A febre Zika é uma enfermidade que afeta pessoas de países tropicais e subtropicais. O agente etiológico da doença é o vírus Zika (ZIKV), um flavivirus de genoma RNA de fita simples, transmitido principalmente por mosquitos do gênero Aedes. Devido a associação do ZIKV à microcefalia e síndrome de Guillain-Barré é necessário desenvolver estratégias para a prevenção da doença. Entre eles, a melhor medida profilática é a vacinação. A proteína NS3 tem sido relatada como um potencial ativador da imunidade celular contra o ZIKV e outros flavivírus, cuja atuação tem sido utilizada como um alvo contra infecções virais. Neste contexto, o objetivo deste projeto foi testar a eficiência da NS3 como ativadora da resposta imunológica e, em combinação com o vírus inativado, produzir uma vacina capaz de desenvolver proteção total contra a infecção viral. Uma sequência da NS3 foi clonada no vetor pET-26b, expresso em E. coli Rosetta e purificado por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A completa inativação do ZIKV foi realizada por meio de adição de formaldeído 0,05% e incubação por 3 dias. Combinações vacinais de NS3 e vírus inativado foram inoculados em vários grupos de camundongos 129 Sv/Ev e A129 nos dias 0 e 14. No dia 21, os camundongos A129 vacinados foram desafiados com o ZIKV selvagem e analisados segundo a perda de peso e sobrevivência por 21 dias. Os camundongos vacinados com NS3 e vírus inativado, na mesma formulação vacinal, tiveram 100% de proteção contra o ZIKV infeccioso. O sangue total e o baço foram coletados dos camundongos 129 Sv/Ev e A129 após 21 dias de uma nova imunização. Foi avaliado a produção de anticorpos específicos e neutralizantes contra ZIKV por ELISA e PRNT, mostrando que animais imunizados com a formulação vacinal \"vírus inativado com NS3\" produzem mais anticorpos contra o vírus, porém não foi detectado neutralização do vírus em nenhum grupo imunizado. O perfil de citocinas expressas por linfócitos do baço, analisado por FACS, sugere que a NS3 participa na modulação para uma resposta Th1. Esta abordagem possibilitou a avaliação de uma combinação vacinal que se mostrou capaz de prevenir a infecção com o ZIKV em camundongos susceptíveis / Zika Fever is a disease that affects many people in tropical and subtropical countries. The etiologic agent is Zika Virus (ZIKV), a single-stranded RNA flavivirus, transmitted mostly by Aedes mosquitoes, but sexual, congenital and blood transfusion transmission has also been reported. Due to the possible association of ZIKV to microcephaly and Guillain-Barré Syndrome, it is necessary to develop strategies for disease prevention. Among them, the best prophylactic measure is vaccination. The non-structural protein NS3 has been shown to stimulate cellular immunity response against others flaviviruses, and such activity has been used as a target against other flaviviruses infection. In this context, the aim of this project is to test the efficiency of NS3, in combination with the inactivated virus, to produce a vaccine capable of developing full protection against viral infection. The NS3 sequence was cloned into the pET-26b vector, expressed in E. coli Rosetta and purified by nickel column affinity chromatography. The complete inactivation of ZIKV was performed by addition of 0.05% formaldehyde and incubation for 3 days. Vaccine combinations of NS3 and inactivated virus were inoculated into 129 Sv/Ev and A129 mice on days 0 and 14. On day 21, vaccinated A129 mice were challenged with wild ZIKV and analyzed for weight loss and survival by 21 days. Mice vaccinated with NS3 and inactivated virus, in the same vaccine formulation, had 100% protection against infectious ZIKV. Whole blood and spleen cells were collected from 129 Sv/Ev and A129 mice after 21 days of new immunization. The production of specific and neutralizing antibodies against ZIKV was evaluated by Imunnofluorescence, ELISA and PRNT, showing that animals immunized with the vaccine formulation \"virus inactivated with NS3\" increased the antibodies\' level against the virus, but no virus neutralization was detected in any immunized group. The cytokine profile expressed by spleen lymphocytes, analyzed by FACS, suggests that NS3 participates in modulation for a Th1 response. This approach gave us the opportunity to evaluate this vaccinal combination that was shown to be able to prevent infection with ZIKV in susceptible mice

Rondônia apresenta área com rica diversidade de artrópodes, porém pouco se conhece sobre a transmissão de arbovírus por estas espécies. O presente trabalho visou detectar arbovírus, por meio da RT-PCR e da Duplex RT-PCR, nas espécies de dipteros coletados no Estado, bem como caracterizá-los pela reação de sequenciamento. A RT-PCR e a Duplex RT-PCR detectaram as suspensões dos vírus Mayaro e Oropouche até 104 e 101 TCID50/mL, respectivamente, porém o vírus Dengue 2 em pools contendo menos de três mosquitos infectados foi negativa. O controle endógeno foi detectado em 66,8 % das amostras, sendo que, em pools contendo entre um e três mosquitos, a detecção foi aproximadamente metade da detecção nos pools contendo entre 11 e 15. Em 0,66 % dos pools foi encontrado o vírus Oropouche e em outros 0,66 %, o vírus Cacipacoré. O vírus Oropouche foi detectado em Coquillettidia sp. e Deinocerites sp., enquanto o vírus Cacipacoré foi encontrado em Anopheles sp. e Culex sp. As técnicas possibilitaram a detecção dos arbovírus pesquisados nos pools coletados em Rondônia. / The Rondônia state has an area with rich arthropods diversity although the knowledge about the arboviruses transmition for these species is poor. The present work aimed to detect arboviruses through RT-PRC and RT-PCR Duplex in the diptera species collected in the region as well as their characterization through the sequence reaction. The RT-PRC and RT-PCR Duplex detected the Mayaro and Oropouche virus suspensions until 104 e 101 TCID50/mL respectively, although it was negative for the Dengue 2 virus in pools containing less than three infected mosquitoes. The endogenous control was detected in 66,8 % of samples and from pools containing from one to three mosquitoes the detection rate was approximately half from that obtained from pools with 11 to 15 mosquitoes. Oropouche virus was found in 0,66 % of pools and Cacipacore virus also in 0,66 % of pools. Oropouche virus was detected in Coquillettidia sp. and Deinocerites sp. while Cacipacoré virus was found in Anopheles sp. and Culex sp. The techniques allowed the detection of examined arboviruses in the pools collected from Rondonia.

Realizou-se estudo analitico transversal relacionando caracteristicas individuais e familiares de 182 moradores pertencentes a 58 famílias de área de reserva ecológica à presença de infecções por arbovirus e hantavirus de interesse sanitário local. Pesquisou-se anticorpos para os antigenos dos virus Rocio, Ilhéus, da encefalite de st. Louis, das encefalites equinas do leste, oeste e venezuelana e Hantaan. Foram utilizados os testes de inibição de hemaglutinação, neutralização com redução de placas, imunofluorescência indireta e ensaio imunoenzimático com captura de anticorpos IgM (MAC-ELISA).· A associação estatistica foi pesquisada utilizando-se o teste de qui-quadrado e o grau de associação foi obtido calculando-se o odds ratio. Também foram pesquisadas a sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo e negativo das caracteristicas investigadas para avaliar seu poder de discriminar infectados de não infectados e de predizer infecções por arbovirus e hantavirus. A prevalência observada de anticorpos para arbovirus nos individuos foi de 26,9% e nas familias foi de 62,1%. Observou-se uma prevalência de 1,6% de anticorpos para hantavirus nos individuos e 5,2% nas familias. Não foram encontrados anticorpos para o virus da encefalite equina do oeste e nem anticorpos da classe IgM para os antigenos testados. Entre as caracteristicas estudadas, a idade, a ocupação, a naturalidade e o hábito de entrar na mata mostraram-se fatores de risco para infecções por arbovirus. Foram considerados fatores preditivos de infecção por arbovirus a presença de galinheiro anexo à casa, o hábito de criar galinhas e a presença de ratos no domicilio. Não foram observados fatores de risco ou de predição para infecção por hantavirus entre as caracteristicas estudadas. Os resultados obtidos sugerem que as caracteristicas, que mostraram ser fator de risco ou predição, poderiam ser usadas no diagnostico presuntivo preliminar de infecções por arbovirus e hantavirus, permitindo priorizar medidas de intervenção. O uso de um questionário ofereceria aos serviços de saúde ferramenta de simples aplicação e baixo custo, especialmente em condições de campo em áreas que, como a estudada, dispõe de escassos recursos humanos e laboratoriais. / In order to identify risk factors and predictive factors to arbovirus and hantavirus infections among individual and family characteristics, a cross-sectional study was carried out among 182 persons belonging to 58 families living at ecological reserve. The characteristics were associated with the presence of antibodies to the following virus of local interest: Hantaan, Rocio, Ilheus, Eastern, Western and Venezuelan equine encephalitis virus and st. Louis encephalitis virus using inhibition hemagglutination test, plaque reduction neutralization test, indirect immunofluorescence test and immunoglobulin M antibody capture enzyme immunoassay (MAC-ELISA). The associations were calculated using chi-square statistics and the odds ratio. Sensitivity, especificity, positive and negative predictive values of the individual and familiar characteristics were also analyzed to evaluate their capacity to discriminate between infected and non-infected people and to predict arbovirus and hantavirus infections. The prevalence of antibodies to arbovirus was 26.9% and 62.1% of the families had at least one member infected by these agents. Hantavirus antibodies were found in 1.6% of the sera analysed and 5.2% of the families had members infected by these agents. Antibodies to western equine encephalitis virus were not found. IgM antibodies were not observed sugesting no recent infection for those agents in that population. Age, ocupation, nativity and the habit to enter the forest were shown to be risk factors to arbovirus infections. The presence of annexes to the house, to breed chickens and the presence of rodents inside the house were considered predictive factors to arbovirus infections. Risk or predictive factors to hantavirus infections were not observed. The results suggest the use of some of the individual or family characteristics as a tool on the surveillance of arbovirus infections, to discriminate people with major probability of infections, specially in fie1d conditions, where human and laboratorial resources are scarce.

Introdução: Arbovírus são vírus transmitidos por artrópodos, pertencendo, principalmente, aos gêneros Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus). Os Flavivirus, em sua maioria, são associados a zoonoses, causando doenças humanas febrís, febres hemorrágicas e encefalites. Inclusive, causam epidemias que são sério problema de saúde pública. Este estudo mostra uma pesquisa de Flavivirus em culicídeos, de diferentes regiões do país, utilizando uma técnica para identificação viral por RT-PCR com primers Flavivirusespecíficos e uma Multiplex-nested-PCR com primers espécie-específicos. Métodos: Culicídeos foram capturados, quantificados, identificados, agrupados em lotes por espécie e congelados. No laboratório, os animais foram macerados e tiveram o RNA extraído. Estes extratos foram submetidos a RT-PCR gênero-específica e à Multiplex-nested-PCR, para detecção e identificação dos vírus a nível de espécie. Resultado: De 3317 culicídios adultos e 571 larvas coletados em 4 diferentes regiões do Brasil, Sul, Sudeste, Norte e Nordeste, fez-se 246 lotes de mosquitos e desses foi possível obter amplicon sugestivo de Flavivirus em 16 (6,5%). Em 3 lotes contendo larvas de Aedes albopictus obteve-se amplicon sugestivo de vírus do dengue tipo 3. Também, em 13 lotes contendo Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti e Aedes albopictus foi possível obter amplicons sugestivos de vírus do dengue tipos 1 e 2. Dos amplicons obtidos, 4 tiveram nucleotídios seqüenciados o que permitiu confirmar a presença dos vírus do dengue tipo 3 e Cacipacoré. Conclusão: O trabalho permitiu concluir que: a metodologia de RT-PCR para Flavivirus seguida de Multiplex-nested-PCR espécie-específica foi adequada para detecção e identificação destes vírus em culicídios; amplificaram-se genomas de Flavivirus em 6,5% dos lotes de culicídios estudados; vírus do dengue tipo 1 e tipo 2 foram encontrados infectando Aedes aegypti de Santos em 1999, Manaus em 2005-2006 e Foz do Iguaçu; vírus do dengue tipos 2 e 3 foram encontrados em Aedes albopictus de Santos em 1999 e Manaus em 2005-2006, sugerindo que este mosquito participe na transmissão de dengue; vírus do dengue tipo 3 foi encontrado em larvas de Aedes albopictus mostrando transmissão vertical do vírus; vírus do dengue tipo 1 foi encontrado infectando Haemagogus sp. sugerindo existência de ciclo silvático deste vírus; Aedes aegypti do Amazonas estavam infectados com o vírus Cacipacoré. / Introduction: Arbovirus are rodent-borne viruses mostly from Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus) genus. Flavivirus, are commonly zoonotic and can cause febrile illness, haemorrhagic fever and encephalitis. Flavivirus outbreaks occur in Brazil and are a major public health problem. We show here a research looking for Flavivirus infections in Culicidae by a RT-PCR using Flavivirus-especific primers and a Multiplex-nested-PCR using specie-specific primers for virus identification. Methods: Culicidae were captured, quantified, identified, pooled based on the specie and frozzen. In the laboratory, the animals were crushed and had the RNA extracted. These extracts were tested by a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR. Results: From 3317 captured adult Culicidae and 571 collected larvae in 4 different regions of Brazil, 246 pools were obtained and from these, Flavivirus indicative amplicons were obtained in 16 (6.5%). Amplicons of dengue type 3 were obtained from 3 pools of Aedes albopictus larvae. It was also possible to obtain indicative amplicons of dengue types 1 and 2 in 13 pools of Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti and Aedes albopictus. Besides, 4 amplicons had the nucleotides sequenced, confirming the mosquito infection by dengue type 3 and Cacipacoré viruses. Conclusion: The technique combining a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR was suitable for detection of these viruses in the mosquitoes; Flavivirus infecting Culicidae were detected in 6.5% of the analyzed mosquito pools; dengue virus type 1 and type 2 were found infecting Aedes aegypti from Santos (1999), Manaus (2005-2006) and Foz do Iguaçu cities; dengue type 2 virus was found in Aedes albopictus from Santos city (1999) and Manaus city (2005-2006), suggesting that this mosquito could be participating on dengue transmition; dengue type 3 virus was found in Aedes albopictus larvae showing the vertical transmission of this virus; dengue type 1 virus was found infecting Haemagogus sp. what suggests on the existence of a sylvatic maintenance cycle of this virus; Aedes aegypti from Amazonas state were found infeted by Cacipacoré virus.

Devido a existência de 2 alphavírus artritogênicos no Brasil, os vírus Mayaro (MAYV) e Chikungunya (CHIKV) tornou-se importante desenvolver testes diagnósticos eficazes para discriminar suas infecções. No presente trabalho, desenvolvemos ELISAs indiretos para diagnóstico de CHIKV e MAYV utilizando proteínas de envelope viral E2 recombinantes, produzidas em Escherichia coli, as rE2-CHIKV e rE2-MAYV ELISAs. As proteínas E2 recombinantes tiveram suas antigenicidades verificadas nos ensaios utilizando anticorpos policlonais oriundos de camundongos hiperimunizados com CHIKV, MAYV e outros alphavírus. O rE2-CHIKV ELISA detectou anticorpos murinos de forma homotípica e não produziu reações cruzadas evidenciáveis utilizando anticorpos murinos específicos contra outros Alphavírus. O rE2-MAYV ELISA detectou anticorpos murinos homotípicos e também, reagiu cruzadamente com anticorpos murinos anti-CHIKV, mas não para outros Alphavírus. Esses ELISAs, também, foram usados na detecção de anticorpos em soros de pacientes com suspeita de infecção arboviral. Pelo o rE2-CHIKV ELISA, testaram-se 59 soros, resultando em 26 amostras IgG positivas. Resultados desse ELISA, quando comparados aos obtidos por teste de neutralização, demonstraram sensibilidade de 89,66% e especificidade de 100%. Soros humanos IgG positivos foram detectados em altas diluições pelo rE2-CHIKV ELISA. Quanto a detecção de IgM, o rE2- CHIKV ELISA apresentou moderada concordância com outros ensaios sorológicos. Com rE2- MAYV ELISA, testaram-se 68 soros resultando em 23 amostras IgG positivas, das quais 11 também mostraram-se positivas em teste de neutralização, demonstrando sensibilidade de 100% e especificidade de 78,95%. Portanto, os rE2-CHIKV e rE2 MAYV ELISAs, particularmente para detecção de IgG, mostraram-se adequadamente sensíveis e específicos para serem validados em estudos com maiores números de amostras e serem aplicados ao diagnóstico de pacientes infectados com CHIKV e MAYV. / Due the existence of 2 arthritogenic alphaviruses in Brasil, the viruses Mayaro (MAYV) and Chikungunya (CHIKV), it became important the development of efficient diagnose tests to discriminate their infections. In the present work, we developed indirect ELISAs for CHIKV and MAYV diagnosis using viral recombinant envelope proteins E2, produced in Escherichia coli, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV. The recombinant E2 proteins had their antigenicity confirmed in the assay by using polyclonal antibodies produced in hyperimmunized mice with CHIKV, MAYV and other alphaviruses. The rE2-CHIKV ELISA detected homotypic murine antibodies and did not produced detectable cross-reactivity signal when using murine antibodies from other alphaviruses. The rE2-MAYV ELISA detected homotypic antibodies and also cross-reacted with murine anti-CHIKV antibodies, but not to other alphaviruses. These ELISAs were also tested for the detection of human antibodies, using patient sera suspected of arboviral infection. For rE2- CHIKV ELISA, it were tested 59 sera, resulting in 26 positive IgG samples. These ELISA results, when compared to those of a neutralizing assay, demonstrated a sensibility of 89.66% and specificity of 100%. The IgG positive human sera were detected in high dilutions by rE2-CHIKV ELISA. Regarding the detection of IgM, the rE2-CHIKV ELISA showed a moderate samples detection agreement when compared to other serologic assays. For rE2-MAYV ELISA, it were tested 68 sera, resulting in 23 positive IgG samples, of which 11 demonstrated to be positive by the neutralization assay, demonstrating a sensibility of 100% and specificity of 78.95%. Therefore, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV ELISAs, especially for IgG detection, demonstrated to be properly sensitive and specific to be validated in studies using a greater number of samples, and also to be applied in the diagnosis of infected CHIKV and MAYV patients.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-06T15:00:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoGeneticaCorrelacao.pdf: 1121868 bytes, checksum: 415ebcd4b13b4d4226cb0c72c7ce83f3 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-11T12:01:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoGeneticaCorrelacao.pdf: 1121868 bytes, checksum: 415ebcd4b13b4d4226cb0c72c7ce83f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-11T12:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoGeneticaCorrelacao.pdf: 1121868 bytes, checksum: 415ebcd4b13b4d4226cb0c72c7ce83f3 (MD5) Previous issue date: 2005 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Até o presente momento, estudos moleculares para os vírus do grupo C (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) não foram publicados. O presente trabalho determinou as seqüências nucleotídicas completas para os segmento ARN pequenos (P-ARN) e a seqüencias parciais para os segmentos de ARN médio (M-ARN) dos vírus do grupo C. A seqüencia completa do segmento P-ARNvariou de 915 a 926 nucleotídeos, e revelou organização genômica semelhante em comparação aos demais ortobunyavírus. Baseado nos 705 nt do gene N, os membros do grupo C foram distribuídos em três grupos filogenéticos principais, com exceção do vírus Madrid que foi posicionado fora destes três grupos. A análise da cepa BeH 5546 do vírus Caraparu revelou que o mesmo apresenta seu segmento P-ARN semelhante ao do vírus Oriboca , sendo um vírus rearranjado em natureza. Em adição, a análise dos 345 nt do gene Gn para sete vírus do grupo C e para a cepa BeH 5546, revelou uma diferente topologia filogenética, sugerindo um padrão de rearranjo genético entre estes vírus. Estes achados representam as primeiras evidências de rearranjo genético em natureza entre os vírus do grupo C, dos quais vários são patógenos humanos. Finalmente, nossos dados genéticos corroboraram dados de relacionamento antigênico entre esses vírus determinados utilizando métodos sorológicos (testes de fixação de complemento, inibição da hemaglutinação e neutralização), sugerindo que a associação de dados informativos aos níveis molecular, sorológico e eco-epidemiológico podem contribuir para o melhor entendimento da epidemiologia molecular dos ortobunyavírus. / To date, no molecular studies on group C viruses (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) have been published. The current work determined the complete small RNA segment and partial medium RNA segment nucleotide sequences for group C members. The full-length SRNA sequences ranged from 915 to 926 nucleotides in length, and revealed similar organization in comparison with other orthobunyaviruses. Based on the 705 nt of the N gene, group C members were distributed into 3 major phylogenetic groups, with the exception of Madrid virus that was placed outside of these 3 groups. Analysis of the Caraparu virus strain BeH 5546 revealed that it has an SRNA sequence nearly identical to that of Oriboca virus and is a natural reassortant virus. In addition, analysis of 345 nucleotides of the Gn gene for seven group C viruses and for strain BeH 5546 revealed a different phylogenetic topology, suggesting a reassortment pattern among them. These findings represent the first evidence for natural reassortment among the group C viruses, which include several human pathogens. Furthermore, our genetic data corroborate previous antigenic relationships determined using serologic assays (complement fixation, hemagglutination inhibition and neutralization tests), and suggest that a combination of informative molecular, serological and ecological data is a helpful tool to understand the molecular epidemiology of orthobunyavirus.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-06T15:23:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularRelacao.pdf: 11801506 bytes, checksum: dc0762bdd154df39d7db36795157bb81 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-12T13:10:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularRelacao.pdf: 11801506 bytes, checksum: dc0762bdd154df39d7db36795157bb81 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-12T13:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularRelacao.pdf: 11801506 bytes, checksum: dc0762bdd154df39d7db36795157bb81 (MD5) Previous issue date: 2009 / Os flavivírus são conhecidos por seu complexo ciclo biológico e importância na saúde pública e na economia mundial. Os aspectos ecológicos e quadros clínicos estão estreitamente relacionados à filogenia e evolução dos flavivírus. Este trabalho objetiva a caracterização molecular dos genomas dos flavivírus Bussuquara (VBSQ), Iguape (VIGU), Ilhéus (VILH) e Rocio (VROC), determinando relações filogenéticas com os demais integrantes do gênero Flavivirus. Foi realizado o seqüenciamento completo da região codificadora (ORF) e regiões não codificantes (RNC) 5’ e 3’; análise da estrutura secundária do RNA viral e das sequências conservadas da 3’RNC; determinação dos sítios de clivagem, glicosilação, resíduos Cis e motivos conservados na poliproteína; e as análises de similaridade e filogenética. Os genomas dos VBSQ, VIGU, VILH e VROC apresentaram a mesma organização que os demais flavivírus, medindo 10.815 nt, 10.922 nt, 10.775 nt, 10.794 nt, respectivamente. O padrão das sequências conservadas da 3’RNC do VBSQ foi RCS2-CS2-CS1, enquanto que para os VIGU, VILH e VROC foram CS3-RCS2-CS2-CS1. As características das estruturas secundárias do RNAs dos flavivírus em estudo foram similares aos demais flavivírus. O número dos sítios de glicosilação das proteínas PrM, E e NS1 foi distinto entre os flavivírus brasileiros, porém o padrão 6,12,12 dos resíduos de Cis e do sítios de clivagem permaneceram conservados. Na proteína E, alterações aminoacídicas pontuais foram observadas no peptídeo de fusão dos VBSQ, VIGU e VROC, e a sequência do tripepídeo RGD foi distinta para os quatro vírus em estudo. Os motivos determinantes das atividades de MTase-SAM da NS5, bem como da helicase e protease da NS3, permanecem conservados. Dentre os oito motivos da polimerase viral (NS5), somente os motivos V, VI e VII possuem alguma substituição nucleotídica para o VILH e VROC. As análises de similaridade mostram que VBSQ apresenta maior relação com VIGU enquanto que o VILH e VROC são mais relacionados entre si, porém sendo consideradas espécies virais distintas. Com base nas análises filogenéticas, características moleculares do genoma e biológicas, propõem-se a formação de três grupos genéticos: o grupo Rocio, que agrupa VROC e VILH; o grupo Bussuquara formado pelos VBSQ e Vírus naranjal e o grupo Aroa que inclui o Vírus Aroa e VIGU. / Flaviviruses have been known due their complex biological cycle and their relevance in public health and global economy. The ecologic aspected and clinic pictures are related with phylogeny and evolution of flaviviruses. This work aims the molecular characterization of Bussuquara (BSQV), Iguape (IGUV), Ilheus (VILH) e Rocio (VROC) flaviviruses genomes, determining their phylogenetic relationships with others members of genus Flavivirus. The study included: the full-length sequencing of the four Brazilian flaviviruses; analyzes of the predictive secondary structure of RNA and conserved sequences in the 3’NCR; determination of cleavage and glicosilation sites, cisteine residues and conserved motifs in the polyprotein; and similarity and phylogenetic analyzes. The BSQV, IGUV, VILH and VROC genomes present 10815 nt, 10922 nt, 10775 nt, and 10794 nt, respectively. The conserved standard sequences in 3’NCR of BSQV was RCS2-CS2-CS1, while to IGUV, ILHV and ROCV were CS3-RCS2-CS2-CS1. The secondary structure of RNA obtained for the Brazilian flaviviruses were similar to the other flaviviruses. The numbers of the glicosilation sites to PrM, E and NS1 proteins were distinct among the studied Brazilian flaviviruses, therefore the pattern 6,12,12 Cis residues and the cleavage sites were conserved. In the E protein, some singles mutations were observed in fusion peptide of BSQV, IGUV and ROCV, and the RGD motif were distinct for the flaviviruses under study. The motif that determines the MTase-SAM activity in NS5, as well as the helicase and protease activity in NS3 were conserved. Among the eight polimerase motifs in NS5, only the V, VI and VII motifs were observed single mutations in ILHV and ROCV. The similarity analyzes showed that BSQV presents high relationship with VIGU, while ILHV and ROV were more related among themselves, however those viruses were considerated distincts species. Based in the phylogenetic analyzes, molecular and biological characteristics, it was proposed the establishment of three distinct genetic groups: the Rocio group, grouping ILHV and ROCV, Bussuquara group formed by BSQV and Naranjal virus; and Aroa group, that include Aroa virus and IGUV.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-10T12:10:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoMolecularCepasVirus.pdf: 1867488 bytes, checksum: d9b8346d11c562383d6eacefda707681 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-04-07T16:31:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_CaracterizacaoMolecularCepasVirus.pdf: 1867488 bytes, checksum: d9b8346d11c562383d6eacefda707681 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-07T16:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_CaracterizacaoMolecularCepasVirus.pdf: 1867488 bytes, checksum: d9b8346d11c562383d6eacefda707681 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2009 / A febre do dengue é uma das mais importantes arboviroses distribuída por todas as áreas tropicais do mundo. O vírus dengue (VDEN) é transmitido principalmente pela picada do mosquito Aedes aegypti infectado. A dispersão do vetor e o aumento do fluxo migratório entre países possibilitaram a ocorrência de grandes epidemias e manifestações clínicas severas, como febre hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do choque do dengue (SCD). O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular de isolados do VDEN sorotipo 1 (VDEN-1) no Brasil ao nível dos genes estruturais C/prM/M/E de 29 cepas isoladas durante epidemias ocorridas no Brasil no período de 1994 a 2008. A identidade nucleotídica entre as cepas de VDEN-1 do estudo em relação às outras isoladas no Brasil variou de 96,1% a 100%, enquanto o percentual de identidade de aminoácidos foi determinado entre 98,4% a 100%. As diferenças de aminoácidos entre as cepas do estudo, quando comparadas com a cepa FGA/89 (Guiana Francesa), mostraram a presença de importantes substituições não-sinônimas com mudança de caráter bioquímico, tais como os resíduos E297 (Met Tre) e E338 (Ser Leu), sendo necessário estudos para verificar se essas alterações podem ou não estar relacionadas à virulência. A análise filogenética para a proteína E, realizada por meio do método de máxima verossimilhança para as cepas do estudo e outras cepas selecionadas do banco de dados do Genbank, mostraram que as cepas de VDEN-1 isoladas no Brasil desde 1982 pertencem ao genótipo V, corroborando com os resultados publicados anteriormente. O tempo de divergência do VDEN-1, estimado através da hipótese de relógio molecular, mostrou que este vírus teve sua origem a partir de uma linhagem ancestral, há aproximadamente, 113 anos e observou-se ainda que as cepas de VDEN-1 circulantes no Brasil e as provenientes da África possuem um ancestral comum, sendo necessário estudos de filogeografia que mostrem as possíveis rotas de entrada do VDEN-1 no Brasil. / Dengue fever is one of the most important arboviral disease distributed to all tropical areas of the world. Dengue virus (DENV) is transmitted mainly by the bite of infected Aedes aegypti mosquitoes. The dispersion of the vector and the increase of migration between countries caused the occurrence of major epidemics and severe clinical manifestations, such as the dengue hemorrhagic fever (DHF) and the dengue shock syndrome (DSS). The objective of this study was the molecular characterization of isolates of DENV-1 in Brazil at the level of structural genes C / prM / M / E of 29 strains isolated during outbreaks occurred in Brazil between 1994 and 2008. The nucleotide identity among strains of this DENV-1 study compared with other strains isolated in Brazil ranged from 96.1% to 100%, while the percentage of amino acid identity was determined between 98.4% to 100%. The amino acid differences between strains of the study, compared with the strain FGA/89 (French Guiana) showed the presence of important non-synonymous substitutions change of the amino acid biochemical character, such as the E297 residue (Met Thr) and E338 (Ser Leu), more detailed studies are needed to investigate if any of them may be related to DENV-1 virulence. The phylogenetic analysis of the E gene, performed using the maximum likelihood method for the studied strains and other strains selected from the database of GenBank showed that the DENV-1 isolates from Brazil since 1982 belonged to genotype V, confirming previously published data. The time of divergence of DENV-1, estimated by molecular clock method, showed that this virus was originated from an ancestral lineage, there are approximately 113 years and it was also observed that DENV-1 strains circulating in Brazil and those from Africa have a common ancestor, and finally it is necessary phylogeographic studies to show the possible routes of entry of DENV-1 in Brazil.

Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. / The brazilian Amazon region maintains the largest variety of arboviruses and the state of Pará is responsible for 26% of this territory, so the major goal of this work was to determine the prevalence and distribution of HI antibodies to 19 domestic arbovirus in domestic herbivores in the state of Pará and to standardize an indirect sandwich IgG ELISA test to serum samples of equines, cattle, buffaloes and sheep. In all species studied and throughout the State of Pará a large prevalence of HI antibodies to all arbovirus analyzed was observed and SLEV, ILHV, EEEV, MAGV and WEEV, showed higher prevalence, where the SLEV was the most prevalent. Regarding the virus families HI antibodies to MAGV was the most prevalent Bunyaviridae in all species, the most prevalent Flaviviridae was SLEV in all species and in the family Togaviridae the EEEV was more prevalent in horses. In order to analyze the prevalence of HI antibodies by animal species was observed that horses did not show significant differences compared to buffaloes, however, showed significant difference compared to cattle and sheep; there was not observed significant difference between the ruminant species. Using sandwich indirect IgG ELISA a large number of crossed reactions were found. This enzymatic test can be used to detect IgG antibodies among families of arboviruses studied. / A região Amazônica brasileira mantém a maior variedade de arbovírus e o estado do Pará corresponde a 26% desse território, o presente trabalho teve como objetivo determinar a prevalência e a distribuição de anticorpos detectados por inibição de hemaglutinação (IH) para 19 arbovírus em herbívoros domésticos no estado do Pará e padronizar testes de ELISA sanduíche indireto em equinos, bovinos, bubalinos e ovinos. Em todas as espécies de animais estudadas e em todo estado do Pará ocorreu detecção de anticorpos para todos os arbovírus analisados dentre os quais os SLEV, ILHV, EEEV, MAGV e WEEV apresentaram maior prevalência de anticorpos IH, sendo o SLEV o mais prevalente. Na detecção de anticorpos para diferentes famílias de arbovírus o MAGV foi o mais prevalente da família Bunyaviridae em todas as espécies, o SLEV foi o mais prevalente da família Flaviviridae em todas as espécies, na família Togaviridae o EEEV foi mais prevalente em equinos. Ao analisar a prevalência de anticorpos IH por espécie animal foi observado que os equinos não apresentaram diferença significativa em relação aos bubalinos, porém, apresentaram diferença significativa maior em comparação aos bovinos e ovinos, não havendo diferença significativa entre as espécies de ruminantes. O uso de ELISA IgG sanduíche indireto apresentou grande frequência de reações sorológicas cruzadas entre as famílias de arbovírus estudadas.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-12-10T00:18:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_InfluenciasEnvelhecimentoAmbiente.pdf: 5043918 bytes, checksum: 38ff3e48cc43245979d10c78262b8062 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-12-11T12:59:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_InfluenciasEnvelhecimentoAmbiente.pdf: 5043918 bytes, checksum: 38ff3e48cc43245979d10c78262b8062 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-11T12:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Tese_InfluenciasEnvelhecimentoAmbiente.pdf: 5043918 bytes, checksum: 38ff3e48cc43245979d10c78262b8062 (MD5) Previous issue date: 2014 / O enriquecimento ambiental e os efeitos do envelhecimento sobre as alterações morfológicas das micróglias e no comportamento foram investigados em modelo murino de encefalite sub-letal por arbovírus. Para medir possíveis influências da idade e do ambiente sobre a progressão da encefalite, camundongos suíços albinos fêmeas de 2 meses de idade foram mantidos em Ambiente Padrão (AP) ou em Ambiente Enriquecido (AE), durante: 6 meses (Adulto - A) e 16 meses (Senil –S). Após os testes comportamentais, os camundongos A e S foram inoculados intranasalmente com igual volume de homogenado de cérebro de camundongo infectado pelo vírus Piry (Py) ou homogenado de cérebro de camundongo normal. Oito dias após a inoculação (8DPI), quando os primeiros testes comportamentais revelaram as alterações relacionadas à doença, os cérebros foram seccionados e inumomarcados seletivamente para IBA-1 e antígenos virais. Aos 20 ou 40DPI, os animais restantes foram testados comportamentalmente e processados para os mesmos marcadores e nenhum sinal neuropatológico foi detectado. Em camundongos adultos infectados o ambiente padrão (APPyA), a atividade de burrowing diminuiu e se recuperou rapidamente (8-10DPI), a atividade de campo aberto (20-40DPI), mas manteve-se inalterado em animais da mesma idade e de ambiente enriquecido (AEPyA). Em contraste animais senis tanto de ambiente enriquecido (AEPyS) quanto de ambiente empobrecido (APPyS) reduzem significativamente a atividade de burrowing em todas janelas. A encefalite causada pelo virus Piry, induziu perdas olfativas transitórias em animais APPyA e AEPyA, mas permanents em APPyS e AEPyS. A imunomarcação para os antígenos viral do Piry atingiram seu pico no parênquima do SNC aos 5 e 6DPI e desapareceu aos 8DPI. Todas as reconstruções tridimensionais das micróglias, foram realizadas aos 8DPI. Mudanças Microgliais foram significativamente mais graves em camundongos adultos do que em camundongos senis, mas os animais AE parecem recuperar a morfologia microglia homeostática mais cedo do que os animais de AP. Os efeitos benéficos do AE foram menores em camundongos envelhecidos. / Environmental enrichment and aging effects on behavioral and microglial morphological changes were investigated in a murine model of sub-lethal arbovirus encephalitis. To that end two-months-old female albino Swiss mice were raised in impoverished (IE) or in enriched environments (EE) during 6 (young - Y) or 16 (aged - A) months. After behavioral tests, Y and A mice were nasally instilled with an equal volume of Piry virus infected (Py) or normal brain homogenates. Eight days post-infection (DPI), when behavioral tests first revealed sickness changes, mice brains sections were immunoreacted with anti-IBA1 and anti-Piry virus antibodies. At 20 and 40 dpi, the remaining infected animals were behaviorally re-tested, and processed for the same markers. In infected young mice from impoverished environment (IYPy), burrowing activity decreased and recovered earlier (8–10 dpi) than open field activity (20–40 dpi) but remained unaltered in age-matched mice from enriched environment (EYPy). In contrast, aged infected mice, both from enriched (EAPy) and impoverished (IAPy) environments, reduced significantly burrowing activity at all-time windows. Piry virus encephalitis induced transitory olfactory losses in IYPy and EYPy but permanent in IAPy and EAPy. Piry virus antigens immunolabeling reached a peak in CNS parenchyma at 5 and 6dpi and disappeared at 8dpi. All microglia three-dimensional reconstructions were done at 8dpi. Microglial changes were significantly more severe in young adult than in aged mice but EY mice seem to recover to the microglial homeostatic morphology earlier than IY. EE beneficial effects were smaller in aged mice.