Staphylococcus aureus, est un pathogène humain majeur responsable d’infections nosocomiales et communautaires. Avec l’utilisation excessive des antibactériens, l’incidence et l’émergence de souches de S. aureus multi-résistantes aux antibiotiques ont augmenté rapidement depuis plusieurs années et constituent un véritable problème de santé publique. Le succès de S. aureus en tant que pathogène est lié à sa capacité à s’adapter rapidement à un nouvel environnement et à produire un arsenal de facteurs de virulence dont l’expression fait intervenir des protéines mais également des ARN régulateurs (ARNrég). Au cours de cette thèse, nous avons montré que les ARNrég sprG1 et SprF1 constitue un système toxine-antitoxine (STA) de type I fonctionnel où sprG1 code pour deux peptides toxiques. En condition normale de croissance, l’expression de la toxine est régulée par l’antitoxine SprF1 au niveau transcriptionnel et/ou post-transcriptionnel et traductionnel, permettant au pathogène S. aureus de croître normalement. En revanche, lorsque la bactérie est confrontée à une carence nutritive globale, l’expression de l’antitoxine est réprimée, laissant ainsi la toxine sprG1 s’accumuler dans la cellule et traduire les peptides toxiques PepG144 et PepG131, responsables de la stase bactérienne. Les deux peptides sécrétés sont capables de lyser les bactéries compétitrices présentes dans le milieu et les érythrocytes humains. Nous avons également montré, qu’en condition de stress hyperosmotique, SprF1 fixe directement les ribosomes, probablement par l’intermédiaire d’un ou de deux sites de fixation aux ribosomes, afin de réguler la synthèse protéique globale et de favoriser la persistance de S. aureus. Ces résultats montrent que SprF1 appartient à une nouvelle classe émergente d’ARNrég régulant la traduction par fixation directe sur le ribosome. Le STA sprG1/SprF1 est le premier exemple de STA de type I où l’antitoxine est le principal acteur de la fonction biologique. / Staphylococcus aureus is a major human pathogen responsible for nosocomial and community-acquired diseases. With the excessive use of antibiotics, incidence and emergence of multidrug-resistant strains of S. aureus have rapidly increased over the last decade and constitute a serious public health concern. The success of S. aureus as a pathogen is due to its ability to adapt quickly to new environment and to produce an arsenal of virulence factors whose expressions are regulated by proteins and regulatory RNA (regRNA). During my PhD thesis, we showed that RNAs sprG1 and SprF1 constitute a functional type I toxin-antitoxin system (TAS) where sprG1 encodes two toxic peptides. During normal growth conditions, toxin expression is regulated by the antitoxin SprF1 at transcriptional and/or post-transcriptional and translational level, allowing the pathogen to grow. Conversaly, when bacteria are confronted to global nutritive starvation, the antitoxin expression is repressed. This allows accumulation of the sprG1 toxin in cell and translation of both toxic peptides, PepG144 and PepG131, responsible for bacterial stasis. Interestingly, both secreted peptides are able to lyse competitor bacteria in the medium and human erythrocytes. We also showed that upon hyperosmotic stress, SprF1 directly binds ribosomes, probably though one or two ribosome-binding sites, to regulate overall protein synthesis and promote S. aureus persistence. These results suggest that SprF1 belongs to the new emerging class of regRNA regulating translation by direct ribosome-binding. The sprG1/SprF1 TAS is the first example of type I TAS where antitoxin is the leading player of the biological function.

RESUME<p><p><p>Le proto-oncogène c-myc code pour un facteur de transcription qui est impliqué dans de multiples processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Une dérégulation de son expression suite à des altérations génétiques (mutation, translocation, amplification) est retrouvée dans plusieurs tumeurs telles que le lymphome de Burkitt, des plasmacytomes murins ainsi que des tumeurs non-lymphoïdes.<p>c-myc est un gène dont l’expression est régulée à différents niveaux. Chez l’homme, le gène c-myc est transcrit à partir de quatre promoteurs alternatifs appelés respectivement P0, P1, P2 et P3. P1 et P2 sont les deux promoteurs les plus utilisés. Ensemble, ils permettent de former 90% des transcrits c-myc dans des cellules normales. <p>Les promoteurs P0, P1 et P2 permettent la transcription de trois ARNms qui comportent deux codons d’initiation de la traduction (un CUG et un AUG). L’utilisation alternative de ces deux codons d’initiation est à l’origine de la synthèse de deux protéines (c-Myc 1 et c-Myc 2) ayant à la fois des fonctions identiques et distinctes. <p> La grande taille des parties 5’ non-traduites ainsi que la présence dans celles-ci de phases ouvertes de lecture sont des éléments défavorables à la traduction de l’ORF codant pour les protéines Myc par un mécanisme classique d’initiation de la traduction. Notre laboratoire avait précisément montré que les protéines c-Myc sont synthétisées par un processus d’initiation interne de la traduction. Les ARNms dont l’initiation de la traduction s’effectue par entrée interne des ribosomes présentent une structure spécifique appelée IRES (Internal Ribosome Entry Site). Cette structure permet la fixation du ribosome directement à proximité du codon d’initiation. Dans le cas des ARNms c-myc, on retrouve une IRES se situant en amont des codons CUG et AUG qui permet la synthèse des protéines c-Myc1 et 2 respectivement. Un tel mécanisme permet la synthèse des protéines c-Myc dans des conditions où toute traduction dépendante de la coiffe est inhibée (mitose, apoptose).<p><p>Au cours de mon travail, tout d’abord j’ai montré qu’une séquence de 40 nt dans les transcrits P2 permet à elle seule une initiation interne efficace de la traduction. Nous avons déterminé aussi que cette séquence, appelée B4, est active dans quatre types cellulaires différents avec une efficacité variable et qu’elle active la traduction indépendamment de l’ORF placée en aval. D’autre part, il a été déterminé que la séquence B4 recrute le complexe de préinitiation 43S, qui ensuite scanne le messager jusqu’aux codons initiateurs comme c’est le cas de l’IRES du rhinovirus. <p>Une analyse plus détaillée de la séquence B4 a permis d’identifier trois plus petites séquences de plus ou moins 14 nt (Ti1, Boucle, Ti2), qui indépendamment l’une de l’autre permettent une entrée interne des ribosomes. Il a été déterminé que la présence du motif A-N6-AC dans la séquence de Ti2 était importante pour l’activité IRES de celle-ci. Cependant, ce même motif également présent dans la séquence Ti1 n’est pas essentiel à l’activité IRES de Ti1. <p>Par la suite, nous avons démontré que l’IRES de c-myc nécessite pour son activité un évènement nucléaire. Nous avons donc entrepris la recherche de facteurs cellulaires impliqués dans l’activité de l’IRES de c-myc. Dans un premier temps, nous avons exclu le rôle de certaines protéines connues pour activer d’autres IRES dont le mécanisme de recrutement du complexe de préinitiation est similaire. Ainsi, nous avons montré, par des expériences de complémentation d’un RRL, que les protéines PTB et unr connues pour activer l’IRES du rhinovirus ne contribuent pas à l’activité de l’IRES de c-myc. De plus, la complémentation de RRL avec des extraits S10 ou nucléaires de cellules HeLa n’a pas permis d’identifier des protéines impliquées dans l’activité IRES de c-myc.<p>D’autre part, des méthodes alternatives d’interaction d’ARN et de protéine comme le triple hybride ou la chromatographie d’affinité d’ARN n’a pas permis dans un premier temps de détecter une interaction entre un facteur non canonique et l’IRES de c-myc. Dès lors, l’existence de facteurs cellulaires impliqués dans l’activité de l’IRES de c-myc reste à déterminer.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Parmi les petits ARN non codants, les fragments dérivant d’ARNt (tRF) ont été identifiés dans tous les embranchements de la vie. Cependant, très peu de donnée existe sur les tRF de plantes. Les populations de tRF issues de plusieurs banques de petits ARN (différents tissus, plantes soumises à des stress abiotiques, ou fractions immunoprécipitées avec la protéine ARGONAUTE1) ont été analysées. Les populations sont essentiellement constituées de tRF-5D ou des tRF-3T (clivage dans la boucle D ou T respectivement) et elles varient d’une banque à l’autre. Par une approche in silico suivie de tests de clivage in vitro, des RNases T2 d’A. thaliana (RNS) ont été identifiées comme étant capables de cliver les ARNt dans la région de l’anticodon, de la boucle D et de la boucle T. Lors de l’étude de l’expression des RNS, nous avons observé que deux d’entre elles sont fortement exprimées à un stade de maturation tardif des siliques. Ainsi, la population en tRF issue de stades de développement avancés des siliques a été analysée. Des expériences de carences en phosphate nous ont permis de démontrer l’implication d’une des RNS dans la genèse de tRF dans A. thaliana. Au final, nos données ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’implication des RNS et des tRF comme des acteurs majeurs dans l’expression des gènes chez les plantes. / Among the small ncRNAs, tRNA-derived RNA fragments (tRFs) were identified in all domains of life. However, only few data report on plants tRFs. Short tRF were retrieved from A. thaliana small RNA libraries (various tissues, plants submitted to abiotic stress or argonaute immunoprecipitated fractions). Mainly tRF-5D or tRF-3T (cleavage in the D or T region respectively) were found, and fluctuations in the tRF population were observed.Using in vitro approaches, A. thaliana RNase T2 endoribonucleases (RNS) were shown to cleave tRNAs in the anticodon region but also in the D or T region. Through a whole study of RNS expression, we show that two RNS are also strongly expressed in the siliques at a late stage of development. Thus, we analyzed the tRF population of this particular developmental stage. Upon phosphate starvation, we demonstrate also the implication of one RNS in the production of tRFs in planta. Altogether, our data open new perspectives for RNS and tRFs as major actors of gene expression inplants.

L’ARNIII de S. aureus est considéré comme un régulateur majeur de la virulence de la bactérie. Il agit au niveau post‐transcriptionnel en interagissant avec ses ARNm cibles, permettant la répression des protéines d’adhésion et l’expression des exotoxines. Des expériences de chromatographie d’affinité ont permis d’identifier deux protéines se liant à l’ARNIII, l’endoribonucléase III (RNase III) et Tex. Alors que la RNase III dégrade les duplexes ARNIII-ARNm, la fonction de Tex n'est pas connue. Tex (Toxin Expression) est l'orthologue de la protéine eucaryote Spt6 impliquée dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Elle contient deux domaines de liaison à l'ADN (HhH et Hth) et à l'ARN (S1 et YqgF). Afin de déterminer sa fonction chez S. aureus, un variant délété du domaine S1 a été construit (Tex delta S1) et la liaison de Tex et Tex delta S1 aux ARN a été analysée par des techniques in vitro. Nous avons montré que Tex se lie aux motifs simples brins riches en A/U de plusieurs ARN régulateurs et que le domaine S1 constitue en soi, le domaine de liaison aux ARN. Des données préliminaires suggèrent que d’autres domaines seraient aussi impliqués dans ces interactions. La fonction de Tex a ensuite été étudiée par la construction de mutants d'insertion. Les souches sauvages et mutées montrent une croissance identique en milieu riche et minimum, indiquant que Tex n’est pas essentielle pour S. aureus. Les mutants produisent plus de biofilms que les sauvages, indiquant un rôle de Tex dans la virulence. Des expériences d’immunoprécipitation et protéomique ont montré un rôle de Tex dans la régulation transcriptionelle et/ou post‐transcriptionnelle des facteurs de virulence précoces, lors de la phase de transition de la colonisation à la dissémination dans l’hôte. / S. aureus RNAIII is considered as a master regulator of virulence gene expression. The RNA regulates gene expression at the post-transcriptional level allowing repression of surface proteins and activation of exotoxins. In vitro pulled-down experiments led to the identification of two proteins interacting with RNAIII, the endoribonuclease III (RNase III), known to degrade RNAIII‐mRNA duplexes and Tex. Tex (Toxin Expression) is an ortholog of the eukaryotic protein Spt6, known to be involved in transcriptional and post‐transcriptional regulation. It is composed of two DNA binding domains (HtH and HhH) and two RNA binding domains (S1 and YqgF). To decipher the RNA binding capacity of Tex, we have constructed a variant of the protein lacking the putative RNA‐binding domain S1 (TexΔS1), and analyzed the binding properties of both the wild type and the Tex‐ΔS1 protein by different in vitro techniques. Indeed Tex recognizes preferentially unpaired A/U rich sequences of several regulatory RNAs, and that the S1 domain is per se, the RNA‐binding domain. However, other domains of Tex seem to be also involved in RNA binding. To better define the function of Tex in vivo, we inserted an intron into the coding region of tex. Wild type and mutant strains grew at the same rate in rich and minimal media, meaning that Tex is not essential. On the other hand, mutated strains produced more biofilm than the wild type strains, suggesting a role of Tex in virulence. Finally, a combination of immunoprecipitation and proteomics experiments highlighted a possible role of Tex in the regulation of virulence factors expression at the transcriptional and/or posttranscriptional level during the transition from colonisation to invasion of the host.

La protéine MLN51, surexprimée dans environ 30% des cancers du sein, est un facteur clé du métabolisme des ARNm, en tant que membre du complexe de jonction des exons (EJC). Ce graffiti moléculaire est un régulateur essentiel de l’expression génique de par son implication dans l’épissage, l’export, la traduction, la stabilité et la dégradation des ARNm. A l’échelle structurale, l’EJC est organisé autour d’un coeur protéique avec l’hélicase eIF4A3, MLN51 et l’hétérodimère Magoh/Y14. Ce tétramère sert de plateforme d’ancrage à d’autres facteurs périphériques. Les mécanismes de recrutement du coeur EJC sur l’ARNm ont été élucidés par des approches biochimiques. Dans ce contexte, nous avons initié un travail original destiné à mettre en évidence la localisation cellulaire de l’assemblage du coeur EJC in vivo. L’utilisation de techniques d’imagerie photonique et électronique a permis d’établir un lien véritable entre la localisation du coeur EJC et l’architecture nucléaire. Nous avons montré que la plupart des facteurs EJC sont localisés et interagissent à la périphérie des speckles nucléaires, lieux de stockage des facteurs d’épissage. Ces régions discrètes nucléaires ont été appelées «perispeckles» et sont des entités distinctes des speckles. De manière intéressante, la localisation des protéines coeur coïncide avec celle des ARNm dans les perispeckles et est spatialement reliée aux sites transcriptionnels. Ces données démontrent que l’assemblage du coeur EJC a lieu dans le compartiment nucléaire et définissent le perispeckle comme un territoire intermédiaire entre les speckles nucléaires et sites de transcription où s’opèrent des évènements post-transcriptionnels fondamentaux. / The MLN51 protein, overexpressed in around 30% of breast cancers, is a key factor for mRNA metabolism, as a member of the Exon Junction Complex (EJC). The EJC marks the splicing history of an mRNA and influences many stages of its subsequent metabolism: splicing, dynamic cytoplasmic export, efficient and localized translation, quality-control and stability. Structurally, the EJC is organized around a core complex that is formed by four proteins (eIF4A3, MLN51, Magoh, Y14). The core complex serves as a binding platform for more than a dozen peripheral factors. The EJC is not a pre-assembled complex; however, its assembly mode is well described in vitro using recombinant proteins and splicing extracts. Nevertheless, where this complex assembles in vivo was a matter of debate. By using light and electron microscopy approaches, we established an original link between the cellular distribution of the EJC core factors and the nuclear architecture. The core and most of the peripheral EJC factors are colocalized and interact together in discrete regions of the nucleus, located at the periphery of nuclear speckles. This doughnut-shaped region appears to be a novel nuclear territory that we termed “the perispeckle”. This territory is distinct from nuclear speckles; it contains nascent mRNAs and it is close to active transcription sites. Overall, this study supports a model in which the deposition of the EJC core takes place in the nucleus, and that assembled EJC core factors concentrate in discrete subnuclear territories termed perispeckles. These regions contribute to the compartmentalization of the nucleus as an active domain implicated in mRNP packaging.

Le domaine Dlk1-Dio3 est l’un des rares domaines imprimés contrôlés par une région de contrôle d'impression méthylée sur le chromosome paternel, nommée IG-DMR. Dans l’embryon, au niveau du domaine Dlk1, Rtl1 et Dio3 les gènes codant pour des protéines sont exprimés à partir du chromosome paternel, tandis que les ARNs non-codants dont Meg3, les snoRNAs à boite C/D et les micro-ARNs sont exprimés à partir du chromosome maternel.Il a été montré que la copie maternelle de l'IG-DMR est nécessaire pour l'expression des gènes imprimés de ce domaine et que les ARNs de types enhancer (de la même région) activent la transcription des ARNs non-codants. Cependant, les mécanismes qui régulent l'expression imprimée de gènes codant pour des protéines restent indéterminés. Dans ce projet, nous avons cherché à élucider les mécanismes qui contrôlent l'expression spécifiquement paternelle des gènes codant pour des protéines ainsi que le rôle possible des ARNs non-codants dans ce processus.Pour nos études alléliques, nous avons utilisé des cellules ES hybrides qui ont été obtenues en croisant des lignées de M. musculus domesticus et M. musculus molossinus. Ces cellules ont été différenciées in vitro dans des lignées neurales. Dans les cellules ES, l'expression Dlk1 est détectée à partir des deux chromosomes parentaux à des niveaux très bas. Lors de la différenciation, l'allèle paternel de Dlk1 devient actif tandis que le niveau d'expression de l'allèle maternel reste faible. Nos études de la chromatine ont montré que cette surexpression est due à l’activation de la chromatine sur l'allèle paternel de Dlk1.L'un de nos objectifs était d'explorer le rôle de Meg3 (un long ARN non-codant) dans la régulation de l’empreinte de Dlk1. A cet effet, nous avons généré des cellules souches embryonnaires déficientes en Meg3. Dans toutes les lignées déficientes, de suppressions maternelles ou bi-alléliques, nous avons constaté une perte d’expression de tous les ANRs non-codants. De plus, l’expression de Dlk1 devient bi-allélique dans ces cellules. Pour élucider le mécanisme de l'empreinte de ce gène, nous avons décidé d'étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau du promoteur Dlk1 dans les cellules déficientes en Meg3. Nous avons examiné les modifications activatrices et répressives des histones ainsi que l'occupation de l'ARN Pol II. Nous avons observé l'acquisition des marques d’une chromatine active sur les deux chromosomes ainsi que le recrutement bi-allélique de l'ARN Pol II.Bien que nous n’ayons pas pu détecter une perte de la marque répressive H3K27me3 suite à la surexpression de Dlk1, nous avons observé un gain d'acétylation sur ce résidu lysine. Afin de comprendre davantage le rôle de la marque H3K27me3 sur l’empreinte de Dlk1, nous avons généré des cellules ES dépourvues de EZH2, la méthyltransférase de H3K27. L’expression de Dlk1 dans les cellules différenciées dépourvues de H3K27me3 est bi-allélique.Enfin, ces données suggèrent que l'expression des ARNs non-codant empêche l'activation de Dlk1 sur le chromosome maternel via l’activité de EZH2 au cours du développement. / The Dlk1-Dio3 imprinted domain is one of the few imprinted domains that are controlled by a paternally methylated imprinting control region, IG-DMR. Protein-coding genes of the domain, Dlk1, Rtl1 and Dio3 are expressed from the paternal chromosome, and non-coding RNAs (ncRNAs) including Meg3, C/D box snoRNAs and microRNAs are expressed from the maternal chromosome exclusively in the embryo. Maternal copy of the IG-DMR is required for the imprinted gene expression at this domain. Enhancer RNAs transcribed from this region are involved in activation of ncRNA expression on the maternal chromosome. However, the regulation of imprinted expression of protein-coding genes remains unknown. In this project, we aimed to elucidate the mechanisms controlling the paternal specific expression of protein-coding genes and a possible role of ncRNAs in this process.For our allelic studies, we made use of hybrid ES cells that were obtained by crossing M. musculus domesticus and M. musculus molossinus strains. These cells were differentiated in vitro into neural lineages. In ES cells, Dlk1 expression is detected from both parental chromosomes at very low levels. Upon differentiation, paternal allele of Dlk1 gets activated while low level of expression is detected from maternal allele. Our chromatin studies showed that this upregulation is through the acquisition of active chromatin on the paternal allele of Dlk1.One of our aims was to explore the role of Meg3 long non-coding RNA (lncRNA) in the regulation of Dlk1 imprinting. For this purpose, we generated ES cells deficient in Meg3. In all maternal or biallelic deletion lines, we observed complete loss of all ncRNA expression. Interestingly, in these cells Dlk1 expression becomes biallelic. To elucidate the mechanism of imprinting of this gene, we set out to study the chromatin features at the Dlk1 promoter in Meg3 deficient cells. We looked into active and repressive histone modifications and RNA Pol II occupancy. We observed acquisition of active chromatin marks on both chromosomes as well as biallelic recruitment of RNA Pol II.Although we could not detect a loss of repressive mark H3K27me3 upon Dlk1 upregulation on the paternal allele, we observed gain of acetylation on this lysine residue. To further investigate the role of H3K27me3 mark on Dlk1 imprinting, we generated ES cells that lack functional EZH2, the H3K27 methyltransferase. Dlk1 is biallelically expressed in the differentiated cells that are devoid of H3K27me3.Combined, these data suggest a model in which non-coding RNA expression prevents the developmental activation of Dlk1 on the maternal chromosome by a process that also requires the activity of EZH2.

Le VIH-1 est un rétrovirus dont le génome est constitué d'ARN (ARNg). La conversion de cet ARNg en ADN est réalisée lors de la rétrotranscription (RTion). Elle permet de convertir l'ARNg simple brin en une molécule d'ADN double brin, qui sera ensuite intégrée dans le génome de la cellule hôte pour assurer la réplication du virus. La RTion est réalisée dans les premières heures de l'infection, dès l'entrée du virus. La protéine de nucléocapside (NC) participe activement à cette conversion. La NC est une petite protéine avec deux motifs en doigt à zinc (ZF1 et ZF2) qui avec sa partie basique N-term sont responsables de son activité chaperonne des acides nucléiques. L'équipe a récemment découvert un nouveau rôle de la NC en observant que la mutation des doigts de zinc ou de la région basique N-term déclenche prématurément la RTion avant le relargage des nouveaux virus, c'est à dire pendant les phases tardives de réplication du VIH. Nous parlons alors de "RTion tardive". Celle-ci génère des virus à forte teneur en ADN viral. Ces résultats originaux indiquent que la NC joue un rôle dans le contrôle spatio-temporel de la RTion au cours de la réplication du VIH. Mon projet de thèse a consisté à identifier les partenaires potentiels de la NC dans cette RT tardive et à élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu. L'approche expérimentale principalement utilisée au cours de ma thèse, consiste à la production de particules VIH-1 (pNL4-3) et à l'analyse de leur contenu en acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel. En mesurant l'effet de la présence et de l'absence de la protéine virale Vif sur le déclenchement de la RTion tardive dans des cellules produisant le VIH-1, nous avons démontré l'implication de Vif dans la régulation de la RTion tardive. Nous avons également montré que l'ARNg, et plus particulièrement sa région 5'UTR, est un partenaire essentiel de la NC et de Vif dans le contrôle du timing de la RTion tardive. Notre étude comparative avec un rétrovirus plus ancien et plus simple (pas de Vif) comme le Murine Leukemia Virus (MuLV), montre que cette propriété de la NC du VIH-1 à contrôler la RTion tardive n'est pas commune à tous les rétrovirus. Pour mieux comprendre le rôle de la NC au cours des phases tardives de la réplication du VIH-1, nous avons utilisé la technique de microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) en cellules vivantes. Cette technique de microscopie permet de visualiser les étapes d'assemblage, de bourgeonnement et de relargage des particules virales à la membrane plasmique de la cellule hôte. Bien que la NC n'influe pas sur la cinétique d'assemblage du virus, elle est en revanche fortement impliquée dans le contrôle du bourgeonnement et du relargage des particules VIH-1. Des expériences de trans-complémentation du VIH-1 mutant (délétion du ZF2) montrent que la NC contribue au recrutement des protéines cellulaires ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) aux sites d'assemblage viral, notamment via la voie Tsg101. / HIV-1 is a retrovirus whose genome consists of RNA (gRNA). Conversion of this gRNA into DNA is made during reverse transcription (RTion). It can convert single-stranded gRNA in a double-stranded DNA molecule, which is then integrated into the genome of the host cell to ensure the virus replication. The RTion is carried out in the early hours of infection, soon after virus entry. The nucleocapsid protein (NC) is actively involved in this conversion. The NC protein chaperones this process via its nucleic acid annealing activities and its interactions with the reverse transcriptase enzyme. To function the NC needs its two conserved zinc fingers and flanking basic residues. The team recently discovered a new role for the NC. When the NC has a mutation of its zinc fingers or its N-terminal basic region, the RTion is made prematurely before the release of new viruses, i.e. during the later stages of HIV replication. We call it «late RTion". This RTion generates virus with a high level of viral DNA. These results indicate that the NC plays a role in the spatio-temporal control of the RTion during HIV replication. My thesis project was to identify potential partners of the NC in the late RT process and to elucidate the molecular mechanisms involved.The experimental approach mainly used in my project is the production of HIV-1 particles (pNL4-3) and the analysis of their nucleic acid content by Q-PCR in real-time. By measuring the effect of the presence and absence of the viral protein Vif on the initiation of late RTion in cells producing HIV-1, we demonstrated the role of Vif in late RTion regulation. We also showed that the gRNA, and particularly its 5'UTR, is a key partner of the NC and Vif in the control of the late RTion. Our comparative study between HIV-1 and an old and simple (no Vif) retrovirus such as the Murine Leukemia Virus (MuLV) showed that the ability of the HIV-1 NC to control late RTion is not common to all retroviruses.To better understand the role of NC during the late stages of the HIV-1 replication, we used the TIRF microscopy (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) in live cells. The TIRF allows the visualization of the viral assembly, budding and release of virus particles at the plasma membrane of the host cell. Although the NC does not contribute to the kinetic of the virus assembly, it is however strongly involved in the control of the budding and the release of the HIV-1 particles. Experiences of trans-complementation of a HIV-1 mutant (deletion of ZF2) showed that NC contributes to the recruitment of the cellular ESCRT machinery (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) at the assembly sites, particularly through the Tsg101 pathway.

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène de l'homme impliquée dans de nombreuses infections nosocomiales et communautaires. Comme elle acquiert régulièrement de nouvelles résistances à diverses classes d'antibiotiques, il devient urgent de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certains ARN régulateurs (ARNrég) sont importants dans le contrôle de la virulence et de la pathogénie de la bactérie. Au cours de ma thèse, nous avons étudié la fonction d'un ARNrég, appelé SprX (alias RsaOR), exprimé par Staphylococcus aureus. Dans un premier temps, nous avons montré que, dans les souches N315 et HG001, l'expression de SprX varie au cours de la croissance et lors de différentes conditions expérimentales. Dans un second temps, nous avons identifié, par une analyse comparative du protéome, plusieurs protéines dont l'expression est dépendante de SprX et découvert le mécanisme de régulation de l'une de ces protéines par SprX. En effet, SprX interagit avec l'ARNm yabJ-spoVG au niveau des signaux d'initiation de la traduction de SpoVG par un mécanisme antisens qui conduit à la répression de sa traduction. Une boucle accessible de SprX, qui contient un motif riche en C, est impliquée dans la régulation de l'expression de SpoVG et est nécessaire à la modulation de la résistance aux antibiotiques de S. aureus. Nous avons également étudié l'effet des modifications dans la séquence des différentes copies de SprX sur la régulation de l'expression de SpoVG. Ainsi, parmi les deux copies de SprX dans la souche HG001, SprX2 possède une meilleure affinité pour l'ARNm yabJ-spoVG que la copie SprX1. L'ensemble de ces résultats suggèrent que les ARNrég peuvent altérer la résistance des bactéries aux antibiotiques et il est a prévoir que d'autres exemples seront découverts prochainement. / Staphylococcus aureus is a serious human pathogen responsible for both hospital and community-acquired infections. As it becomes alarmingly and increasingly resistant to antibiotics, studies on the mechanisms involved in its virulence is a promising path to develop new treatments. Some, small regulatory RNAs (sRNAs) are important actors in bacterial virulence and pathogenicity. During my thesis, we investigated the functions and the mechanisms of action of a sRNA, named SprX (also known as RsaOR), expressed by the Staphylococcus aureus. First, we demonstrated that, in strains N315 and HG001, SprX expression varies through the growth and among numerous environmental conditions. By a comparative proteomic study, we identified several proteins whose expressions are ‘SprX-dependent’ and elucidated the mechanism of SprX action on one of those proteins. Indeed, SprX interacts specifically with the SpoVG translational initiation site of the yabJ-spoVG mRNA by an antisense mechanism inhibiting its expression. An accessible loop within SprX structure contains a C-rich domain involved in SpoVG regulation and is required and sufficient to modulate bacterial antibiotic resistance. We also studied whether the nucleotides changes between SprX sequence copies could influence SpoVG regulation triggered by SprX. Therefore, among the two copies of SprX in strain HG001, SprX2 has a higher affinity for yabJ-spoVG mRNA than SprX1. Altogether, our results showed that a regulatory RNA can alter bacterial resistance to antibiotics, and additional examples will probably be detected in the near future for more sRNAs and antibiotics.

Ce travail de thèse porte sur l’étude des régulations post-transcriptionnelles en réponse à la lumière chez A.thaliana. Nous avons étudié deux systèmes de réponse à la lumière, la régulation traductionnelle des antennes photosynthétiques (Lhc) et la régulation de la voie des anthocyanes par le RNA silencing permettant la photoprotection. Dans une première partie nôtre approche a permis de montrer que la lumière a un impact sur le niveau de traduction global. De plus nous avons pu mettre en évidence que certaines Lhc sont régulées de façon traductionnelles en réponse à la lumière. Cette régulation pourrait être une composante du signal rétrograde entre le chlorolaste et le noyau. En parrallèle dans une seconde partie nous avons caractérisé la voie TAS4 de RNA silencing chez les plantes. Cette voie est mise en place en réponse à la forte lumière et régule l’accumulation des anthocyanes. / This work concerned post-transcriptional regulations in response to light in Arabidopsis thaliana. We are interested in two light responsive systems, translational regulation of the photosynthetic antenna protein and the regulation of the anthocyanin pathway by RNA silencing.In a first part we have shown that light affects global translation level. Furthermore our data indicate that some Lhc proteins are regulated at translational level in response to light. It seems that transaltional regulation of Lhc is a part of retrograde signaling between chlroroplast and nuclear. In a second part we have characterized the TAS4 RNA silencing pathway in Arabidopsis. We show that TAS4 regulate the accumulation of anthocyanin pathway in respose to high light.

Dans le contexte prébiotique du " monde ARN ", les ribonucléotides sont considérés comme étant les premières espèces à avoir émergé sur Terre. En milieu aqueux, leur formation est défavorable thermodynamiquement. Les voies de synthèse de nucléotides décrites en phase homogène impliquent l'utilisation des molécules activées. En 1951, Bernal a introduit une autre voie de synthèse impliquant des surfaces minérales. Cependant, dans cette voie, les effets thermodynamique et/ou catalytique des surfaces minérales restent inexplorés. Dans le cadre de l'hypothèse de Bernal, notre travail présente pour la première fois une étude in-situ de la réactivité thermique des " briques élémentaires " des nucléotides adsorbés sur des surfaces minérales avec comme objectif de réaliser la synthèse des nucléotides sans activation chimique. Ce travail a montré dans un premier temps que les surfaces minérales sont capables de déclencher la formation de polyphosphates inorganiques à partir de monophosphates à des températures modérées. D'autre part, l'adsorption du ribose sur la surface de la silice a permis d'améliorer sa stabilisation thermique : alors qu'il est instable dès 90°C en milieux aqueux, il devient stable jusqu'à 200°C après adsorption sur la silice. Dans un deuxième temps, nous avons mis en évidence la formation de PRPP, un intermédiaire réactionnel très important, par co-adsorption du ribose avec du phosphate inorganique sur la surface de la silice. Enfin, on a pu montrer la glycosylation de l'adénine et la formation après co-adsorption de ses composants sur les deux surfaces minérales utilisées. Une étude préliminaire suggère même la possibilité de dimérisation des nucléotides. / In the « RNA world» prebiotic scenario, ribonucleotide polymers are considered as the first biochemical species to have emerged. However, in aqueous solution, their formation through conventional mechanisms of condensation is thermodynamically forbidden. Several synthesis pathways of nucleotides have been described in aqueous solution; most often, they involve chemically activated molecules. Another pathway to nucleotides implies mineral surfaces, which have been considered in prebiotic processes at least since the work of Bernal in 1951. However, these studies have hardly tried to understand surface-molecule interactions and consequently, thermodynamic and/or catalytic effects of mineral surfaces are not well rationalized. In the context of Bernal's hypothesis, we present for the first time an in-situ study of the thermal reactivity of nucleotides “building blocks” adsorbed on mineral surfaces (amorphous silica, saponite) emphasizing the synthesis of nucleotides without chemical activation. In our work, we first show that mineral surfaces are able to trigger the formation of inorganic polyphosphates from monophosphates at moderate temperatures. On the other hand, adsorption of ribose on silica surface improves its thermal stabilization. While ribose decomposes at 90°C in aqueous solutions, it is stable up to 200°C on silica (in the presence of ZnCl2). Secondly, we have demonstrated the formation of PRPP, as important reaction intermediate, by co-adsorption of ribose and inorganic phosphate on the silica surface. Finally, we showed the glycosylation of adenine to adenosine and the formation of AMP (i.e. simultaneous glycosylation and phosphorylation) after co-adsorption of their components on both mineral surfaces employed. A preliminary study even suggests that nucleotide dimerisation can occur in the same conditions.