Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Des signes d'apoptose, une forme de suicide cellulaire programmé, ont été décrits dans les gamètes et l'embryon préimplantatoire de nombreuses espèces de mammifères y compris l'homme, à la fois in vitro et in vivo. Parce que le développement embryonnaire serait lié à un équilibre entre prolifération et mort cellulaire, l'étude du contrôle génétique de l'apoptose dans les embryons préimplantatoires est d'une importance considérable. Par ailleurs, on sait que la qualité des gamètes (en particulier des ovocytes) influencerait leur propre survie mais également le développement embryonnaire précoce. Les régulateurs d'apoptose appartenant à la famille Bcl-2 occupent une place centrale dans les voies de décision de vie ou de mort cellulaire. Dans le premier volet de ce travail de thèse, nous avons analysé l'expression des membres de la famille Bcl-2 lors de la transition ovocyte-embryon au troisième jour (J3) et montré que les trois sous-groupes de la famille Bcl-2 présentent un profil d'expression dynamique tout au long du développement embryonnaire précoce humain. La régulation des niveaux d'expression de ces gènes au cours du développement embryonnaire précoce pourrait donc s'avérer cruciale pour le contrôle de la survie embryonnaire, notamment sous des conditions de culture suboptimales. Dans le second volet, nous nous sommes intéressés à l'analyse du transcriptome au cours du développement embryonnaire précoce humain, et plus particulièrement lors de la spécification du trophectoderme. La confrontation du transcriptome des embryons à J3 avec celui des cellules du trophectoderme nous a permis de mettre en évidence des processus moléculaires qui pourraient jouer un rôle important lors de la différenciation du TE, tels que la stéroïdogenèse et les régulations épigénétiques. En plus de son intérêt fondamental, la connaissance de l'expression génique et des mécanismes moléculaires régulant des processus clés tels que l'apoptose et la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire préimplantatoire peut permettre d'ouvrir des pistes de recherche diagnostique et thérapeutique intéressantes. / Apoptosis, a form of cell death by self-destruction, has been reported in gametes and preimplantation embryos both in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that cell death processes can impact embryo developmental competence. Moreover, quality of the gametes (particularly of the oocytes) is relevant not only for their own survival but can also influence embryonic development during the early cleavage stages. Thus, the investigation of apoptosis-related genes and mechanisms in early embryos is crucial. Bcl-2 family proteins, through balanced interactions between pro- and anti-apoptotic members, play a pivotal role in controlling cell life and death. In a first part, we analyzed the expression patterns of Bcl-2 family members during the human oocytes-to-day 3 embryo transition and showed that several members were differentially regulated. The regulation of the expression levels of anti- and pro-apoptotic Bcl-2 family members during early embryonic development may therefore be crucial for the control of early embryo survival, especially under suboptimal culture conditions. In a second part, we were interested in studying the transcriptome during human early embryonic development, and particularly during the trophectoderm specification. The comparison of the transcriptome of embryos on day 3 with that of trophectoderm cells allowed us to identify new molecular processes that could play an important role during trophectoderm differentiation and development, such as steroidogenesis and epigenetic regulations. In addition to its fundamental interest, a better knowledge of gene expression and molecular mechanisms regulating key processes such as apoptosis and cell differentiation during human early embryonic development may provide new guides for diagnosis and therapeutic strategies.

Pas de résumé français / Pas de résumé anglais

L'infarctus du myocarde (IDM) est consécutif à une occlusion coronaire provoquant une ischémie prolongée. La taille de l'infarctus est le déterminant majeur de la récupération du myocarde et de la survie du patient. La reperfusion coronaire la plus précoce (par thrombolyse ou angioplastie) est reconnue comme étant le seul traitement recommandé. Cependant, malgré les effets bénéfiques, la reperfusion s'accompagne d'effets délétères appelés « lésions de reperfusion ». Récemment, l'efficacité du postconditionnement ischémique (PostC) a été démontrée en clinique. Il permet, lorsqu'il est utilisé au cours de l'angioplastie primaire ou de sauvetage, de réduire significativement la taille de l'infarctus. L'application du protocole de PostC reste cependant limitée aux patients admis dans les centres d'angioplastie, ce qui exclut tous les patients thrombolysés. Afin d'améliorer la cardioprotection, il est nécessaire de déterminer la fenêtre thérapeutique temporelle optimale d'administration du PostC. De plus, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques nouvelles, adjuvants de la reperfusion, qui pourront être administrées dès que le diagnostic d'IDM est posé. L'objectif de notre travail a donc été d'étudier l'influence du délai d'application du PostC sur l'efficacité de cardioprotection dans un modèle murin d'ischémie-reperfusion et de rechercher des substances pharmacologiques cardioprotectrices. Nos travaux révèlent que l'efficacité du PostC est maintenue s'il est appliqué les 30 premières minutes après le début de la reperfusion. D'autre part, nous avons évalué le potentiel thérapeutique de peptides inhibiteurs ciblant l'apoptose responsable de la mort cellulaire au cours de l'ischémie-reperfusion. L'utilisation de peptides Tat-BH4 et Pip2b-BH4 pour le traitement des lésions d'ischémie-reperfusion myocardique a fait l'objet d'une étude preuve-de-concept in vivo. Les constructions peptidiques inhibant l'interaction FAS-DAXX, injectées en intraveineuse au moment de la reperfusion, induisent une diminution de 50% de la taille d'infarctus et de l'apoptose. Ils ont fait l'objet d'un dépôt de brevet car ils constituent des outils pharmacologiques à haut potentiel thérapeutique. / Myocardial infarction (MI) results from a coronary occlusion leading to severe ischemia. Infarct size is a major determinant of myocardial salvage and mortality. Prompt revascularization (either by thrombolysis or primary angioplasty) is recommended for AMI patients but leads to deleterious effects called "reperfusion injury". Recently, ischemic postconditioning (PostC) efficiency has been reported in patients. However, its application during primary angioplasty is limited to patients admitted in angioplasty centers thereby excluding thrombolysed patients. In order to improve cardioprotection, it is necessary to define the time window for optimal cardioprotection and to develop new pharmacological strategies for AMI patients. Our work, using an in vivo mouse model of ischemia-reperfusion, shows that PostC efficiency is maintained if applied the first 30 minutes after the onset of reperfusion. Furthermore, we evaluated the therapeutic potential of peptide inhibitors targeting apoptosis, which is responsible for cell death during ischemia-reperfusion. As a proof-of-concept study, the cardioprotective effects of Tat-BH4 and Pip2b-BH4 peptidic constructs have been revealed in vitro and in vivo. The peptidic constructs targeting FAS-DAXX interaction, injected intravenously as a single bolus at the time of reperfusion, reduced by 50% both infarct size and apoptosis. These pharmacological tools have been patented due to their high therapeutic potential.

Plasmodium falciparum est un protozoaire parasite responsable du paludisme causant la mort d’environ un million de personnes par an. La résistance médicamenteuse du parasite augmente la pathogénicité de cette maladie. Il est question ici d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire programmée (apoptose) du parasite en présence de chloroquine (CQ) et de tester l’hypothèse qu’une résistance à la CQ peut s’expliquer en partie par une défaillance de ce mécanisme de mort. Dans un premier temps l’étude des marqueurs de l’apoptose (TUNEL, JC1, formes pyknotiques) montre qu’une souche sensible de parasite (3D7) à la CQ peut subir une apoptose en présence de CQ alors qu’une souche résistante (7G8) présente un défaut d’apoptose. Dans un deuxième temps nous montrons que la protéine PfMCA1 (P. falciparum métacaspase 1) présente une structure et une maturation protéolytique proche de celui des caspases faisant de cette protéine un candidat potentiellement impliqué dans l’apoptose du parasite. Dans un troisième temps nous montrons que l’expression du domaine catalytique de PfMCA1 dans la levure induit une mort cellulaire et un retard de croissance de la levure. Nous montrons également que PfMCA1 présente une activité enzymatique de type arginase alors que les effets induit par sa surexpression peuvent être inhibés par l’ajout d’un inhibiteur de protéases spécifiques des aspartates. Ces résultats suggèrent que PfMCA1 pourrait agir comme une protéine initiatrice induisant l’action d’une protéase effectrice spécifique des aspartates conduisant à la mort cellulaire. Cette hypothèse testée chez la levure reste à confirmée chez P. falciparum / Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for malaria causing one million deaths per year. Drug resistance of the parasite increases the pathogenicity of this disease. In this thesis, it is question to explore the molecular pathway involved in programmed cell death (apoptosis) of the parasite in the presence of chloroquine (CQ) and to test the hypothesis that CQ resistance could be partly explained by a failure of such a mechanism. In a first step, we showed that a sensitive clone (3D7) exhibited the classical hallmarks of apoptosis (DNA fragmentation, mitochondrial depolarization) under a CQ pressure while a resistance clone failed to undergo apoptosis. In a second step we show that the protein PfMCA1 (P. falciparum metacaspase 1) has a structure and a processing similar to the well known caspases which are the key effectors of apoptosis for higher eukaryotic cells. In a third step we show that expression of the catalytic domain of PfMCA1 in yeast induces cell death and growth retardation of yeast. We show that PfMCA1 presented an arginine-specific protease activity while the effects induced by its overexpression were inhibited by an aspartate-specific protease inhibitor (z-VAD-fmk). These results suggest that PfMCA1 might act as an initiator protein inducing an aspartate-specific protease effector leading to cell death. This hypothesis tested in yeast remains to be confirmed in P. falciparum

Les antidépresseurs de type Inhibiteur Sélectif de la Recapture de la Sérotonine (SSRI pour Selective Serotonin Reuptake Inhibitor), dont fait partie la fluoxétine (Prozac), ont été décrits comme capables de déclencher l'apoptose de cellules tumorales in vitro et in vivo, suggérant une potentielle utilisation de ces molécules pour le traitement des cancers. Cependant, leur mécanisme apoptotique n’a pas été élucidé à ce jour. Nous avons donc entrepris de déterminer les étapes de l'apoptose induite par la fluoxétine et les SSRI, en choisissant comme modèle d'étude des lignées cellulaires de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. Nous avons identifié plusieurs étapes de la signalisation apoptotique de la fluoxétine et des SSRI. Ainsi, via une inhibition de la chaîne respiratoire, la fluoxétine induit la production d'espèces réactives de l'oxygène conduisant à la surexpression des récepteurs de mort DR4 et DR5 ; la fluoxétine induit également l'activation de la caspase-8. DR4 et DR5 sont très probablement la cause de l'apoptose induite par la fluoxétine, de façon indépendante de leur ligand, TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Partant du constat que l'utilisation de TRAIL comme antitumoral pour le traitement des lymphomes présente des résultats prometteurs mais encore insuffisants, nous avons envisagé que la fluoxétine puisse augmenter l’apoptose induite par TRAIL dans ce type de tumeurs. Nous montrons en effet qu'une association de la fluoxétine avec TRAIL conduit à une augmentation de l'action apoptotique de TRAIL dans les lignées de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. De plus, nos résultats montrent que la fluoxétine induit la mort cellulaire d'une façon indépendante de la caspase-8. Cet effet semble trouver son origine dans une surcharge en calcium de la mitochondrie, alimentée par une stimulation maintenue de l'entrée de calcium par les canaux CRAC (Calcium Release Activated Calcium). En conclusion, les éléments de la signalisation calcique et apoptotique de la fluoxétine et des SSRI que nous avons identifiés encouragent leur utilisation en thérapie, et notamment dans le cadre d'associations avec TRAIL et d'autres molécules pour permettre une augmentation de l'apoptose des cellules tumorales, voire des cellules résistantes à l'apoptose induite par TRAIL. / Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI) antidepressants, such as fluoxetine (Prozac), have been shown to induce apoptosis in cancer cells in vitro and in vivo, suggesting a potential use for cancer treatment. However, their apoptotic mechanism has remained undetermined until now. Therefore, we have undertaken the determination of fluoxetine- and SSRIs-induced apoptotic signalling, our study model being aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma (NHL) cell lines. We have identified several steps of the apoptotic signalling of fluoxetine and the SSRIs. Thus, via an inhibition of the respiratory chain, fluoxetine induces a reactive oxygen species production leading to the overexpression of the death receptors DR4 and DR5; fluoxetine also induces caspase-8 activation. DR4 and DR5 are probably the cause of fluoxetine-induced apoptosis, independently of their ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Knowing that TRAIL as an antitumoral agent for lymphoma treatment has shown promising but insufficient results, we have hypothesized that fluoxetine could increase TRAIL-induced apoptosis in these tumors. Indeed, we show that fluoxetine in association with TRAIL leads to an increase in TRAIL-induced apoptosis in aggressive NHL cell lines. Furthermore, our results show that fluoxetine induces cell death in a caspase-8–independent manner. This effect seems to originate from a mitochondrial calcium overload fueled by a sustained calcium entry from the CRAC (Calcium Release Activated Calcium) channels. In conclusion, the calcium pathway and the apoptotic steps of the fluoxetine's and the SSRIs' signalling that we have delineated encourage their use in therapy, especially in association with TRAIL and other molecules in order to enable an increase in cancer cells' apoptosis, or even in cancer cells which are resistant to TRAIL-induced apoptosis.

Dans nos sociétés modernes, la presbyacousie, perte de l'audition liée au vieillissement, prend une place de plus en plus importante. Outre le vieillissement de la population, la prévalence de la presbyacousie est accentuée par l'exposition à des bruits toujours plus forts (concerts, baladeurs, environnement de travail, ...) et la prise de médicaments ototoxiques (cisplatine, aminoglycosides, ...). À ce jour, le lien entre l'endommagement de l'ADN, le stress oxydant et l'inflammation avec l'apparition précoce de certaines maladies liées au vieillissement (Alzheimer, démence, Parkinson, …) a été démontré. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires et trop peu d'études témoignent de l'existence d'un stress oxydant dans la presbyacousie.Le premier objet de ce travail a donc été d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traités au cisplatine (CDDP). Cet antinéoplasique tire sa cytotoxicité de sa capacité à causer directement des dommages dans l'ADN et est connu pour ses effets nocifs sur l'audition en induisant la dégénérescence des cellules cochléaires. Enfin, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures double brin dans l'ADN des cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM/DNA¬PK-Chk2-p53, de la formation de foyers βH2AX et 53BP1 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Les cellules ciliées internes, plus résistantes au CDDP que les cellules ciliées externes, présentent une signalisation moins intense et un nombre inférieur de cassures double brin, un phénomène qui pourrait expliquer leur plus faible sensibilité. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient les pertes d'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. Le second objectif a porté sur l'étude des effets délétères du vieillissement sur l'audition et les mécanismes moléculaires associés à cette pathologie. Pour ce faire, nous avons choisi les souris SAMP8 (senescence accelerated mice prone 8), un modèle bien établi de sénescence précoce et des maladies liées au vieillissement. Nous avons combiné des approches fonctionnelles, morphologiques, moléculaires et cellulaires pour phénotyper ces souris et identifier l'origine de l'atteinte de leur audition au cours du vieillissement. L'étude des souris SAMP8 nous a permis de montrer qu'elles sont un excellent modèle de presbyacousie mixte (atteinte de la strie vasculaire, de l'organe de Corti et du ganglion spiral), résumant la pathologie humaine. La dégénérescence des structures cochléaires que nous avons observée chez ces souris provient d'une profonde dysfonction mitochondriale, de l'augmentation du stress oxydant et des processus inflammatoires, d'un stress autophagique et de l'endommagement de l'ADN. Les mécanismes moléculaires aboutissant à la perte des cellules cochléaires constituent autant de cibles thérapeutiques à explorer dans l'avenir afin de tenter de prévenir les troubles de l'audition imputables à l'exposition au bruit ou aux médicaments ototoxiques et au vieillissement. / Our modern society is confronted with a dramatic increase in the number of patients suffering from presbycusis or age related hearing loss. Besides aging, presbycusis prevalence increases with exposition to loud noise (concerts, Walkman, work environment …) and ototoxic drugs (cisplatin, aminoglycosides …). It was reported that the early onset of some aging related diseases (Alzheimer, dementia, Parkinson …) are linked mechanistically to DNA damage, oxidative stress and inflammation. However, the role of DNA damages in cochlear cells degeneration is totally unknown and only few studies have investigated the implication of oxidative stress in presbycusis.The first goal of this study consisted in clarifying the role of DNA damage in cochlear cell degeneration. For this purpose, we used molecular and cellular biology approaches to identify the activation of DNA damage response pathways in cisplatin (CDDP) treated 3 days postnatal mouse cochlear explants in culture. Indeed, the cytotoxicity of CDDP arises from its capacity to directly damage DNA. It is also well known that one of the major dose limiting side effects of CDDP is its ototoxicity. Finally, we investigated the role of p53, a key effector of the DNA damage response pathway, in vivo by treating p53 knockout mice with CDDP. Our results show that CDDP induces double strand breaks leading to the activation of ATM-/DNA PK¬ Chk2 p53 pathway, βH2AX and 53BP1 foci formation and, in fine, apoptotic cell death. Inner hair cells, which are more resistant to CDDP treatment than outer hair cells, show a less intense signaling and fewer double strand breaks. This phenomenon could explain their weaker sensitivity to CDDP treatment. In vivo, p53 deletion prevents hearing loss and outer hair cells degeneration induced bay intraperitoneal injection of CDDP.The second goal consisted in studying the deleterious effects of aging on hearing and the molecular mechanisms involved in this pathology. Here, we studied the mechanism of presbycusis using the senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) which is a useful model to probe the effects of aging on biological processes. Based on complementary approaches combining functional, morphological, biochemistry, cellular and molecular biology, we found that the SAMP8 strain displays premature hearing loss and cochlear degeneration recapitulating the processes observed in human presbycusis (i.e. strial, sensory and neural degeneration). The molecular mechanisms associated with premature presbycusis in SAMP8 mice involve oxidative stress, mitochondrial dysfunction, chronic inflammation, autophagic stress and DNA damages. Molecular mechanisms leading to cochlear cells loss represent therapeutic targets of interest to explore in the future in order to prevent hearing impairments due to loud sound or ototoxic drugs exposure and due to aging.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une maladie myéloproliférative, résultant d'une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22, donnant naissance à une kinase de fusion à activité continue, la BCR-ABL. Les inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) sont le traitement de choix de la LMC, mais ces inhibiteurs n'offrent pas de cure radicale aux patients, qui, une fois le traitement interrompu, présentent une rechute et une exacerbation de leur condition. En plus, les patients peuvent développer une résistance ou une intolérance aux ITK, d'où la nécessité de nouvelles modalités thérapeutiques. Les imidazoquinoxalines sont de nouveaux composés à visée anticancéreuse, dont la structure est basée sur celle de l'imiquimod, un immunomodulateur connu. EAPB0203, un composé du groupe des imidazo[1,2-α]quinoxalines, a fait preuve d'un pouvoir anticancéreux sur des cellules de mélanome, in vitro et in vivo, ainsi que sur des cellules de leucémie liée au virus HTLV-1, in vitro. EAPB0503 est un composé de la même famille, à pouvoir environ 10 fois supérieur à celui de l'EAPB0203 sur les cellules de mélanome. Dans le cadre de ce projet de thèse, l'activité de l'EAPB0203 a été comparée à celle de l'EAPB0503, et leur effet sur la prolifération de trois lignées cellulaires de LMC a confirmé que l'EAPB0503 est plus efficace que l'EAPB0203. Pour ce, l'EAPB0503 a été adopté pour la suite des expérimentations que nous avons entreprises dans le but de caractériser le mécanisme d'action par lequel ce composé inhibe la croissance cellulaire. Les CI50 de l'EAPB0503 ont été déterminées pour chacune des trois lignées, et adoptées tout au long du travail. On a démontré que l'EAPB0503 provoque un arrêt du cycle cellulaire en PréG0 (accumulation de cellules apoptotiques) et en G2/M. Une nette augmentation du niveau de phosphorylation de l'histone-3 suggère un arrêt des cellules en début de mitose. Cet arrêt du cycle cellulaire s'accompagne d'une diminution du potentiel membranaire mitochondrial, d'une activation modérée du cytochrome c et du clivage de PARP (suggérant l'implication de caspases). On a également démontré que l'EAPB0503 induit l'apoptose comme le montre la fragmentation de l'ADN. Des résultats préliminaires proposent aussi une stabilisation de la protéine pro-apoptotique, bax, et une diminution du niveau de la protéine anti-apoptotique Bcl-2, augmentant ainsi le rapport Bax/Bcl-2 et renversant ainsi l'équilibre du côté apoptotique. En plus, EAPB0503 a potentialisé l'effet de l'imatinib (le premier ITK), et, à deux, ces deux agents ont eu un effet synergique sur la croissance des cellules de LMC. Il a été également très intéressant de montrer que l'EAPB0503 dégrade l'oncoprotéine, BCR-ABL, dans les cellules sensibles et résistantes à l'imatinib. Ensemble, ces résultats suggèrent un effet prometteur de l'EAPB0503 sur la LMC, en monothérapie ou en association avec les ITK. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder that originates in a reciprocal translocation, resulting in the Philadelphia chromosome that harbors the bcr-abl oncogene. This fusion gene codes for a constitutively active tyrosine kinase, BCR-ABL that confers leukemogenesis. Tyrosine kinase inhibitor (TKI), have revolutionized the therapeutic management of CML. Imatinib, the first generation TKI, is highly effective in inducing remissions and prolonging the survival of CML patients. However, failure of this therapy occurs in almost one-third of the patients due to intolerance to treatment, lack of therapeutic response or resistance. Moreover, CML stem cells (LIC) remain insensitive to this therapy, which almost inevitably leads to relapse upon treatment discontinuation. Imidazoquinoxalines are imiquimod derivatives with direct immunomodulatory effect and antitumor activity on melanoma and T-cell lymphoma, attributed to growth inhibition and induction of caspase-dependent apoptosis. We investigated the effects of EAPB0203 and EAPB0503, novel imidazoquinoxaline derivatives, on human CML cell lines. We show that EAPB0203 and EAPB0503 inhibit cell growth of three CML cell lines in a dose- and time-dependent manner. Compared to the previously described EAPB0203, EAPB0503 has a better inhibitory activity on CML cells. We demonstrated that EAPB0503 induced a specific cell cycle arrest in mitosis in CML cells, evidenced by decreased levels of cyclin D1 and increased phosphorylation of histone-3. This was accompanied by the direct activation of apoptosis as demonstrated by increased PreG0 population, DNA breakage, poly(ADP-ribose) polymerase cleavage and breakdown of mitochondrial membrane potential. Preliminary results have shown a stabilization of the pro-apoptotic molecule, bax, versus a decrease in anti-apoptotic bcl-2, shifting the ratio towards the induction of apoptosis. Interestingly, EAPB0503-treated cells had decreased levels of BCR-ABL oncoprotein. The combination of EAPB0503 with imatinib synergizes to inhibit CML cells proliferation and most importantly, EABP0503 inhibited the proliferation of imatinib-resistant CML cells offering a promising therapeutic modality that alone or in combination with TKI would circumvent mutations and resistance to TKI and improve the prognosis of CML.

Chez les mammifères, les carences nutritionnelles telles que les carences en acides aminés constituent un stress nutritionnel important. Pour faire face à ces situations, l'organisme dispose de processus adaptatifs tels que l'autophagie, régulés par de multiples voies de signalisation. Au niveau cellulaire, plusieurs voies de signalisation sont impliquées dans la régulation de ces processus adaptatifs qui permettent la survie cellulaire lors de différentes conditions de stress environnementaux y compris la carence en acides aminés. En particulie,r la voie eIF2α/ATF4 joue un rôle crucial dans l'adaptation des cellules à ces différents stress notamment en régulant la transcription de nombreux gènes cibles spécifiques. L'objectif de ce travail était donc de déterminer le rôle de la voie eIF2α/ATF4 dans la régulation de la transcription des gènes impliqués dans l'autophagie en réponse à carence en acides aminés. En utilisant p62 comme un modèle de travail, nous avons montré que la kinase GCN2 qui phosphoryle eIF2α et les facteurs de transcription ATF4 et CHOP jouent un rôle clé dans la régulation de la transcription d'un grand nombre de gènes impliqués dans le processus autophagique en réponse à une carence en acides aminés. Nous avons en particulier identifié 3 classes de gènes de l'autophagie selon leur dépendance à ATF4 et CHOP et la liaison de ces facteurs sur les éléments spécifiques de leurs promoteurs en fonction de l'intensité du stress. PLus généralement, nous avons démontré que ce mécanisme pouvait également être activé par la kinase PERK lors d'un stress du réticulum endoplasmique. Enfin, nous avons pu montrer que durant les 6 premières heures de la carence en acides aminés, la voie eIF2α/ATF4/CHOP n'est pas impliquée dans la diminition de la viabilité cellulaire. Cependant, lorsque la carence en acides aminés est prolongée (16-48h), CHOP joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose et dans la répression du processus autophagique en contrôlant la transcription des gènes cibles spécifiques. Ainsi, ce travail a permis de mettre en évidence qu'en cas de carence en acides aminés, la voie eIF2α/ATF4/CHOP joue un rôle clé dans le devenir de la cellule. En fonction de la durée et de l'intensité du stress, la régulation très coordonnée de ces mécanismes moléculaires va permettre successivement la survie de la cellule et ensuite l'apoptose. / In mammals nutritional deficiencies such as amino acid limitation are an important nutritional stress. To deal with these situations, the body has adaptive processes such as autophagy regulated by multiple signaling pathways. At the cellular level, several signaling pathways are involved in the regulation of these adaptive processes that allow cell survival in different conditions of environmental stress, including amino acid deficiency. In particular, the eIF2α/ATF4 pathways plays a crucial role in the adaptation of these cells to various stresses such as the transcriptional regulation of many specific target genes. The aim of this work was to identify the role of the eIF2α/ATF4 pathway in the stress-regulated transcription of mammalian autophagy genes. Using p62 as a working model, we have shown that the GCN2 eIF2α-kinase and ATF4 and CHOP transcription factors are required to increase transcription of a set of autophagy genes implicated in the formation, elongation and function of the autophagosome. We also identify 3 classes of autophagy genes according to their dependence on ATF4 and CHOP and the binding of these factors to specific promoter cis elements. Furthermore, different combinations of CHOP and ATF4 bindings to target promoters allow the trigger of a differential transcriptional response according to the stress intensity. Furthermore, we have demonstrated that the same mechanism can also be activated by ER stress through PERK eIF2α-kinase activation. We also show that during the first 6h of starvation, CHOP up-regulates a number of autophagy genes while cell viability is not affected. By contrast, when the amino acid starvation is prolonged (16-48h), we demonstrated that CHOP has a dual role in both limiting autophagy and inducing apoptosis through the transcriptional activation of specific target genes. Thus, this work establishes that following amino acid starvation, the eIF2α/ATF4 pathway plays a key role in the cell fate. Depnding on the duration and intensity of the stress, the highly coordinated regulation of these molecular mechanisms sequentially will allow the survival of the cell and subsequently apoptosis.