Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A febre do Oropouche, causada pelo vírus Oropouche (OROV), é uma arbovirose de grande interesse para a saúde pública devido à alta incidência nas áreas tropicais da América do Sul e Central. Devido à inespecificidade dos sintomas, a febre do Oropouche é facilmente confundida com a dengue e uma série de arboviroses. Tais semelhanças sintomáticas dificultam o diagnóstico preciso para OROV, requerendo o desenvolvimento de estudos diferenciais. O diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com outros vírus da mesma família. Portanto, com o intuito de realizar o diagnóstico sorológico específico para a febre causada por OROV, esse projeto teve por objetivo a construção de antígenos recombinantes a partir dos genes que codificam as proteínas estruturais Ns, G1 e G2 utilizando sistema de expressão eucariótico em células de insetos. Como resultados foram obtidos os baculovírus recombinantes para as proteínas Ns, G1 e G2 de OROV. O baculovírus correspondente à proteína G1 de OROV demonstrou instabilidade, provavelmente devido ao grande tamanho da construção recombinante. Testes de expressão das proteínas Ns e G2, em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) e High Five, com crescimento em suspensão, revelaram que em Sf-9 a proteína Ns foi exportada para o meio extracelular, enquanto que a proteína G2 foi encontrada na fração sólida da cultura. Não foi detectada expressão das proteínas Ns e G2 de OROV em células High FiveTM. A proteína recombinante Ns foi expressa pela primeira vez em sistema eucariótico, porém a quantidade obtida foi insuficiente para iniciar os ensaios sorológicos. A investigação da interação da proteína Ns com ácidos nucleicos sugere que no sistema de expressão em células de insetos, a mesma está associada ao DNA. Estudos estruturais serão necessários para confirmar os resultados obtidos. / Oropouche fever (OF), caused by Oropouche virus (OROV),is an arboviruse of great interest to public health due to the high incidence in tropical areas of Central and South America. Due to its unspecific clinical signs, OF is usually mistaken with dengue fever and others arboviruses. Such symptomatic similarities hinder accurate diagnosis for OROV, requiring the development of differential studies. Laboratory diagnosis by viral isolation is hard and depends on infrastructure and trained personnel available in few Brazilians laboratorie's. The immuno diagnostic tests present limitations due the use of infectious viral particles and also produce cross reactions with other viruses of the same family. Therefore, in order to perform specific serological diagnosis of OF, the aim of this project was the construction of recombinant antigens based on the structural proteins Ns, G1 and G2 using an eukaryotic insect cells expression system. The results correspond to the achievement of recombinant baculovirus for the proteins Ns, G1 and G2 OROV. The G1 recombinant baculovirus showed instability, probably due to large size of the construct. NS and G2 proteins expression experiments in Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) and High Five, grown in suspension revealed that in Sf-9 NS protein was exported into the extracellular environment, while the G2 protein was found in the culture solid fraction. We did not detect expression of Ns and G2 OROV proteins in High Five cells. The Ns recombinant protein was expressed for the first time in an eukaryotic system, but the amount of protein obtained was insufficient to perform serological assays. The investigation of the interaction of the Ns protein with nucleic acids suggests that in the Baculovirus expression system, it is associated with DNA. Structural studies are needed to confirm the results.

Introdução: Arbovírus são vírus transmitidos por artrópodos, pertencendo, principalmente, aos gêneros Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus). Os Flavivirus, em sua maioria, são associados a zoonoses, causando doenças humanas febrís, febres hemorrágicas e encefalites. Inclusive, causam epidemias que são sério problema de saúde pública. Este estudo mostra uma pesquisa de Flavivirus em culicídeos, de diferentes regiões do país, utilizando uma técnica para identificação viral por RT-PCR com primers Flavivirusespecíficos e uma Multiplex-nested-PCR com primers espécie-específicos. Métodos: Culicídeos foram capturados, quantificados, identificados, agrupados em lotes por espécie e congelados. No laboratório, os animais foram macerados e tiveram o RNA extraído. Estes extratos foram submetidos a RT-PCR gênero-específica e à Multiplex-nested-PCR, para detecção e identificação dos vírus a nível de espécie. Resultado: De 3317 culicídios adultos e 571 larvas coletados em 4 diferentes regiões do Brasil, Sul, Sudeste, Norte e Nordeste, fez-se 246 lotes de mosquitos e desses foi possível obter amplicon sugestivo de Flavivirus em 16 (6,5%). Em 3 lotes contendo larvas de Aedes albopictus obteve-se amplicon sugestivo de vírus do dengue tipo 3. Também, em 13 lotes contendo Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti e Aedes albopictus foi possível obter amplicons sugestivos de vírus do dengue tipos 1 e 2. Dos amplicons obtidos, 4 tiveram nucleotídios seqüenciados o que permitiu confirmar a presença dos vírus do dengue tipo 3 e Cacipacoré. Conclusão: O trabalho permitiu concluir que: a metodologia de RT-PCR para Flavivirus seguida de Multiplex-nested-PCR espécie-específica foi adequada para detecção e identificação destes vírus em culicídios; amplificaram-se genomas de Flavivirus em 6,5% dos lotes de culicídios estudados; vírus do dengue tipo 1 e tipo 2 foram encontrados infectando Aedes aegypti de Santos em 1999, Manaus em 2005-2006 e Foz do Iguaçu; vírus do dengue tipos 2 e 3 foram encontrados em Aedes albopictus de Santos em 1999 e Manaus em 2005-2006, sugerindo que este mosquito participe na transmissão de dengue; vírus do dengue tipo 3 foi encontrado em larvas de Aedes albopictus mostrando transmissão vertical do vírus; vírus do dengue tipo 1 foi encontrado infectando Haemagogus sp. sugerindo existência de ciclo silvático deste vírus; Aedes aegypti do Amazonas estavam infectados com o vírus Cacipacoré. / Introduction: Arbovirus are rodent-borne viruses mostly from Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus) genus. Flavivirus, are commonly zoonotic and can cause febrile illness, haemorrhagic fever and encephalitis. Flavivirus outbreaks occur in Brazil and are a major public health problem. We show here a research looking for Flavivirus infections in Culicidae by a RT-PCR using Flavivirus-especific primers and a Multiplex-nested-PCR using specie-specific primers for virus identification. Methods: Culicidae were captured, quantified, identified, pooled based on the specie and frozzen. In the laboratory, the animals were crushed and had the RNA extracted. These extracts were tested by a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR. Results: From 3317 captured adult Culicidae and 571 collected larvae in 4 different regions of Brazil, 246 pools were obtained and from these, Flavivirus indicative amplicons were obtained in 16 (6.5%). Amplicons of dengue type 3 were obtained from 3 pools of Aedes albopictus larvae. It was also possible to obtain indicative amplicons of dengue types 1 and 2 in 13 pools of Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti and Aedes albopictus. Besides, 4 amplicons had the nucleotides sequenced, confirming the mosquito infection by dengue type 3 and Cacipacoré viruses. Conclusion: The technique combining a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR was suitable for detection of these viruses in the mosquitoes; Flavivirus infecting Culicidae were detected in 6.5% of the analyzed mosquito pools; dengue virus type 1 and type 2 were found infecting Aedes aegypti from Santos (1999), Manaus (2005-2006) and Foz do Iguaçu cities; dengue type 2 virus was found in Aedes albopictus from Santos city (1999) and Manaus city (2005-2006), suggesting that this mosquito could be participating on dengue transmition; dengue type 3 virus was found in Aedes albopictus larvae showing the vertical transmission of this virus; dengue type 1 virus was found infecting Haemagogus sp. what suggests on the existence of a sylvatic maintenance cycle of this virus; Aedes aegypti from Amazonas state were found infeted by Cacipacoré virus.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-03T23:26:43Z No. of bitstreams: 1 LeandroGurgelDeMedeiros_DISSERT.pdf: 1967257 bytes, checksum: 24d83816c9f20214330af094f0fa32df (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-14T23:21:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LeandroGurgelDeMedeiros_DISSERT.pdf: 1967257 bytes, checksum: 24d83816c9f20214330af094f0fa32df (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T23:21:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeandroGurgelDeMedeiros_DISSERT.pdf: 1967257 bytes, checksum: 24d83816c9f20214330af094f0fa32df (MD5) Previous issue date: 2018-02-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A dengue é uma doença complexa e multifatorial, encontrada principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, com incidência global variando entre 50 a 100 milhões de casos por ano. O agente etiológico, o vírus dengue (DENV), é um arbovírus do grupo B, assim designado porque a sua manutenção na natureza depende da transmissão para hospedeiros vertebrados, por vetores artrópodes hematófagos (Artrophod-Borne Vírus). São transmitidos aos humanos por mosquitos fêmeas do gênero Aedes, especialmente Aedes aegypti e Aedes albopictus. Os DENV são vírus de RNA fita simples, com polaridade positiva, tamanho aproximado de 11Kb e com uma única janela de leitura aberta. É classificado na família Flaviviridae, gênero Flavivirus, sendo descritos quatro sorotipos distintos (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4), sorologicamente semelhantes, mas com determinantes antigênicos específicos para cada sorotipo. Esse trabalho objetivou pesquisar os vírus dengue em culicídeos capturados no município de Natal-RN, Brasil, no período de janeiro a novembro de 2016. Foram analisados 137 pools de fêmeas das espécies Aedes aegypti, Aedes albopictus, Culex quinquefasciatus, Wyeomyia sp., Ochlerotatus scapularis e Haemagogus leucocelaenus. Cada pool foi analisado para detecção do material genético dos DENV, pela técnica de RT-PCR. A espécie Aedes aegypti foi a mais representada, com 72 pools analisados. O RNA foi detectado em 19,70% (27/137) dos pools. Nos distritos sanitários oeste e norte, houve a maior incidência de mosquitos coletados. Foi constatada a presença de dois sorotipos de dengue: o DENV-1 e o DENV-3, sendo o DENV-1, o sorotipo mais prevalente, detectado em 92,60% dos pools positivos (25/27), enquanto que DENV-3 foi detectado em apenas 7,40% (2/27). Os meses de fevereiro e abril foram os que tiveram um maior número de pools de mosquitos positivos para o DENV, ambos com 44,4% (12/27) do total de pools positivos. Essas informações possibilitaram o reconhecimento de áreas prioritárias para a realização de ações de controle da dengue em Natal-RN, bem como dos sorotipos circulantes no município no ano do estudo e revelaram a presença do DENV em outras espécies de culicídeos, sendo esse um achado pioneiro no município. / Dengue is a complex and multifactorial disease, found mainly in tropical and subtropical regions, with a global incidence ranging from 50 to 100 million cases per year. Its etiologic agent is dengue virus (DENV), a group B arbovirus, so designated because its maintenance in nature depends on transmission to vertebrate hosts by hematophagous arthropod vectors (Artrophod-Borne Virus). They are transmitted to humans by female mosquitoes of the genus Aedes, especially Aedes aegypti and Aedes albopictus. DENVs are single-stranded RNA viruses with positive polarity, approximate size 11Kb and with a single open reading frame. It is classified in the Flaviviridae family, genus Flavivirus, and four serotypes (DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4) are described, serologically similar, but with specific antigenic determinants for each serotype. This work aimed to investigate the dengue virus in culicidae captured in the municipality of Natal-RN, Brazil, from January to November, 2016. We analyzed 137 pools of females of the species Aedes aegypti, Aedes albopictus, Culex quinquefasciatus, Wyeomyia sp., Ochlerotatus scapularis and Haemagogus leucocelaenus. Each pool was analyzed for the genetic material of DENV by the RT-PCR technique. The species Aedes aegypti was the most represented, with 72 analyzed pools. RNA was detected in 19,70% (27/137) of the pools. In the western and northern sanitary districts, there was a higher incidence of mosquitoes collected. Two types of serotypes were detected: DENV-1 and DENV-3. DENV-1, the most prevalent serotype, was detected in 92,60% of the positive pools (25/27), while DENV- 3 was detected in only 7,40% (2/27). The months of February and April were the ones that had a greater number of mosquito pools tested positive for DENV, both with 44,4% (12/27) of the total positive pools. This information allowed the recognition of priority areas for dengue control actions in Natal-RN, as well as the serotypes circulating in the municipality during the year of the study and revealed the presence of DENV in other species of culicidae, a pioneer finding in the municipality.

Realizou-se estudo analitico transversal relacionando caracteristicas individuais e familiares de 182 moradores pertencentes a 58 famílias de área de reserva ecológica à presença de infecções por arbovirus e hantavirus de interesse sanitário local. Pesquisou-se anticorpos para os antigenos dos virus Rocio, Ilhéus, da encefalite de st. Louis, das encefalites equinas do leste, oeste e venezuelana e Hantaan. Foram utilizados os testes de inibição de hemaglutinação, neutralização com redução de placas, imunofluorescência indireta e ensaio imunoenzimático com captura de anticorpos IgM (MAC-ELISA).· A associação estatistica foi pesquisada utilizando-se o teste de qui-quadrado e o grau de associação foi obtido calculando-se o odds ratio. Também foram pesquisadas a sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo e negativo das caracteristicas investigadas para avaliar seu poder de discriminar infectados de não infectados e de predizer infecções por arbovirus e hantavirus. A prevalência observada de anticorpos para arbovirus nos individuos foi de 26,9% e nas familias foi de 62,1%. Observou-se uma prevalência de 1,6% de anticorpos para hantavirus nos individuos e 5,2% nas familias. Não foram encontrados anticorpos para o virus da encefalite equina do oeste e nem anticorpos da classe IgM para os antigenos testados. Entre as caracteristicas estudadas, a idade, a ocupação, a naturalidade e o hábito de entrar na mata mostraram-se fatores de risco para infecções por arbovirus. Foram considerados fatores preditivos de infecção por arbovirus a presença de galinheiro anexo à casa, o hábito de criar galinhas e a presença de ratos no domicilio. Não foram observados fatores de risco ou de predição para infecção por hantavirus entre as caracteristicas estudadas. Os resultados obtidos sugerem que as caracteristicas, que mostraram ser fator de risco ou predição, poderiam ser usadas no diagnostico presuntivo preliminar de infecções por arbovirus e hantavirus, permitindo priorizar medidas de intervenção. O uso de um questionário ofereceria aos serviços de saúde ferramenta de simples aplicação e baixo custo, especialmente em condições de campo em áreas que, como a estudada, dispõe de escassos recursos humanos e laboratoriais. / In order to identify risk factors and predictive factors to arbovirus and hantavirus infections among individual and family characteristics, a cross-sectional study was carried out among 182 persons belonging to 58 families living at ecological reserve. The characteristics were associated with the presence of antibodies to the following virus of local interest: Hantaan, Rocio, Ilheus, Eastern, Western and Venezuelan equine encephalitis virus and st. Louis encephalitis virus using inhibition hemagglutination test, plaque reduction neutralization test, indirect immunofluorescence test and immunoglobulin M antibody capture enzyme immunoassay (MAC-ELISA). The associations were calculated using chi-square statistics and the odds ratio. Sensitivity, especificity, positive and negative predictive values of the individual and familiar characteristics were also analyzed to evaluate their capacity to discriminate between infected and non-infected people and to predict arbovirus and hantavirus infections. The prevalence of antibodies to arbovirus was 26.9% and 62.1% of the families had at least one member infected by these agents. Hantavirus antibodies were found in 1.6% of the sera analysed and 5.2% of the families had members infected by these agents. Antibodies to western equine encephalitis virus were not found. IgM antibodies were not observed sugesting no recent infection for those agents in that population. Age, ocupation, nativity and the habit to enter the forest were shown to be risk factors to arbovirus infections. The presence of annexes to the house, to breed chickens and the presence of rodents inside the house were considered predictive factors to arbovirus infections. Risk or predictive factors to hantavirus infections were not observed. The results suggest the use of some of the individual or family characteristics as a tool on the surveillance of arbovirus infections, to discriminate people with major probability of infections, specially in fie1d conditions, where human and laboratorial resources are scarce.

Devido a existência de 2 alphavírus artritogênicos no Brasil, os vírus Mayaro (MAYV) e Chikungunya (CHIKV) tornou-se importante desenvolver testes diagnósticos eficazes para discriminar suas infecções. No presente trabalho, desenvolvemos ELISAs indiretos para diagnóstico de CHIKV e MAYV utilizando proteínas de envelope viral E2 recombinantes, produzidas em Escherichia coli, as rE2-CHIKV e rE2-MAYV ELISAs. As proteínas E2 recombinantes tiveram suas antigenicidades verificadas nos ensaios utilizando anticorpos policlonais oriundos de camundongos hiperimunizados com CHIKV, MAYV e outros alphavírus. O rE2-CHIKV ELISA detectou anticorpos murinos de forma homotípica e não produziu reações cruzadas evidenciáveis utilizando anticorpos murinos específicos contra outros Alphavírus. O rE2-MAYV ELISA detectou anticorpos murinos homotípicos e também, reagiu cruzadamente com anticorpos murinos anti-CHIKV, mas não para outros Alphavírus. Esses ELISAs, também, foram usados na detecção de anticorpos em soros de pacientes com suspeita de infecção arboviral. Pelo o rE2-CHIKV ELISA, testaram-se 59 soros, resultando em 26 amostras IgG positivas. Resultados desse ELISA, quando comparados aos obtidos por teste de neutralização, demonstraram sensibilidade de 89,66% e especificidade de 100%. Soros humanos IgG positivos foram detectados em altas diluições pelo rE2-CHIKV ELISA. Quanto a detecção de IgM, o rE2- CHIKV ELISA apresentou moderada concordância com outros ensaios sorológicos. Com rE2- MAYV ELISA, testaram-se 68 soros resultando em 23 amostras IgG positivas, das quais 11 também mostraram-se positivas em teste de neutralização, demonstrando sensibilidade de 100% e especificidade de 78,95%. Portanto, os rE2-CHIKV e rE2 MAYV ELISAs, particularmente para detecção de IgG, mostraram-se adequadamente sensíveis e específicos para serem validados em estudos com maiores números de amostras e serem aplicados ao diagnóstico de pacientes infectados com CHIKV e MAYV. / Due the existence of 2 arthritogenic alphaviruses in Brasil, the viruses Mayaro (MAYV) and Chikungunya (CHIKV), it became important the development of efficient diagnose tests to discriminate their infections. In the present work, we developed indirect ELISAs for CHIKV and MAYV diagnosis using viral recombinant envelope proteins E2, produced in Escherichia coli, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV. The recombinant E2 proteins had their antigenicity confirmed in the assay by using polyclonal antibodies produced in hyperimmunized mice with CHIKV, MAYV and other alphaviruses. The rE2-CHIKV ELISA detected homotypic murine antibodies and did not produced detectable cross-reactivity signal when using murine antibodies from other alphaviruses. The rE2-MAYV ELISA detected homotypic antibodies and also cross-reacted with murine anti-CHIKV antibodies, but not to other alphaviruses. These ELISAs were also tested for the detection of human antibodies, using patient sera suspected of arboviral infection. For rE2- CHIKV ELISA, it were tested 59 sera, resulting in 26 positive IgG samples. These ELISA results, when compared to those of a neutralizing assay, demonstrated a sensibility of 89.66% and specificity of 100%. The IgG positive human sera were detected in high dilutions by rE2-CHIKV ELISA. Regarding the detection of IgM, the rE2-CHIKV ELISA showed a moderate samples detection agreement when compared to other serologic assays. For rE2-MAYV ELISA, it were tested 68 sera, resulting in 23 positive IgG samples, of which 11 demonstrated to be positive by the neutralization assay, demonstrating a sensibility of 100% and specificity of 78.95%. Therefore, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV ELISAs, especially for IgG detection, demonstrated to be properly sensitive and specific to be validated in studies using a greater number of samples, and also to be applied in the diagnosis of infected CHIKV and MAYV patients.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T13:37:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marize Moreira Gibrail - 2015.pdf: 2363722 bytes, checksum: 6f10b8066ff95d47a79302de16e9d1b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T13:39:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marize Moreira Gibrail - 2015.pdf: 2363722 bytes, checksum: 6f10b8066ff95d47a79302de16e9d1b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-12T13:39:40Z (GMT). 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All serum samples were first subjected to hemagglutination inhibition assay (HI) against specific antigens of 23 types of arboviruses circulating in the Brazilian Amazon region having as revelation goose red blood cell system. It was observed a positivity in serum samples of six NHPs, three of them being of the species Cebus libidinosus (animals 02, 10 and 11), two of Alouatta caraya species (animal 12 and 20) and the others for Callithrix penicillata species (animal 23) These six animals, four of them showed seropositive for more than one type of arboviruses: Animal 02 (Cacipacore virus and Dengue-1); Animal 11 (Mayaro virus, Oropouche, Cacipacore, Bussuquara and Dengue-1, 3 e 4); Animal 12 (Oropouche virus, Bussuquara and Cacipacore); and animal 23 (Dengue- 1, 3 and 4). The other two NHPs, species Cebus libidinosus (animal 10) and Alouatta caraya (animal 20) were seropositive for only one type of arbovirus: Bussuquara and Oropouche, respectively. Considering antibody titration by HI, it was observed a titer of equal or greater than 1:40 for Cacipacore virus and Dengue-1 (animal 02), Bussuquara (animal 10) and Oropouche (animals 11, 12 and 20), in total of five serum samples. Of these, four were tested for serum neutralization test (SNT) in vivo using Swiss mice of 1-3 days old: sample of animal 02, was positive for the virus Cacipacore and samples of animals 11, 12 and 20 were positive for Oropouche virus. It was noted that two of these samples was confirmed as positive for Oropouche virus from animals 12 and 20, both of Allouatta caraya species, which were acclimatized at CETAS-IBAMA. Generally, the study showed seropositivity for seven types of arboviruses in the three species studied NHPs which are registered in the Cerrado: Cebus libidinosus, Allouatta caraya and Callithrix penicillata. / Os arbovírus são vírus que se mantêm na natureza através da transmissão por um artrópode vetor a um vertebrado suscetível sendo o primata não humano (PNH), hospedeiro importante, principalmente no ambiente silvestre. Este estudo teve como objetivo identificar anticorpos para arbovírus em PNHs habitantes de três Parques Urbanos da cidade de Goiânia, bem como de PNHs ambientados no Centro de Triagem de Animais Silvestres - CETAS-IBAMA, do município de Goiânia. O procedimento se deu a partir da captura e coleta de amostras de sangue de 50 animais das espécies Cebus libidinosus (n=42), Alouatta caraya (n=5) e Callithrix penicillata (n=3). Todas as amostras de soro foram inicialmente submetidas ao ensaio de Inibição da Hemaglutinação (IH) frente a antígenos específicos de 23 tipos de arbovírus que circulam na região Amazônica brasileira tendo como sistema de revelação hemácias de ganso. Foi observado positividade em amostras de soro de seis PNHs sendo três deles da espécie Cebus libidinosus (animais 02, 10 e 11), dois da espécie Alouatta caraya (animais 12 e 20) e o outro da espécie Callithrix penicillata (animal 23). Destes seis animais, quatro se mostraram soropositivos para mais de um tipo de arbovírus: animal 02 (vírus Cacipacore e Dengue-1); animal 11 (vírus Mayaro, Oropouche, Cacipacore, Bussuquara e Dengue-1, 3 e 4); animal 12 (vírus Oropouche, Bussuquara e Cacipacore); e animal 23 (vírus Dengue- 1, 3 e 4). Os outros dois PNHs, espécies Cebus libidinosus (animal 10) e Alouatta caraya (animal 20) foram soropositivos para apenas um tipo de arbovírus: Bussuquara e Oropouche, respectivamente. Considerando a titulação de anticorpos por IH, foi observado título igual ou maior que 1:40 para os vírus Cacipacore e Dengue-1 (animal 02), Bussuquara (animal 10) e Oropouche (animais 11, 12 e 20), totalizando cinco amostras de soro. Destas, quatro foram testadas pelo ensaio de soroneutralização (SN) in vivo utilizando camundongo suíço de 1 a 3 dias de nascido: amostra do animal 02, positiva para o vírus Cacipacore e amostras dos animais 11, 12 e 20, positivas para o vírus Oropouche. Foi observado que duas destas amostras confirmaram positividade para o vírus Oropouche (animais 12 e 20), ambos da espécie Allouatta caraya, os quais eram ambientados do CETAS-IBAMA. No conjunto o estudo mostrou soropositividade para sete tipos de arbovírus nas três espécies de PNHs estudadas as quais possuem registro no Bioma Cerrado: Cebus libidinosus, Allouatta caraya e Callithrix penicillata.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As arboviroses são doenças causadas por vírus transmitidos por vetor artrópode (artropod-born viruses). A transmissão ocorre para os hospedeiros vertebrados susceptíveis no momento do repasto sanguíneo realizado pelos artrópodes hematófagos ou pode ocorrer entre artrópodes através da via transovariana e possivelmente venérea. A região Amazônica possui um grande número de artrópodes hematófagos (culicídeos, flebotomíneos, ceratopogonídeos) e vertebrados silvestres que juntamente com o clima tropical propiciam a manutenção dos arbovírus na natureza. O manejo inadequado da natureza através do desmatamento decorrente da abertura de estradas, construção de barragens, garimpo e mineração são alguns dos eventos responsáveis por surtos de arboviroses identificados na região Norte do Brasil. O Estado de Roraima está localizado no extremo norte do país, com fronteira internacional com a Venezuela e com a Guiana e ainda com o Estado do Amazonas e Pará. Estudos regulares a respeito da circulação de arbovírus no Estado são feitos apenas para dengue e febre amarela, nos quais foi identificada a circulação dos quatro sorotipos de dengue. O grande número de casos notificados para dengue cujo diagnóstico laboratorial é negativo para este arbovírus demonstrou a necessidade de se ampliar a pesquisa para outros vírus. Foram analisadas 150 amostras cujo teste NS1 apresentou-se negativo, provenientes do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Roraima, pertencentes a pacientes que manifestaram síndrome febril no período agudo da doença (até 5 dias de início dos sintomas) e que possuiam outros sintomas como: artralgia, cefaleia, dor retrorbital, calafrio, mialgia, diarreia, vômito e exantema. Conhecendo-se a maior sensibilidade da técnica de qPCR por sonda as amostras(150) foram submetidas à técnica qPCR para DENV, das quais obtivemos 33 (22%) amostras positivas para DEN tendo identificado os sorotipos por RT-PCR convencional obtendo os seguintes resultados: DENV-1(1), DENV-2(4), DENV-3(2), DENV-4(21), além de obtermos amostras negativas(3) e inconclusivas(2). Posteriormente 72 amostras que permaneceram negativas no qPCR para DENV foram submetidas a qPCR para MAYV/ORO obtendo-se positividade para MAYV(7) e para OROV(13). A identificação de outros arbovírus circulantes no Estado de Roraima torna-se necessária para que se conheça a população viral presente e assim desenvolver mecanismos de monitoramento e detecção, em tempo oportuno, da entrada de um arbovírus emergente, responsável por um possível surto. / The arboviruses are diseases caused by viruses transmitted by arthropod vector (artropod-born viruses). Transmission occurs for vertebrate hosts susceptible at the time of blood meal held by arthropod vectors or can occur between arthropods through transovarially and possibly venereal. The Amazon region has a large number of arthropod vectors (mosquitoes, sand flies, ceratopogonídeos) and wild vertebrates that coupled with the tropical climate favor the maintenance of arboviruses in nature. Inadequate management of nature through deforestation caused by the opening of roads, dams, mining and mining are some of the events responsible for outbreaks of arboviruses identified in northern Brazil. The State of Roraima is located in the extreme north of the country, with international border with Venezuela and Guyana and with the state of Amazonas and Pará. Regular studies regarding the circulation of arboviruses in the state are made just for dengue and yellow fever, which was identified in in the circulation of four dengue serotypes. The large number of reported cases of dengue laboratory diagnosis which is negative for this arbovirus demonstrated the need to expand the research to other vírus. We analyzed 150 samples with NS1 test appeared negative, from the Central Laboratory of Public Health of the State of Roraima, belonging to patients who manifested febrile syndrome in acute period of the disease (up to 5 days of onset of symptoms) and who possessed other symptoms such as arthralgia, headache, retrorbital, chills, myalgia, diarrhea, vomiting and rash. Knowing the greater sensitivity of the qPCR technique to probe the samples (150) were subjected to qPCR technique for DENV, which obtained 33 (22%) samples were positive for DEN serotypes and identified by conventional RT-PCR obtaining the following results : DENV-1 (1), DENV-2 (4), DENV-2 (3), DENV-4 (21), and obtain negative samples (3) and inconclusive (2). Subsequently 72 samples that remained negative for DENV in the qPCR were subjected to qPCR MAYV/OROV positive for obtaining MAYV (7) and OROV (13). Identification of other arboviruses circulating in the State of Roraima is necessary for knowing the viral population present and well developed mechanisms for monitoring and detection, timely entry of an emerging arbovirus responsible for a possible outbreak.

Rondônia apresenta área com rica diversidade de artrópodes, porém pouco se conhece sobre a transmissão de arbovírus por estas espécies. O presente trabalho visou detectar arbovírus, por meio da RT-PCR e da Duplex RT-PCR, nas espécies de dipteros coletados no Estado, bem como caracterizá-los pela reação de sequenciamento. A RT-PCR e a Duplex RT-PCR detectaram as suspensões dos vírus Mayaro e Oropouche até 104 e 101 TCID50/mL, respectivamente, porém o vírus Dengue 2 em pools contendo menos de três mosquitos infectados foi negativa. O controle endógeno foi detectado em 66,8 % das amostras, sendo que, em pools contendo entre um e três mosquitos, a detecção foi aproximadamente metade da detecção nos pools contendo entre 11 e 15. Em 0,66 % dos pools foi encontrado o vírus Oropouche e em outros 0,66 %, o vírus Cacipacoré. O vírus Oropouche foi detectado em Coquillettidia sp. e Deinocerites sp., enquanto o vírus Cacipacoré foi encontrado em Anopheles sp. e Culex sp. As técnicas possibilitaram a detecção dos arbovírus pesquisados nos pools coletados em Rondônia. / The Rondônia state has an area with rich arthropods diversity although the knowledge about the arboviruses transmition for these species is poor. The present work aimed to detect arboviruses through RT-PRC and RT-PCR Duplex in the diptera species collected in the region as well as their characterization through the sequence reaction. The RT-PRC and RT-PCR Duplex detected the Mayaro and Oropouche virus suspensions until 104 e 101 TCID50/mL respectively, although it was negative for the Dengue 2 virus in pools containing less than three infected mosquitoes. The endogenous control was detected in 66,8 % of samples and from pools containing from one to three mosquitoes the detection rate was approximately half from that obtained from pools with 11 to 15 mosquitoes. Oropouche virus was found in 0,66 % of pools and Cacipacore virus also in 0,66 % of pools. Oropouche virus was detected in Coquillettidia sp. and Deinocerites sp. while Cacipacoré virus was found in Anopheles sp. and Culex sp. The techniques allowed the detection of examined arboviruses in the pools collected from Rondonia.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-07T18:39:22Z No. of bitstreams: 1 izabelamauricioderezende.pdf: 1559679 bytes, checksum: 67e4268b6adc9ef4deff3f2809a09f64 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-07T21:45:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 izabelamauricioderezende.pdf: 1559679 bytes, checksum: 67e4268b6adc9ef4deff3f2809a09f64 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T21:45:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 izabelamauricioderezende.pdf: 1559679 bytes, checksum: 67e4268b6adc9ef4deff3f2809a09f64 (MD5) Previous issue date: 2015-02-10 / O Brasil é um país tropical de grande extensão territorial, com mais de um terço recoberto por florestas tropicais e outros ecossistemas naturais com condições ideais para a ocorrência de diversas arboviroses, as quais são mantidas em uma grande variedade de ciclos zoonóticos. Dentro deste cenário, Minas Gerais abriga um dos biomas mais importantes do Brasil, a Mata Atlântica, considerado ‘hotspot’, ou seja, região com uma rica biodiversidade. Estes fatores somados às diferenças climáticas, a grande variação latitudinal e as variadas tipologias vegetacionais do estado, propiciam a ocorrência de áreas com elevados índices de diversidade e endemismo de mamíferos. Diante deste contexto, este trabalho visou realizar a prospecção de flavivírus em culicídeos e pequenos mamíferos, em Minas Gerais, Brasil. Pools de culicídeos coletados em Montes Claros, no ano de 2012, tiveram seu RNA total extraído e foram testados por RT-PCR para a presença de flavivírus. Uma coleção de pequenos mamíferos, que foram coletados em Rio Pomba, MG, nos anos de 2012 e 2013, pertencentes a Coleção-ECOVIR, também foram analisados neste trabalho, sendo utilizados o soro de 115 animais e fígado de 54 animais desta coleção. Estas amostras passaram pelo processo de extração de RNA total, seguida da síntese de cDNA e testes para a presença de flavivírus através da técnica de qPCR. Dos 96 pools de culicídeos testados, um pool de A. aegypti pode estar naturalmente infectado com DENV-1. Posteriormente, 69 pools foram testados para YFV, SLEV e ROCV e um pool de A. scapularis apresentou fragmento de DNA com tamanho esperado para ROCV no PCR e apresentou um amplicon na reação de qPCR com iniciadores Flavi-1, indicando a circulação de flavivírus em Aedes scapularis no ambiente urbano de Montes Claros. Uma amostra de roedor Calomys sp. foi detectada como naturalmente infectada com flavivirus (possivelmente SLEV, DENV-1, DENV-3 e DENV-4), mostrando que roedores podem fazer parte da cadeia de manutenção e/ou transmissão de flavivírus na natureza, no Brasil. Esta amostra de roedor foi coletada na área de pasto, que poderia ser considerada uma área de transição entre o ambiente silvestre e peridoméstico. / Brazil is a tropical country of vast territory, with more than one third covered with tropical forests and ecosystems creating ideal conditions for the existence of many arboviruses that are maintained in a variety of zoonotic cycles. Within this scenario, Minas Gerais presents three of the most important biomes of Brazil, the Atlantic Forest that is considered hotspot of biodiversity. These factors plus the climatic differences, the great latitudinal range and the diversity of vegetation favor the occurrence of areas with high diversity index and endemism of mammals. Given this context, this work aims to prospect flaviviruses in mosquitoes and small mammals, in Minas Gerais, Brazil. Pools of mosquitoes collected in Montes Claros, in 2012, were submitted to RNA extraction and tested by RT -PCR for the presence of flaviviruses. A collection of small mammals (Collection- ECOVIR) collected in Rio Pomba, MG, in 2012 and 2013 was also analyzed in this work. A total of 115 serum samples and 54 liver samples were submited to RNA extraction, followed by cDNA synthesis and they were tested for the presence of flavivirus by qPCR technique. A total of 96 mosquito pools was tested and one pool of Aedes aegypti presented an amplicon that could represent a DENV-1 infection. Subsequently, 69 pools were tested for YFV, SLEV and ROCV and a pool of A. scapularis presented a DNA amplicon fragment with expected size for ROCV and it was positive in qPCR using primers Flavi-1, indicating the circulation flavivirus in Aedes scapularis in the urban environment, in Montes Claros. A sample of a rodent Calomys sp. was detected as naturally infected with flaviviruses (possibly SLEV, DENV-1, DENV -3 and DENV-4), indicating that rodents may be part of the maintenance chain and/or flavivirus transmission in nature, Brazil. This rodent sample was collected in the pasture area that could be considered a transition area between the wild and peridomestic environments.

O sequenciamento de alto desempenho, pela redução dos custos nos últimos anos, vem sendo cada vez mais utilizado para prospectar e identificar vírus. Estes métodos são extremamente mais sensíveis que outros métodos moleculares, e capazes de sequenciar genomas virais sem conhecimento prévio, clonagem ou isolamento. Neste estudo, utilizamos o sequenciamento de alto desempenho para conhecer, e caracterizar genomas completos de arbovírus isolados nas Américas, incluindo a prospecção de vírus em amostras de pequenos mamíferos do estado de São Paulo, Brasil. Assim, sequenciamos e caracterizamos 44 Bunyavirales, 35 no gênero Orthobunyavirus, família Peribunyaviridae, oito no gênero Phlebovirus, família Phenuiviridae, e um orthonairovírus, família Nairoviridae. Entre os Bunyavirales identificamos uma provável nova estratégia de codificação da proteína não estrutural do segmento pequeno, e ainda identificados sete vírus que são reassortants naturais. Caracterizamos o genoma completo do vesiculovírus Piry, determinando sua relação filogenética com arbovírus pertencentes ao gênero Vesiculovirus, família Rhabdoviridae. Prospectamos novos vírus, os quais incluímos em três famílias, Parvoviridae, Anelloviridae e Hepeviridae. Na família Parvoviridae, identificamos 20 chapparvovírus endógenos e exógenos, oriundos de grande diversidade de hospedeiros vertebrados e invertebrados, e que representam uma nova subfamília, a Chapparvovirinae. Também, descrevemos onze novas espécies de Anelloviridae em roedores silvestres e marsupiais, fornecendo importantes informações sobre a diversidade, a taxonomia, e ainda ampliamos a gama de hospedeiros de anellovírus conhecidos. Por fim, identificamos e caracterizamos uma nova espécie de Orthohepevirus de roedores Sigmodontinae, nomeada \"Orthohepevirus E\". Acreditamos que estamos a fornecer relevantes informações sobre genômica, epidemiologia molecular, evolução e taxonomia de 45 arbovírus americanos, bem como sobre 13 novas espécies virais encontradas em pequenos mamíferos. Tais informações deverão dar subsídios para múltiplos futuros estudos visando compreender a importância destes novos vírus e a desenvolver métodos diagnósticos. / In last years, high-throughput sequencing (HTS) has been cost-effective and increasingly used for prospection and identification of viruses. These methods are extremely more sensitive than other molecular methods and are capable of sequencing viral genomes without prior knowledge, cloning or isolation. In this study, we used HTS approach to identify and characterize complete genomes of arbovirus isolated in the Americas, as well as viral prospection in samples of small mammals from São Paulo State, Brazil. Thus, we sequenced and characterized 44 viruses from Bunyavirales order, including 35 in Orthobunyavirus genus, family Peribunyaviridae, eight in Phlebovirus genus, family Phenuiviridae, and one in Orthonairovirus genus, family Nairoviridae. Among the Bunyavirales we identified a novel putative strategy for encoding the non-structural protein of the small segment, as well as we identified seven viruses that are natural reassortants. Also, we characterized the complete genome of the Piry vesiculovirus, determining its phylogenetic relationship with arboviruses belonging to the Vesiculovirus genus, family Rhabdoviridae. On the other hand, we have prospected novel viruses, which included in three families, Parvoviridae, Anelloviridae, and Hepeviridae. In the Parvoviridae family, we identified 20 endogenous and exogenous chapparvoviruses from a broad diversity of vertebrate and invertebrate hosts, representing a new subfamily, the Chapparvovirinae. Also, we have described eleven new species of Anelloviridae in wild rodents and marsupials, providing important information on diversity, taxonomy and even broadening the range of known anelloviruses hosts. Finally, we identified and characterized a novel species of orthohepevirus in Sigmodontinae rodent, named \"Orthohepevirus E\". We believe that we are providing relevant relevant on genomics, molecular epidemiology, evolution and taxonomy of 45 American arboviruses, as well as on 13 new viral species found in small mammals. Thus, these informations should provide support for multiple future studies to understand the importance of these new viruses, as well as to develop diagnostic methods.