Currently, various bacteria can be harmful to human health. Moreover, with continued use of antibiotics and development of resistance by these microorganisms, many infections became worrying, with no effective treatments available generating the need for development of other fighting molecules. In this context, the antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as an alternative in the control of infections caused by resistant microorganisms. Despite the variation in sequence levels, AMPs may present high structural conservation in specific families, especially peptides stabilized by disulfide bonds. Canonically, the identification of PAMs is by exploitation of bioactive natural extracts and subsequent analysis and purification thereof. In the post genomics era, in turn, identifying PAMs could be made from databases using molecular modeling of peptides in direct search. In this work were selected AMPs without structure in PDB, from antimicrobial peptide database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). The sequences were pre-filtered, being selected two AMPs (myticin B and MiAMP-2b) of classes described with modifications in disulfide bonds pattern arrangement. Additionally, the original bank was submitted to STPs identification. PredSTP was used as an additional evaluation. After prefiltering phases, a new potential STP (CRS4C-2b) with a new hypothetical structural topology was modelled by QUARK and simulated at 300 ns molecular dynamics, maintaining the initial structure. The methodology was then applied to identify PAMs in the Zantedeschia aethiopica transcriptome where two new potential PAMs were found that were predicted to be active by CAMP. Thus, the two methodologies developed here can be successfully applied in the identification of new PAMs and in the analysis of the structural diversity of antimicrobial families. / Atualmente, v??rias bact??rias podem ser prejudiciais ?? sa??de humana. Al??m disso, com o uso cont??nuo de antibi??ticos, e desenvolvimento de resist??ncia por parte desses microrganismos, muitas infec????es se tornaram preocupantes, sem tratamentos eficazes dispon??veis gerando a necessidade de desenvolvimento de outras mol??culas de combate. Nesse ??mbito, os pept??deos antimicrobianos (PAMs) t??m sido propostos como uma alternativa no controle de infec????es causadas por microrganismos resistentes. Apesar da variabilidade nas sequ??ncias, os PAMs podem apresentar grande conserva????o estrutural em fam??lias espec??ficas, principalmente em pept??deos estabilizados por pontes dissulfeto. De forma can??nica, a identifica????o de PAMs se d?? pela explora????o de extratos naturais bioativos e posterior an??lise e purifica????o dos mesmos. Na era p??s-gen??mica, por sua vez, a identifica????o de PAMs pode ser feita a partir de bancos de dados utilizando modelagem molecular na busca direta de pept??deos. Nesse trabalho foram selecionados PAMs sem estrutura no PDB, a partir do banco de dados de pept??deos antimicrobianos (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Desta forma, as sequ??ncias foram pr??-filtradas, sendo selecionados dois PAMs (miticina B e MiAMP-2b) de classes descritas com varia????o na disposi????o ou padr??o de pontes dissulfeto. Al??m disso, o banco original foi submetido ?? identifica????o de STPs. Para tal, o servidor PredSTP foi utilizado como avalia????o adicional. Ao final das etapas de pr??-filtragem, um novo potencial STP (CRS4C-2b) com uma nova topologia estrutural foi modelado pelo QUARK e simulado em din??mica molecular, mantendo a estrutura inicial. A metodologia foi ent??o aplicada para identifica????o de PAMs no transcriptoma de Zantedeschia aethiopica onde foram encontrados dois novos potenciais PAMs que foram preditos como ativos pelo CAMP. Dessa forma, as duas metodologias desenvolvidas aqui podem ser aplicadas com sucesso na identifica????o de novos PAMs e na an??lise de diversidade estrutural de fam??lias antimicrobianas.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-08T13:12:56Z No. of bitstreams: 1 AmandaCarolineMarquesSa??deTese2016.pdf: 1482640 bytes, checksum: 98c7088a3903d189fcf2c6a44b4fcdc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-09T11:04:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AmandaCarolineMarquesSa??deTese2016.pdf: 1482640 bytes, checksum: 98c7088a3903d189fcf2c6a44b4fcdc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T11:04:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AmandaCarolineMarquesSa??deTese2016.pdf: 1482640 bytes, checksum: 98c7088a3903d189fcf2c6a44b4fcdc7 (MD5) Previous issue date: 2016-11-01 / Bacteria are becoming resistant to a growing number of conventional antibiotics at a worrisome rate. Therefore, there is an increasing demand for new antimicrobial therapeutics. Antimicrobial peptides (AMPs) are one of promising alternatives for conventional antibiotics and are thought to be less likely to induce resistance. AMPs have been coupled to molecular scaffolds for biomedical applications such as hydrogels for wound dressings and covering implants. Here AMPs were chemically conjugated to the CR4 hydrophilic polymers. The CPF_C1 is a short peptide isolated from Xenopus clivii, the original sequence was modified one called LCPF_C1, aiming to create some distance between the first glycine and the azide added on the N terminus (on the coupled sequence). The conjugation between the AMP and the CR4 polymer used a click chemistry reaction with two steps, dependent of a hetero crosslinker (DBCO???PEG4???NHS Ester). Dynamic light scattering (DLS) and fluorimeter assays were used to evaluate the efficiency of coupling. MALDI-ToF analysis showed 3 molecules of LCPF_C1 peptide for each CR4 polymer. Moreover, microrheology showed changes on hybrids increasing the viscosity. Finally, the compounds were evaluate against four different bacteria: Staphylococcus aureus, Klebsiela pneumoneae carbapenemases (Kpc), Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. It was possible to observe MIC???s against P. aeruginosa of 11 mM by using the peptide (LCPF_C1) and 55 mM for the original sequence. When the hibrids were compared to the free polymer was not found MIC values against K. pneumoneae (CR-Kp). On the other hand, the hibrids showed three times less activity than the free polymer against P. aeruginosa. No MIC values were found aganst S. aureus. Finally, against E. coli was observed a MIC value of 1000 mM for the free CR4 and 250 mM for the hibrids. On this way, the present work showed the possibility to functionalize biopolymers by using bioactive molecules coupled to biopolimers, changing the physical-chemical characteristics and increasing they applicability against bacterial infections. / Uma taxa alarmante de bact??rias tem se tornado resistente a um grande n??mero de antimicrobianos convencionais. Desta forma, a demanda por novas terapias antimicrobianas tem aumentado proporcionalmente. Assim, o uso de pept??deos antimicrobianos (PAMs) consistem em uma promissora alternativa para antibacterianos convencionais, particularmente podendo ser acoplado a estruturas moleculares para aplica????es biom??dicas, como hidrog??is para curativos e cobertura de implantes. No presente trabalho, PAMs foram quimicamente conjugados ao pol??mero hidrof??lico inspirado nas prote??nas naturais col??geno e seda CR4. O pept??deo CPF_C1 consiste em um pept??deo contendo 17 res??duos de amino??cidos isolado de Xenopus clivii, com atividade comparada ?? bact??rias Gram-negativas e -positivas. Para este estudo, a sequ??ncia original do CPF-C1 foi modificada e intitulada LCPF_C1, objetivando aumentar a dist??ncia entre a primeira glicina e a azida adicionada na por????o N-terminal. A conjuga????o entre o PAM e o pol??mero CR4 foi realizada por meio de click chemistry reaction em dois passos, dependentes do hetero crosslinker (DBCO???PEG4???NHS Ester). Ensaios de espalhamento de luz din??mico (DLS) e fluorimetria foram utilizados para avaliar a efici??ncia de acoplamento e demonstraram a presen??a do pept??deo acoplado ao pol??mero. An??lises de MALDI-ToF demonstraram 3 mol??culas do pept??deo LCPF-C1 para cada mol??cula do pol??mero CR4. Al??m disso, dados de microrreologia demonstraram mudan??as nos h??bridos como aumento de viscosidade. Finalmente, os compostos foram avaliados contra quatro bact??rias diferentes: Staphylococcus aureus, K. pneumoneae carbapenemase (Kpc), Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Foi poss??vel observar para P. aeruginosa MICs de 11 mM utilizando o pept??deo (LCPF_C1) e 55 mM para a sequ??ncia original. Quando comparados aos h??bridos em rela????o a atividade do pol??mero livre n??o foi encontrado valor de MIC contra K. pneumoneae (CR-Kp). Por outro lado, os h??bridos demonstraram um MIC cerca de tr??s vezes menor que o pol??mero livre contra P. aeruginosa. Nenhum valor de MIC foi encontrado contra S. aureus. Finalmente, contra E. coli observou-se MIC de 1000 mM para o pol??mero CR4 e 250 mM para os h??bridos. Desta forma o presente trabalho demonstrou a possibilidade de funcionalizar biopol??meros por meio do acoplamento de mol??culas bioativas, alterando suas caracter??sticas f??sico-qu??micas e aumentando sua aplicabilidade contra infec????es bacterianas.

Curativos utilizados no tratamento de feridas crônicas e queimaduras devem apresentar carac terísticas antimicrobianas. Sabe-se que compostos de prata são utilizados há muito tempo como antissépticos, mas apresentam alguns problemas relacionados ao modo de liberação. A fim de controlar essa liberação, os íons Ag+ podem ser imobilizados em suportes, como por exemplo, zeólitas, que por sua vez devem estar dispersas no filme que é utilizado como curativo. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento e a caracterização de filmes à base de gelatina, adicionados de zeólita clinoptilolita impregnada com íons prata e a avaliação das propriedades antimicrobianas, visando à aplicação no tratamento de ferimentos. Filmes com 5,7 e 10% (m/v) de gelatina e 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (v/v) de glicerol foram produzidos e caracterizados quanto à espessura, teor de umidade, capacidade de absorção de água (CAA), caráter hidrofílico, propriedades mecânicas, permeabilidade ao vapor de água (PVA), fluxo de permeação de vapor de água (FPVA), morfologia por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Com base nas características determinadas, foi possível selecionar três formulações para incorporação das zeólitas (10% de gelatina e 15, 20 e 25 % de glicerol). A zeólita comercial clinoptilolita foi caracterizada e impregnada com íons Ag+. Na sequência, por meio de um ensaio antimicrobiano preliminar, foi definido que as zeólitas seriam adicionadas aos filmes nas concentrações de 0,5; 1 e 2 % (m/v). Os filmes à base de gelatina com zeólitas foram caracterizados pelos mesmos ensaios citados e também por análise tennogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e quantiticação de íons prata por espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS). Através da avaliação antimicrobiana qualitativa, percebeu-se que a ação antimicrobiana é decorrente da presença dos íons Ag+, porém não foram identificadas diferenças expressivas entre o tamanho dos halos de inibição formados para as diferentes concentrações de clinoptilolita-Ag. Através do ensaio microbiológico quantitativo verificou-se que não havia carga bacteriana na solução onde o filme estava imerso. Os resultados obtidos mostram que os filmes desenvolvidos neste estudo têm potencial para serem aplicados como curativos, atuando como antimicrobiano, auxiliando, desta forma, na cicatrização dos ferimentos. / Dressings used in treatment of bums and chronic wound must present antimicrobial characteristics. It is known that silver compounels are used for long time as antiseptics, but they have some problems related to release mode. To control this release, Ag+ ions may be immobilized in supports, as zeolites, that must be disperseel in the film used as wound dressing. In this sense, this work objectives the development and characterization of gelatin based-films added of clinoptilolite zeolite impregnated with silver ions and antimicrobial properties evaluation, aiming the application in wound treatment, as burns, for example. Films with 5,7 anel 10% (w/v) of gelatin anel 0, 5, 10, 15, 20 anel 25 % (v/v) of glycerol were produced and characterized by the thickness, moisture content, water absorption capacity (CAA), hydrophilic character, mechanical properties, water vapor permeation (PVA), water vapor permeation flux (FPVA), morphology by scanning electron microscopy (MEV) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Based on the determined characteristics, it was possible select three formulations for zeolites incorporation (10% of gelatin and 15, 20 and 25 % of glycerol). Commercial clinoptilolite zeolite was characterized and impregnated with Ag+ ions. Subsequently, by a preliminary antimicrobial assay, it was defined that the zeolites would be added to the films in the concentrations of 0.5, 1 and 2 % (w/v). Gelatin based films with zeolites were characterizeel by the same assays cited and, also, thermogravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC) and silver ions quantification by flame atomic absorption spectroscopy (FAAS). Characterization tests demonstrated that the zeolite concentration of 0.5% resulted in films with properties more suitable for wound dressing application. By the qualitative antimicrobial evaluation, it was noticed that the antimicrobial action is due to the Ag+ ions, but no significant differences between the size of the inhibition halos formed were observed for the different concentrations of clinoptilolite-Ag. By the quantitative antimicrobial evaluation, it was found that there was no bacterial load in the solution where the film was submerged. The results show that the films developed in this stuely have potential to be applied as wound dressings, acting as an antimicrobial, thus helping the wound healing.

O jacaré-de-papo (Caiman latirostris) é considerado um crocodiliano de médio porte que apresenta uma ampla distribuição latitudinal na América do Sul. Possivelmente a espécie possui a situação mais complexa entre os crocodilianos brasileiros quanto ao aspecto da conservação, basicamente porque suas populações encontram-se fragmentadas em grande parte de sua área de distribuição original e por utilizarem áreas com fortes atividades antrópicas. Embora a espécie possua aparentemente um processo adaptativo frente a estas pressões, um aspecto fisiológico pode ainda sofrer rápida alteração quando submetido a elas: o estado sanitário. Desta maneira, este estudo objetivou determinar o estado sanitário do maior predador aquático, utilizando duas áreas distintas no Estado de São Paulo, através da determinação dos perfis hematológicos e bioquímicos do sangue, além da caracterização da microbiota oral, servindo de modelo à conservação da espécie em ambientes alterados. No primeiro capítulo foram determinados o perfil hematológico e bioquímico do sangue utilizando-se 29 indivíduos (19 machos e 10 fêmeas) capturados em Angatuba e 11 indivíduos (2 machos, 4 fêmeas e 5 filhotes) capturados em Cubatão. Diferenças estatísticas significativas foram encontradas nos valores de creatinina na comparação entre fêmeas de ambas as áreas de estudo (p = 0,033) e nos valores de alanina aminotransferase (p = 0,003), hemácias (p = 0,034), hemoglobina (p = 0,049) e volume corpuscular médio (p = 0,027) quando da comparação entre sexos. No segundo capítulo determinou-se a microbiota oral destes animais através do isolamento, identificação e caracterização bacteriana, em conjunto com o teste de perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Foram determinados 14 diferentes tipos de bactérias na área de Angatuba, sendo uma classificada como baciliforme aeróbio Gram-positivo, uma como bacilo Gram-negativo e 12 classificadas como Enterobactérias Gram-negativas. Na área de Cubatão foram isolados cinco tipos de bactérias, sendo quatro classificadas como Enterobactérias Gram-negativas e uma como baciliforme aeróbio Gram-positivo. Considerando que o uso de antimicrobianos é um processo primário no tratamento de animais e pessoas, principalmente nos casos que envolvam infecções provocadas pela interação homem x animais, para ambas as áreas de estudo, as quinolonas Enrofloxacina e Norfloxacina, além do aminoglicosídeo Gentamicina, foram os antimicrobianos que apresentaram os menores índices de resistência frente aos isolados testados. / The broad-snouted caiman (Caiman latirostris) is considered a medium-sized crocodilian, which has a wide latitudinal distribution in South America. The species may possibly have a more complex situation among Brazilian crocodilians on the aspect of conservation, basically, because their populations are fragmented in much of their original range, forcing these animals to disperse through areas with strong human activities. Although the species apparently went through an adaptive process against these pressures, a physiological aspect may undergo rapid change when subjected to them: the health status. Thus, this study aimed to determine the health status of the largest aquatic predator, using two distinct areas in São Paulo State, through the determination of hematological and biochemical profiles of blood, in addition to the characterization of oral microbiota, serving as a model for conservation of the species in anthropic habitats. In the first chapter were determined the hematological and biochemical blood profiles of 29 individuals (19 males and 10 females) captured in Angatuba and 11 individuals (2 males, 4 females and 5 hatchlings) captured in Cubatão. Statistically significant differences were found in creatinine values when comparing females of both areas of the study (p = 0.033) and in alanine aminotransferase values (p = 0.003), erythrocytes (p = 0.034), hemoglobin (p = 0.049) and mean corpuscular volume (p = 0.027) when comparing genders. In the second chapter the oral microbiota of these animals was determined by isolation, identification and characterization of the bacteria, besides the antimicrobial susceptibility profile compared to the isolates tested. The results showed growth of 14 different species of bacteria in the Angatuba area, one classified as Aerobic Grampositive Bacilliform, one as Gram-negative Bacilli and 12 classified as Gram-negative Enterobacteria. In the Cubatão area five species of bacteria were isolated, four classified as Gram-negative Enterobacteria and one as Aerobic Gram-positive Bacilliform. Considering that the use of antimicrobials is a primary process in the treatment of animals and people, especially in cases involving infections caused by human x animal interaction for both study areas, quinolones Enrofloxacin and Norfloxacin, and the aminoglycosides Gentamicin were the antimicrobials that had the lowest resistance rates against the tested isolates.

Dentre as afecções que acometem as articulações dos equinos, a artrite séptica e a mais grave observada. A técnica da perfusão regional e um método comprovadamente eficiente para o tratamento de equinos acometidos por infecções sinoviais. O dimetilsulfóxido (DMSO) é um líquido orgânico, que possui a capacidade de penetrar, com extrema facilidade, em órgãos, tecidos e membranas celulares e intracelulares. Neste estudo, objetivou-se avaliar a concentração intra-articular da gentamicina administrada por perfusão regional intravenosa (PRI), associada ou não ao DMSO, bem como avaliar a influência do volume total perfundido o período de tempo onde a concentração inibitória mínima (CIM) foi mais eficiente e se a associação com o DMSO aumentou a CIM no líquido sinovial. Os animais foram distribuídos em quatro grupos experimentais, cada grupo recebeu gentamicina 6,6 mg/kg por PRI, o volume a ser administrado, após o cálculo da quantidade de gentamicina acrescida ou não de DMSO, era completado com solução de ringer com lactato estéril até o volume de 60mL nos grupos G60 e GD60, e até 250mL para os grupos G250 e GD250. As colheitas de líquido sinovial foram realizadas antes do início do experimento (T0), imediatamente depois da retirada do torniquete (T1) e após 4 (T2), 8 (T3), 12 (T4), 16 (T5) e 24 (T6) horas. O método para doseamento das concentrações de gentamicina empregado foi o de difusão em ágar. Destacamos que as concentrações de gentamicina no líquido sinovial na dose de 6.6.mg/Kg podem ser consideradas como adequadas, num período de até 24 horas após a administração. Nossos resultados apontam que o volume de 60 mL, pode ser considerado como o volume ideal de perfusão, bem como a associação do DMSO aumentou as concentrações de gentamicina (µg/mL) na articulação dos equinos e possivelmente reduziu a formação de edemas e aumentos de volume locais. / Among the diseases that affect the joints of horses, septic arthritis is the most serious observed. The regional perfusion technique is a well proven method for the treatment of horses affected by synovial infections. Dimethylsulfoxide (DMSO) is an organic liquid that has the ability to penetrate, with extreme ease on organs, tissues and cellular and intracellular membranes. This study aimed to evaluate the intra-articular concentration of gentamicin administered by intravenous regional perfusion (PRI), associated or not with DMSO, and assess the influence of the total volume infused the time period in which the minimum inhibitory concentration (MIC) It was more efficient and the association with DMSO increased the CIM in the synovial fluid. The animals were divided into four groups, each group received 6.6 mg gentamicin / kg per PRI, the volume to be administered, after calculating the amount of gentamicin plus or absence of DMSO was completed with Ringer\'s lactate solution with sterile until the volume in 60mL groups G60 and GD60, and up to 250 mL and G250 GD250 groups. The synovial fluid samples were collected before the start of the experiment (T0), immediately after removal of the tourniquet (T1) and after 4 (T2), 8 (T3), 12 (T4), 16 (T5) and 24 (T6) hours. The method for determination of gentamicin concentrations was employed the agar diffusion. We emphasize that the gentamicin concentrations in synovial fluid in 6.6.mg/Kg dose may be considered suitable, a period of up to 24 hours after administration. Our results indicate that the volume of 60 ml, can be considered as the ideal volume of the infusion, as well as the association of DMSO increased the gentamicin concentrations (µg / ml) in the joint of horses and possibly reduced edema formation and increases local volume.