Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A galactosemia é uma condição causada pela deficiência de uma das quatro enzimas envolvidas no metabolismo da galactose: galactose mutarotase, galactocinase, galactose-1-fosfato uridiltransferase e UDP galactose - 4 - epimerase. Como consequência deste bloqueio, os indivíduos afetados pela galactosemia não podem efetivamente converter galactose em glicose, apresentando acúmulo de galactose e seus metabólitos em seus tecidos, especialmente nas células do tecido nervoso central, fígado e rins. Dentre os principais achados clínicos, destaca-se disfunção cerebral com atraso de desenvolvimento e deficiência de aprendizado e de memória, cuja fisiopatologia ainda não está esclarecida. Considerando-se o parco conhecimento a respeito dos mecanismos fisiopatológicos do dano cerebral apresentado por pacientes galactosêmicos, o presente trabalho avaliou o efeito da administração aguda de galactose sobre vias apoptóticas em cérebros de ratos jovens. Para tanto, vinte e quatro ratos machos da linhagem Wistar de 30 dias foram divididos em dois grupos: controle e galactosemia. Os animais do grupo galactosemia receberam uma única administração subcutânea de 5 μmol/g de peso corporal de galactose. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes por via subcutânea. Uma hora após a administração deste carboidrato, os animais sofreram eutanásia por decapitação com guilhotina e o córtex cerebral e o cerebelo foram isolados e limpos. Foram então determinados os imunoconteúdo de Bax, Bcl-2, AIF e p53, proteínas que fazem parte de vias de morte celular por apoptose, e a razão Bax/Bcl-2 nestes tecidos por western blotting. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos nos conteúdos das proteínas avaliadas, bem como na razão entre Bax/Bcl-2 em nenhuma das estruturas cerebrais estudadas. Os resultados do presente trabalho sugerem que a administração aguda de galactose não altera os processos de morte celular por apoptose via proteínas Bax, Bcl-2, AIF e p53 em cérebro de ratos jovens.

Leukoplakia is the most common oral premalignancy; however, their clinical and pathological characteristics are not specific. The association of the clinical and morphologic parameters with the analysis of imunohistochemical markers expressed in the induction or inhibition of the cellular proliferation and apoptosis are being studied to elucidating the process of oral carcinogenesis. The aim of this work was to evaluate, immunohistochemically the expression of the p53, bcl-2 and ki-67 proteins in 20 paraffin embedded oral tissues of inflammatory fibrous hiperplasias, 20 of leukoplakias, being ten with epithelial dysplasia and 20 of oral squamous cells carcinoma. A descriptive analysis of the results obtained in HE and immunohistochemically was done and, with the aid of the program Image Pro Plus, a quantitative analysis of the demarcations. The data of the immunohistochemical studies were appraised estatistically. The results showed that the expression of the p53 protein (DO-7) was more common in the group of the leukoplakias, most in the suprabasal region and with focal distribution. The group of the carcinomas was more expressive for the antibodies anti-p53 (PAb-240) and anti-Ki-67, with prevalence of the demarcations in the outlying and central areas and with diffuse distribution. Larger immunopositivity for the bcl-2 protein was observed in the group of hyperplasias, with prevalence for the basal and parabasal region with focal distribution. The difference of the positive areas among the markers p53 (DO-7) and p53 (PAb-240) was significant in the leukoplakias and in the hyperplasias; however, there was no difference statistically significant observed in the carcinomas. The demarcation of the studied proteins was observed more commonly in the suprabasal region in the leukoplakias with epithelial dysplasia but it was also found in leukoplakias without epithelial dysplasia. Leukoplakias and carcinomas were similar statistically as for the relative areas of the markers p53 clones DO-7 and PAb-240 and Bcl-2. The expression detected in this study for these markers in all the lesions suggests that the loss of the regulation of apoptosis and the cellular proliferation occurs in an initial phase of the development of the premalignant lesions including those where it is not possible to detect any alteration morphologically. These data reinforce the importance of the immunomarkers study involved in oral carcinogenesis for evaluation of the prognostic of premalignant and malignant lesions and the indication of more efficient therapeutical and preventive procedures. / A leucoplasia apresenta-se como a lesão cancerizável mais comum da mucosa bucal, entretanto, suas características clínicas e histopatológicas não são específicas. A associação dos parâmetros clínicos e morfológicos com a análise de marcadores imuno-histoquímicos expressos na indução ou inibição da proliferação celular e da apoptose vem sendo estudados no intuito de elucidar o processo da carcinogênese bucal. O presente trabalho teve por objetivo avaliar através da técnica de imuno-histoquímica, a expressão das proteínas p53, Bcl-2 e Ki-67 em 20 blocos parafinados de hiperplasias fibrosas inflamatórias, 20 de leucoplasias, sendo dez com displasia epitelial e 20 de carcinomas de células escamosas bucais. Realizou-se uma análise descritiva dos resultados obtidos em HE e na imunohistoquímica e, com o auxílio do programa Image Pro Plus, uma análise quantitativa da imunomarcação. Os dados dos estudos imuno-histoquímicos foram avaliados estatisticamente. Os resultados mostraram que a expressão da proteína p53, detectada pelo clone DO-7, foi mais encontrada no grupo das leucoplasias, a maioria apresentando localização na região suprabasal e distribuição focal. O grupo dos carcinomas apresentou-se maior positividade para os anticorpos anti-p53 (PAb-240) e anti-Ki-67, com predomínio das marcações nas regiões periférica e central e com distribuição difusa. Maior imunopositividade para o anticorpo anti-Bcl-2 foi observada no grupo das hiperplasias, com predomínio pela localização basal e parabasal com distribuição focal. A diferença das áreas positivas entre os marcadores p53, clone DO-7 e p53, clone PAb-240 foi significativa nas leucoplasias e nas hiperplasias, entretanto não se observou diferença estatisticamente significativa nos carcinomas. A marcação das proteínas estudadas foi observada mais comumente na região suprabasal nas leucoplasias com displasia epitelial mas também foi identificada em leucoplasias sem displasia epitelial. As leucoplasias e os carcinomas apresentaramse estatisticamente semelhantes quanto às áreas relativas dos marcadores p53 clones DO-7 e PAb-240 e do marcador bcl-2. A expressão das proteínas avaliadas neste estudo sugere que o desequilíbrio na regulação da apoptose e da proliferação celular ocorre numa fase inicial do desenvolvimento das lesões cancerizáveis, inclusive nas lesões onde morfologicamente não é possível detectar ainda nenhuma alteração. Estes dados reforçam a importância do estudo de imunomarcadores envolvidos na carcinogênese bucal para avaliação do prognóstico de lesões cancerizáveis e malignas e consequentemente a indicação de procedimentos terapêuticos e preventivos mais eficazes.

Orientador: José Gonçalves Franco Jr. / Coorientador: Mario Cavagna / Banca: João Batista Alcantara Oliveira / Banca: Claudia Guilhermino Petersen / Resumo: Os agonistas do hormônio liberador de gonadotrofina (Gonadotropin-releasing hormone / GnRH) foram introduzidos na estimulação ovariana para fertilização in-vitro (FIV) com o objetivo de evitar o pico prematuro do hormônio luteinizante (LH). Embora sejam acompanhados de algumas desvantagens, os agonistas do GnRH tornaram-se bem aceitos na prática clínica com sua utilização sendo associada a aumento das taxas de gravidez. O desenvolvimento dos antagonistas do GnRH, capazes de bloqueio imediato da hipófise ofereceu uma nova opção terapêutica. Estudos comparativos entre os dois análogos têm sugerido que o uso de antagonistas está associado a uma menor duração do estímulo ovulatório e uma diminuição da incidência de síndrome de hiperestimulação ovariana, enquanto as taxas de gravidez e de nascidos vivos não parecem sofrer influências significativas do tipo de análogo do GnRH utilizado. Por outro lado, os agonistas do GnRH apresentam outras aplicações em ciclos de reprodução assistida além do bloqueio hipofisário / Abstract: The expression of the gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) receptor has been demonstrated in the human ovary, and it has therefore been suggested that GnRH agonists have different effects on the intraovarian system compared with GnRH antagonists, particularly in the granulosa cell (GC) layer. This study aimed to compare the level of apoptosis and DNA fragmentation in human GCs exposed to agonist or antagonist of GnRH in intracytoplasmic sperm injection (ICSI) cycles supplemented with recombinant LH (r-LH). Patients without ovulatory dysfunction aged ≤ 37 years and in the first ICSI cycle were prospectively randomised to receive either a long GnRH agonist protocol or a multi-dose antagonist protocol. In both groups, the GCs were collected during oocyte denudation and separated from blood cells by centrifugation on a 60% isolate solution. It should be emphasized that the study examined only GCs that had been directly detached from the oocyte cumulus complexes. The GCs were then analyzed for DNA fragmentation by TUNEL assay and for apoptosis using annexin-V. The primary outcome measurements were given as the percentage of GCs with DNA fragmentation and apoptosis out of the total number of GCs analyzed. The comparison of the agonist versus the antagonist group was performed using the Mann-Whitney test / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-29Bitstream added on 2014-06-13T20:39:42Z : No. of bitstreams: 1 lavorato_hl_me_botfm.pdf: 358140 bytes, checksum: b2bd390192319a1a211f437dc144d74e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os agonistas do hormônio liberador de gonadotrofina (Gonadotropin-releasing hormone / GnRH) foram introduzidos na estimulação ovariana para fertilização in-vitro (FIV) com o objetivo de evitar o pico prematuro do hormônio luteinizante (LH). Embora sejam acompanhados de algumas desvantagens, os agonistas do GnRH tornaram-se bem aceitos na prática clínica com sua utilização sendo associada a aumento das taxas de gravidez. O desenvolvimento dos antagonistas do GnRH, capazes de bloqueio imediato da hipófise ofereceu uma nova opção terapêutica. Estudos comparativos entre os dois análogos têm sugerido que o uso de antagonistas está associado a uma menor duração do estímulo ovulatório e uma diminuição da incidência de síndrome de hiperestimulação ovariana, enquanto as taxas de gravidez e de nascidos vivos não parecem sofrer influências significativas do tipo de análogo do GnRH utilizado. Por outro lado, os agonistas do GnRH apresentam outras aplicações em ciclos de reprodução assistida além do bloqueio hipofisário / The expression of the gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) receptor has been demonstrated in the human ovary, and it has therefore been suggested that GnRH agonists have different effects on the intraovarian system compared with GnRH antagonists, particularly in the granulosa cell (GC) layer. This study aimed to compare the level of apoptosis and DNA fragmentation in human GCs exposed to agonist or antagonist of GnRH in intracytoplasmic sperm injection (ICSI) cycles supplemented with recombinant LH (r-LH). Patients without ovulatory dysfunction aged ≤ 37 years and in the first ICSI cycle were prospectively randomised to receive either a long GnRH agonist protocol or a multi-dose antagonist protocol. In both groups, the GCs were collected during oocyte denudation and separated from blood cells by centrifugation on a 60% isolate solution. It should be emphasized that the study examined only GCs that had been directly detached from the oocyte cumulus complexes. The GCs were then analyzed for DNA fragmentation by TUNEL assay and for apoptosis using annexin-V. The primary outcome measurements were given as the percentage of GCs with DNA fragmentation and apoptosis out of the total number of GCs analyzed. The comparison of the agonist versus the antagonist group was performed using the Mann-Whitney test

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica autoimune que se caracteriza pela perturbação da homeostase imunológica. Envolve a indução e produção de autoanticorpos, bem como formação e deposição de complexos imunes, que conduzem a uma intensa resposta inflamatória e dano tecidual. Fatores imunológicos, ambientais, hormonais e genéticos podem estar implicados na patogênese da doença. A expressão alterada de genes e proteínas reguladores da apoptose em células T pode comprometer a tolerância imunológica e induzir autoantígenos responsáveis pelo desenvolvimento e perpetuação de condições autoimunes. Mas, pouco se sabe a respeito de como a expressão destas proteínas afeta o desenvolvimento e a função das células T. As células T regulatórias (Treg), uma subpopulação celular de importância para prevenir a autoimunidade, apresentam número e capacidade supressora alterados nos pacientes lúpicos. Buscando entender como anormalidades observadas nas vias apoptóticas contribuem para a autoimunidade, o presente estudo avaliou a frequência de apoptose inicial e morte celular de linfócitos nestes pacientes, a frequência de subtipos de células T expressando as proteínas envolvidas nas vias extrínseca e intrínseca da apoptose, como Fas, FasL, Bax, Bcl-2 e p53, além da expressão dos genes que as codificam. Analisou-se ainda a frequência de polimorfismos nos genes FAS, FASL, BCL-2 e BAX em pacientes, comparando estes dados com o de controles, buscando possíveis associações com a predisposição à doença e com os dados clínicos. Foram estudados 427 pacientes com LES do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) e 543 indivíduos saudáveis, como controles. Dados de 50 mulheres lúpicas mostraram maior frequência de células Treg, bem como maior densidade de expressão do fator de transcrição Foxp3 nestas células em relação a controles, embora não tenhamos observado diferenças estatísticas em relação à expressão de proteínas pró- e antiapoptóticas nesta subpopulação celular. Uma proporção aumentada de células T CD4+ expressando Fas e p53, e uma frequência reduzida expressando Bcl-2 foi encontrada nas pacientes, em relação aos controles. Esse último dado foi apoiado pela relação observada entre a menor frequência de T CD4+ expressando Bcl-2 e a atividade da doença, e pela expressão diminuída do gene BCL-2 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de mulheres lúpicas. Células T CD8+ expressando Bax e p53 também foram mais frequentes nas pacientes, ressaltando que células T CD8+p53+ foram mais numerosas nas pacientes com positividade para anticorpos anti-DNA. Maior frequência de morte de linfócitos foi observada em mulheres lúpicas. Com relação ao estudo dos polimorfimos, variantes alélicas dos genes FASL e BAX possivelmente se relacionam com o desenvolvimento e proteção da doença, respectivamente. Em conclusão, nossos achados apontam que a expressão modificada de genes e proteínas em células TCD4+ e TCD8+, relacionada a uma maior taxa de apoptose, podem conduzir à desregulação das vias apoptóticas e levar à perda da tolerância periférica, favoráveis ao desenvolvimento do LES. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory autoimmune disease that is characterized by disruption of the immune homeostasis. It involves the induction and production of autoantibodies, as well as formation and deposition of immune complexes, leading to a severe inflammatory response and tissue damage. Immunological, environmental, hormonal and genetic factors may be implicated in the pathogenesis of the disease. The altered expression of genes and proteins regulating apoptosis on T cells may lead to breakdown of the immune tolerance and induce autoantigen responsible for the development and perpetuation of autoimmune conditions. Little information is known of how these proteins affect the development and function of T cells. Regulatory T cells (Treg), a cell subpopulation of importance to prevent the autoimmunity, exhibit changed number and suppressive capacity in SLE patients. Trying to understand how abnormalities observed in apoptotic pathways contribute to autoimmunity, the present study evaluated the frequency of initial apoptosis and cell death of lymphocytes in these patients, the frequency of T cell subsets expressing the proteins involved in the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis, such as Fas, FasL, Bax, Bcl-2 and p53, besides the expression of genes that encode them. We also examined the polymorphisms frequencies of Fas, FasL, Bcl-2 and Bax genes in patients, comparing these data with controls, looking for possible associations with the predisposition to disease and the clinical data. 427 SLE patients from Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) and 543 healthy subjects, as controls were studied. Results from 50 SLE women showed a higher frequency of Treg cells as well as a higher density of Foxp3 expression in these cells compared to controls, although we have not observed statistical differences in relation to the expression of pro- and antiapoptotic proteins in this cell subpopulation. An increased proportion of CD4+ T cells expressing Fas and p53, and a reduced frequency expressing Bcl-2 were found in patients. The latter finding was supported by the negative relation found between the frequency of CD4+Bcl-2+ cells and the disease activity index and by the decreased expression of BCL-2 gene in PBMCs of lupus women. CD8+ T cells expressing Bax and p53 were also more frequent in patients, noting that CD8+ T cells expressing p53 were more frequent in patients positive for anti-DNA antibodies. A higher frequency of death of lymphocytes was observed in SLE women. Regarding to polymorphisms analysis, allelic variants of FasL and Bax are possibly relate to the development and protection of the disease, respectively. In conclusion, our findings indicate that the modified expression of genes and proteins in CD4+ and CD8+ T cells, related to an increased apoptosis, may lead to dysregulation of the apoptosis pathways and the loss of peripheral tolerance, favorable for SLE development.

O crescente corpo de informações gerado pelo desenvolvimento de técnicas de altodesempenho, como sequenciamento de DNA em larga escala, técnicas de microarranjo de DNA, hibridização de proteínas, etc., tem evidenciado uma intrincada relação entre os diversos personagens que compõe os sistemas biológicos. Alguns dos sistemas bioquímicos presentes em organismos modernos surgiram há bilhões de anos e estavam presentes em organismos primitivos, ao passo que determinados sistemas são mais recentes e específicos de alguns grupos taxonômicos. O entendimento das relações entre os diferentes personagens dos sistemas biológicos apresenta-se como fundamental para a compreensão da vida e a avaliação dos aspectos evolutivos que permearam a constituição dos sistemas bioquímicos e suas intrincadas inter-relações pode auxiliar sobremaneira no estudo da biologia. Diversas teorias encontram-se bem estabelecidas no estudo evolutivo em nível de espécies e populações. Da mesma maneira, há um extenso acervo bibliográfico acerca da evolução de genes individuais. Entretanto, o surgimento, estabelecimento e evolução dos sistemas bioquímicos permanecem escassamente estudados. Na presente tese, partimos da análise de dois sistemas bioquímicos, o sistema de apoptose e o sistema de estabilidade genômica, os quais são bastante associados em mamíferos. Apesar da íntima relação entre esses sistemas, eles foram originados em momentos diferentes da evolução. Buscamos reconstruir o cenário evolutivo que uniu os sistemas de apoptose e estabilidade genômica, onde encontramos uma relação direta entre ancestralidade, essencialidade e clusterização. Os resultados também sugerem uma relação inversa entre essas três características e plasticidade. A análise de plasticidade efetuada na rede de apoptose e estabilidade genômica foi ampliada para 4850 famílias de proteínas em 55 eucariotos, apresentando basicamente os mesmos resultados, indicando um mecanismo geral de evolução do genoma. Subsequentemente, propusemos um modelo matemático de crescimento do genoma onde a novidade genética surge por duplicação de genes muito conectados e pouco clusterizados. A rede artificial obtida mimetiza diversos aspectos topológicos das redes biológicas conhecidas. Os resultados analisados em conjunto sugerem um mecanismo geral de evolução do genoma, onde a novidade genética surge na porção mais plástica do genoma, basicamente por duplicação gênica. Essa duplicação ocorre prioritariamente nos hubs intermodulares. / The increasing body of information generated by high-throughput techniques, such as DNA sequencing, genome-wide microarray, and two-hybrid system, has unveiled an intricate relationship among different components of biological systems. Some of the biological systems found in modern organisms have their origins billion years ago and were present in primitive organisms. On the other hand, some biological systems are more recent and specifically related to some taxa. The characterization of the relationships involving the different components of biological systems is crucial to the understanding of life. Additionally, the evaluation of evolutionary aspects which work in biochemical systems construction, modeling their intricate relationship, could help improve biological research field. Several theories are well-established in evolutionary research of species and population. Likewise, there is plenty of bibliography concerning individual gene evolution. However, there is paucity of data concerning the origin, establishment, and evolution of entire biological systems. In the present thesis, we start by analyzing two biochemistry systems: apoptosis and genome stability. These systems are considerably associated in mammals. Despite its entangled functioning, each system has emerged in different points of evolution. We reconstructed the evolutionary scenario which entangled both systems. We found a direct relationship among ancestrality, essentiality, and clustering. Our results also suggest an inverse relationship of these three proprieties with plasticity. The same plasticity analysis used in apoptosis and genome stability systems was amplified to 4850 gene families in 55 eukaryotes, showing basically the same results. It suggests a general mechanism of genome evolution. We then propose a genome growth model where genetic novelty arrives through gene duplication of highly connected but not so clustered genes. The resulting artificial network reproduces several known topological aspects of biological networks. The results, when simultaneously analyzed, suggest general genome evolution mechanisms, where the genetic novelty arrives in more plastic area of the genome, basically by gene duplication. That duplication occurs mainly in intermodular hubs.

O crescente corpo de informações gerado pelo desenvolvimento de técnicas de altodesempenho, como sequenciamento de DNA em larga escala, técnicas de microarranjo de DNA, hibridização de proteínas, etc., tem evidenciado uma intrincada relação entre os diversos personagens que compõe os sistemas biológicos. Alguns dos sistemas bioquímicos presentes em organismos modernos surgiram há bilhões de anos e estavam presentes em organismos primitivos, ao passo que determinados sistemas são mais recentes e específicos de alguns grupos taxonômicos. O entendimento das relações entre os diferentes personagens dos sistemas biológicos apresenta-se como fundamental para a compreensão da vida e a avaliação dos aspectos evolutivos que permearam a constituição dos sistemas bioquímicos e suas intrincadas inter-relações pode auxiliar sobremaneira no estudo da biologia. Diversas teorias encontram-se bem estabelecidas no estudo evolutivo em nível de espécies e populações. Da mesma maneira, há um extenso acervo bibliográfico acerca da evolução de genes individuais. Entretanto, o surgimento, estabelecimento e evolução dos sistemas bioquímicos permanecem escassamente estudados. Na presente tese, partimos da análise de dois sistemas bioquímicos, o sistema de apoptose e o sistema de estabilidade genômica, os quais são bastante associados em mamíferos. Apesar da íntima relação entre esses sistemas, eles foram originados em momentos diferentes da evolução. Buscamos reconstruir o cenário evolutivo que uniu os sistemas de apoptose e estabilidade genômica, onde encontramos uma relação direta entre ancestralidade, essencialidade e clusterização. Os resultados também sugerem uma relação inversa entre essas três características e plasticidade. A análise de plasticidade efetuada na rede de apoptose e estabilidade genômica foi ampliada para 4850 famílias de proteínas em 55 eucariotos, apresentando basicamente os mesmos resultados, indicando um mecanismo geral de evolução do genoma. Subsequentemente, propusemos um modelo matemático de crescimento do genoma onde a novidade genética surge por duplicação de genes muito conectados e pouco clusterizados. A rede artificial obtida mimetiza diversos aspectos topológicos das redes biológicas conhecidas. Os resultados analisados em conjunto sugerem um mecanismo geral de evolução do genoma, onde a novidade genética surge na porção mais plástica do genoma, basicamente por duplicação gênica. Essa duplicação ocorre prioritariamente nos hubs intermodulares. / The increasing body of information generated by high-throughput techniques, such as DNA sequencing, genome-wide microarray, and two-hybrid system, has unveiled an intricate relationship among different components of biological systems. Some of the biological systems found in modern organisms have their origins billion years ago and were present in primitive organisms. On the other hand, some biological systems are more recent and specifically related to some taxa. The characterization of the relationships involving the different components of biological systems is crucial to the understanding of life. Additionally, the evaluation of evolutionary aspects which work in biochemical systems construction, modeling their intricate relationship, could help improve biological research field. Several theories are well-established in evolutionary research of species and population. Likewise, there is plenty of bibliography concerning individual gene evolution. However, there is paucity of data concerning the origin, establishment, and evolution of entire biological systems. In the present thesis, we start by analyzing two biochemistry systems: apoptosis and genome stability. These systems are considerably associated in mammals. Despite its entangled functioning, each system has emerged in different points of evolution. We reconstructed the evolutionary scenario which entangled both systems. We found a direct relationship among ancestrality, essentiality, and clustering. Our results also suggest an inverse relationship of these three proprieties with plasticity. The same plasticity analysis used in apoptosis and genome stability systems was amplified to 4850 gene families in 55 eukaryotes, showing basically the same results. It suggests a general mechanism of genome evolution. We then propose a genome growth model where genetic novelty arrives through gene duplication of highly connected but not so clustered genes. The resulting artificial network reproduces several known topological aspects of biological networks. The results, when simultaneously analyzed, suggest general genome evolution mechanisms, where the genetic novelty arrives in more plastic area of the genome, basically by gene duplication. That duplication occurs mainly in intermodular hubs.

A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multifatorial de etiologia ainda não completamente esclarecida. A hipertensão arterial sistêmica e proteinúria maciça que surgem após a 20ª semana de gestação são as características marcantes desta enfermidade. Fatores genéticos, endoteliais e imunológicos, além de taxa de apoptose alterada, falha na invasão trofoblástica e estresse psicossocial também estão envolvidos com o desenvolvimento de PE. Mulheres grávidas apresentam uma maior vulnerabilidade ao estresse, devido às constantes alterações hormonais durante a gestação. O hormônio cortisol, também chamado de hormônio do estresse, é produzido pela supra-renal e atua em várias células e tecidos, a partir da sua ligação com receptores específicos (receptores de glicocorticóide – GR). Níveis elevados de cortisol podem desencadear apoptose celular devido ao aumento do estresse oxidativo. O gene NR3C1 codifica o GR, essencial para a interação entre o cortisol e os diversos mecanismos fisiológicos. A presença de polimorfismos como o BclI (rs41423247) e ER22/23EK (rs6189/6190) já foi relacionada com uma maior ou menor sensibilidade ao cortisol, respectivamente. Dessa maneira, objetivamos investigar a frequência destes polimorfismos em gestantes saudáveis e com PE. Além disso, avaliamos também a presença de polimorfismos em genes que codificam proteínas chave na cascata de apoptose (rs1042522, rs2279744, rs929271 nos genes TP53, MDM2 e LIF respectivamente) e sua relação com a PE. O alelo A do polimorfismo ER22/23EK esteve mais presente no grupo controle, enquanto que o alelo G do polimorfismo BclI apresentou maior frequência em grávidas que desenvolveram a forma leve de PE. Nenhuma diferença entre mulheres com PE e o grupo controle foi observada em relação aos polimorfismos em genes de cascata apoptótica. Concluímos que alterações genéticas no gene codificador dos receptores de cortisol podem afetar a resposta frente ao estresse, aumentando a probabilidade para o desenvolvimento de PE. Porém, os genes envolvidos na via apoptótica aqui avaliados não parecem estar relacionados com esta desordem. Mais pesquisas devem ser realizadas buscando elucidar a complexa fisiopatologia da pré-eclampsia. / Preeclampsia (PE) is a multifactorial disease which etiology is not fully elucidated. Systemic hypertension and massive proteinuria that arise after the 20th week of pregnancy are the hallmarks of this disorder. Genetic, endothelial and immune factors, modified rate of apoptosis, trophoblast invasion failure and psychosocial stress are also involved with PE development. Pregnant women have an increased vulnerability to stress due to constant hormonal changes during pregnancy. The cortisol hormone, also called the stress hormone, is produced by the adrenal and acts on several cells and tissues trough its binding to specific receptors (glucocorticoid receptor – GR). High cortisol levels may trigger apoptosis due to increased oxidative stress. The gene NR3C1 encodes the GR, essential for the interaction between cortisol and the various physiological mechanisms. The presence of polymorphisms as BclI (rs41423247) and ER22/23EK (rs6189/6190) has been associated with a higher and lower sensitivity to cortisol, respectively. Thus, we aimed to investigate the frequency of these polymorphisms in healthy and PE pregnant. Moreover, we also assessed the presence of polymorphisms in genes that encode key proteins in the apoptosis pathway (rs1042522, rs2279744, rs929271 in TP53, MDM2 and LIF genes) and its relationship with PE. The A allele of the ER22/23EK polymorphism was more frequent in the control group, while the G allele of the BclI polymorphism had a higher frequency in pregnant women who developed mild PE. No differences between women with PE and the control group were observed for polymorphisms in genes of apoptotic pathway. We conclude that genetic alterations of cortisol receptors may affect the response to stress, modulating the development of PE. However genes of apoptotic pathway evaluated here do not seem to be related to this disorder. More research should be done seeking to elucidate the complex pathophysiology of preeclampsia.

Orientador: Licio Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas. / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:03:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mansur_Eli_D.pdf: 1693041 bytes, checksum: a5b3d9f350100a50b16d835341ff4bc9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leptina, hormônio com semelhança funcional e estrutural às citocinas, é conhecida por exercer, além das ações clássicas de controle da ingestão alimentar e termogênese, importantes funções na modulação das respostas do sistema imune. Alguns destes efeitos são dependentes da propriedade da leptina em modular a apoptose das células tímicas. Neste trabalho, utilizamos ratos Wistar para investigar os mecanismos moleculares envolvidos no controle, dependente da leptina, da apoptose no timo. A apoptose foi avaliada por citometria de fluxo e ELISA para determinação de nucleossomos, enquanto que a transdução do sinal foi avaliada por imunoprecipitação, imunoblot e microscopia confocal. O ObR estava expresso na maioria das células tímicas e a sua quantidade relativa reduziu-se progressivamente durante a maturação dos timócitos. A expressão do ObR estava co-localizada com JAK-2 e STAT-3, e a injeção aguda, in vivo , de leptina promoveu a fosforilação em tirosina de JAK-2 e o engajamento de STAT-3. O tratamento com leptina, também, levou à fosforilação em tirosina de IRS1 e fosforilação em serina de Akt. O tratamento crônico com leptina reduziu a apoptose tímica, e este efeito não foi inibido pelo AG490, um inibidor de JAK, mas foi significativamente inibido por LY294002, um inibidor de PI3-Quinase, e por um oligonucleotídeo antisense para IRS1. Portanto, a leptina inibe a apoptose em células tímicas via um mecanismo independente da ativação de JAK-2 mas dependente do engajamento da via IRS1/PI3-Quinase / Abstract: The cytokine-like hormone leptin is known to exert important functions on the modulation of immune responses. Some of these effects are dependent on the property of leptin to modulate the apoptosis of thymic cells. In the present study, we employed Wistar rats to investigate the molecular mechanisms involved in leptin-dependent control of apoptosis in thymus. Apoptosis was evaluated by flow cytometry and ELISA for nucleosome determination, while signal transduction was evaluated by immunoprecipitation, immunoblot and confocal microscopy. The ObR was expressed in most thymic cells and its relative amount reduced progressively during thymocyte maturation. ObR expression was co-localized with JAK-2 and STAT-3, and an acute, in vivo , injection of leptin promoted the tyrosine phosphorylation of JAK-2 and the engagement of STAT-3. The treatment with leptin also led to the tyrosine phosphorylation of IRS1 and serine phosphorylation of Akt. Chronic treatment with leptin reduced thymic apoptosis, an effect that was not inhibited by the JAK inhibitor AG490 but was significantly inhibited by the PI3-kinase inhibitor LY294002 and by an antisense oligonucleotide to IRS1. Thus, leptin inhibits the apoptosis of thymic cells through a mechanism that is independent of the activation of JAK-2 but depends on the engagement of the IRS1/PI3-kinase pathway / Doutorado / Medicina Experimental

Orientador : Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pagnano_KatiaBorgiaBarbosa_D.pdf: 5851139 bytes, checksum: e4d18bbf0ada55219fc1e87aaceeef3d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Os linfomas não-Hodgkin (LNH) agressivos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas. Os LNH difusos de grandes células B compreendem cerca de 20-25% dos LNH. O tratamento quimioterápico pode curar apenas 40-50% dos pacientes adultos com linfomas agressivos. São considerados indicadores prognósticos: idade, número de sítios extranodais, LDH, performance status e estadiamento clínico. Além desses fatores, anormalidades das proteínas reguladoras do ciclo celular e da apoptose parecem ser um importante mecanismo de desenvolvimento de neoplasias e podem ter um papel no prognóstico dos linfomas agressivos. A expressão das proteínas reguladoras do ciclo celular, p53, p21/WAF-1, Mdm2 , c-Myc e PCNA (proliferating cell nuclear antigen) foram avaliadas através da análise imunohistoquímica de biópsias de gânglio, fixadas em formol e embebidas em parafina de 113 casos de LNH de alto grau de malignidade histológico, sendo que em 62 pacientes com LNH agressivos a expressão das proteínas foi correlacionada com dados clínicos e de sobrevida. Expressão de p53, p21/WAF-1, Mdm2 e c-Myc foi observada em 17/ 62 (30%), 25/60 (42%), 13/44 (30%) e 39/ 51 (76.5%) dos casos, respectivamente. O fenótipo p53+/p21WAF-1 negativo, que é mais freqüentemente encontrado nos casos com mutações do p53, foi associado com menor sobrevida global (SG), (P=0.04) e uma menor taxa de remissão completa (RC) (P=0.01). Expressão negativa de p53 e c-Myc foram relacionadas a uma melhor resposta à quimioterapia (P=0.005 e 0.035, respectivamente). A expressão de p53, c-Myc e Mdm2 foi associada a uma menor SG (P < 0.001, 0.05 e 0.037 respectivamente), sugerindo que a expressão dessas proteínas poderia estar associada a um pior prognóstico nesses pacientes. Além da análise da expressão da p53, pesquisamos a presença de mutações do gene p53 nos casos com hiperexpressão da proteína (n=17). Foi possível extrair DNA de 15 casos. A amplificação dos éxons 5-9 do p53 teve êxito em 7 casos, com o achado de uma mutação de ponto no éxon 6 (Val®Glu;T®A), num paciente com hiperexpressão da p53 e expressão negativada p21/WAF-1.Avaliamos também a expressão de proteínas reguladoras da apoptose (p53, Bcl-2, Bax, Bak e Mcl-1) de 33 pacientes com LNH difusos de grandes células B e analisamos a relação entre a expressão dessas proteínas com dados clínicos e resposta à quimioterapia. Nossos resultados mostraram que a expressão da p53 foi considerada um parâmetro imunohistoquímico independente relacionado a um pior prognóstico nesses linfomas. Apesar da alta expressão observada das proteínas Bcl-2, Bax, Bak e Mcl-1, não foi encontrado associação com prognóstico ou resposta ao tratamento / Abstract: Aggressive non-Hodgkin¿s lymphomas (NHL) form a heterogeneous group in terms of clinical presentation, histology, immunophenotype, response to treatment and prognosis. Diffuse large B-cell NHL (DLCL) constitute up to 20-25% of NHL in many series. Combination chemotherapy may cure 40-50% of adult patients. Several clinical prognostic factors have been described to predict clinical outcome, as age, LDH, performance status, and stage and are useful for identifying high-risk patients, who would benefit from a more intensive approach. Abnormalities of cell cycle and apoptosis regulating proteins seem to be an important mechanism of tumorigenesis and may play a role in the prognosis of aggressive NHL. The expression of p53, p21/WAF-1, Mdm2 , c-Myc and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) proteins were examined by the immunohistochemistry of paraffin embedded tissues of 113 high grade non-Hodgkin's lymphomas (NHL) and in 62 patients with aggressive NHL correlated to clinical data. Expression of p53, p21/WAF-1, Mdm2 and c-Myc protein was observed in 17 out of 62 cases (30%), 25 out of 60 (42%), 13 out of 44 (30%) and 39 out of 51 (76.5%), respectively. The p53+/p21WAF-1 phenotype, which is more frequently found in p53 mutations, was associated with a worse overall survival (P=0.04) and with a lower rate of complete response (CR)(PF=0.01). p53 and c-Myc negative expression was related to a better response to chemotherapy (PF=0.005 and 0.035, respectively). The expression of p53, c-Myc and Mdm2 was related to a shortened overall survival (P < 0.001, 0.05 and 0.037 respectively), suggesting that the expression of these proteins could be associated with a poor outcome in these patients. We looked for mutations of p53 gene in aggressive NHL patients with hiperexpression of p53 protein (n=17). DNA extraction was performed in 15 patients and PCR amplification of exons 5-9 was possible in 7 cases. We found a point mutation in exon 6 (Val®Glu;T®A), in a patient with p53 hiperexpression and p21 negative expression. We also evaluated the expression of apoptosis-regulating proteins (p53, Bcl-2, Bax, Bak and Mcl-1) of paraffin-embedded tissues of 33 patients with diffuse large B-cell NHL, and assessed the relationship of these proteins to clinical outcome and response to chemotherapy. Our results showed that p53 expression was an independent immunohistochemical parameter related to a poor prognosis in these lymphomas. Bcl-2, Bax, Bak and Mcl-1 proteins, though highly expressed in almost all cases were not associated with prognosis or response to treatment / Doutorado / Doutor em Clínica Médica