Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 8 p.

La thèse présentée est centrée sur des mesures de force appliquées à des ARN seuls ou en interaction avec une protéine. L'un des plus grands défis posé par l'ARN provient de sa structure, notamment parce que les interactions de ses bases ne se limitent pas aux paires de type Watson-Crick et que les interactions tertiaires sont courantes. Les mesures de force donnent des informations complémentaires aux mesures classiques, car elles permettent de sonder directement les interactions complexes de l'ARN et fournissent des paramètres thermodynamiques inaccessibles autrement. L'étude de l'interaction protéine-ARN par mesure de force permet également d'accéder à des caractéristiques que les autres techniques ne peuvent pas offrir. Néanmoins avant d'atteindre les promesses de ce type de mesure, il faut concevoir un montage adapté et optimisé. Une première partie de la thèse a été dédiée à la conception d'une double pince optique permettant l'étude des ARN avec une résolution proche de la paire de base, en implantant notamment des améliorations techniques jusque là absentes de la littérature. La suite de la thèse s'est attachée à des études biologiques. Nous avons commencé par sonder l'interaction de la protéine ribosomique L20 avec son ARN cible dans le ribosome. Nous avons montré que cette protéine très importante dans les premiers stades de la formation du ribosome, stabilise fortement son ARN cible. Nous avons également déterminé son site de fixation à trois bases près. Nous avons ensuite débuté une étude sur des ARN synthétisés pour l'étude d'une hélicase à motif DEAD en caractérisant leurs réponses à une sollicitation mécanique.

L'acide désoxyribonucléique (ADN) et l'acide ribonucléique (ARN) sont des polymères de nucléotides essentiels à la cellule. À l'inverse de l'ADN qui sert principalement à stocker l'information génétique, les ARN sont impliqués dans plusieurs processus métaboliques. Par exemple, ils transmettent l’information génétique codée dans l’ADN. Ils sont essentiels pour la maturation des autres ARN, la régulation de l’expression génétique, la prévention de la dégradation des chromosomes et le ciblage des protéines dans la cellule. La polyvalence fonctionnelle de l'ARN résulte de sa plus grande diversité structurale. Notre laboratoire a développé MC-Fold, un algorithme pour prédire la structure des ARN qu'on représente avec des graphes d'interactions inter-nucléotidiques. Les sommets de ces graphes représentent les nucléotides et les arêtes leurs interactions. Notre laboratoire a aussi observé qu'un petit ensemble de cycles d'interactions à lui seul définit la structure de n'importe quel motif d'ARN. La formation de ces cycles dépend de la séquence de nucléotides et MC-Fold détermine les cycles les plus probables étant donnée cette séquence. Mon projet de maîtrise a été, dans un premier temps, de définir une base de données des motifs structuraux et fonctionnels d'ARN, bdMotifs, en terme de ces cycles. Par la suite, j’ai implanté un algorithme, MC-Motifs, qui recherche ces motifs dans des graphes d'interactions et, entre autres, ceux générés par MC-Fold. Finalement, j’ai validé mon algorithme sur des ARN dont la structure est connue, tels que les ARN ribosomaux (ARNr) 5S, 16S et 23S, et l'ARN utilisé pour prédire la structure des riborégulateurs. Le mémoire est divisé en cinq chapitres. Le premier chapitre présente la structure chimique, les fonctions cellulaires de l'ARN et le repliement structural du polymère. Dans le deuxième chapitre, je décris la base de données bdMotifs. Dans le troisième chapitre, l’algorithme de recherche MC-Motifs est introduit. Le quatrième chapitre présente les résultats de la validation et des prédictions. Finalement, le dernier chapitre porte sur la discussion des résultats suivis d’une conclusion sur le travail. / Deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) are polymers of nucleotides essential for the survival of the cell. Contrary to DNA, whose main role is to store genetic information, RNA is involved in multiple metabolic processes. For example, RNA is involved in the transfer of information from DNA to protein, the processing and modification of other RNAs, the regulation of gene expression, the end-maintenance of chromosomes, and the sorting of proteins within the cell. This functional versatility of RNA comes from its structural diversity. Our laboratory developed MC-Fold, an algorithm that predicts RNA structures by representing them with nucleotide interaction graphs. The nodes in these graphs represent the nucleotides, and the edges the interactions between them. Our laboratory also observed that a limited number of interaction cycles can define the structure of any RNA motif. The formation of these cycles is determined by the nucleotide sequence and MC-Fold determines the most likely cycles based on that sequence. In this Master Degree project, I first built a database of structural and functional RNA motifs, bdMotifs, based on their constituent cycles. Then, I implemented an algorithm, MC-Motifs, which detects motifs within interaction graphs generated either by MC-Fold or by any other method. Finally, I validated my algorithm on known RNA structures such as the 5S, 16S and 23S ribosomal RNA (rRNA) and predicted structure of riboswitches. The Master thesis is divided into five chapters. The first chapter presents the chemical structure of RNA, its cellular functions and the structural folding of the polymer. In the second chapter, the database bdMotifs is described. In the third chapter, the MC-Motifs algorithm is introduced. In the fourth chapter, I present the results of MC-Motifs. Finally, in the last chapter, I discuss theses results and I give a conclusion on the project.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le concept d’opéron, défini en 1960 par Jacob et Monod comme étant un groupe de gènes transcrits ensemble et dont les produits concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique, est resté jusqu’à tout récemment pratiquement inchangé. Selon ce modèle, toute régulation génétique a lieu au niveau transcriptionnel et est médiée par des facteurs protéiques. Cependant, au cours de la dernière décennie, une révolution a eu lieu alors qu’il fut démontré que des petites molécules d'ARN, appelés sRNAs (small RNAs), sont capables de réprimer de manière post-transcriptionnelle l’expression d’ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Leur mécanisme d'action consiste généralement à inhiber la traduction d'un ARNm en compétitionnant avec la liaison des ribosomes sur le site de liaison des ribosomes (SLR) situé dans la région 5' non traduite d’un ARNm. Cette inhibition de la traduction s’accompagne généralement d'une dégradation rapide de l’ARNm cible. Les recherches que j'ai effectuées au cours de mes études de 2e et 3e cycle ont permis de découvrir des mécanismes alternatifs par lesquels les sRNAs peuvent réprimer l’expression d’ARNm cibles. J'ai tout d’abord démontré que l’expression du petit ARN RyhB lors d'une carence en fer entraîne la dégradation seulement partielle de l’ARNm polycistronique iscRSUA. De plus, j'ai participé à l’élucidation du mécanisme de dégradation d'un ARNm par l’action d'un sRNA. En effet, nous démontrons que le site de clivage de la RNase E se situe plusieurs centaines de nucléotides en aval dans le cadre de lecture de la cible et que l'arrêt de la traduction n'est pas suffisant à l’obtention d'une dégradation rapide d'un ARNm cible. Finalement, j'ai caractérisé un nouveau mécanisme par lequel un sRNA peut réprimer la traduction d’un ARNm en s’appariant loin en amont du SLR par le recrutement de la protéine chaperon Hfq. Nous démontrons que c'est la protéine qui joue le rôle principal dans la compétition avec les ribosomes.

La réparation par excision de nucléotides (NER) retire une grande variété de lésions à l’ADN. Elle s’opère grâce à la participation de plusieurs complexes multi-protéiques afin d’identifier et de réparer l’ADN endommagé dans divers contextes de chromatine et domaines nucléaires. Le nucléole est le domaine le plus transcriptionnellement actif et contient les gènes de l’ARN ribosomal, nécessaires à la formation de ribosomes fonctionnels. La structure de la chromatine particulière de ce locus, où des gènes d’ARN ribosomal ouverts et fermés coexistent, permet d’analyser l’impact de l’accessibilité aux dommages sur l’efficacité de la réparation par la NER. Les travaux présentés dans cette Thèse ont initialement analysés le rôle des gènes RAD4 et RAD34, pendant la NER dans les gènes ouverts et fermés de l’ADNr. Il a été observé que RAD4 est essentiel pour la réparation globale du génome dans ce locus. À l’inverse, RAD34 n’est nécessaire que pour la réparation couplée à la transcription des gènes de l’ARN ribosomal. En somme, malgré que ces deux protéines partagent des homologies de séquences, leurs rôles dans le processus de la NER au niveau du locus de l’ADNr sont distincts et complémentaires. La somme des observations de ce travail fourni des preuves que l’ADNr ouvert est réparé plus rapidement que l’ADNr fermé, ce qui implique qu’une forme ouverte de chromatine peut favoriser la réparation NER in vivo. Par la suite, l’impact des dommages sur la transcription par la polymérase à ARN I (pARN-I) fut aussi analysé afin de définir le destin de ces polymérases suite à la rencontre d’un dommage. En fait, des travaux in vitro tendaient à démontrer que la pARN-I est bloquée à un site de dommage de façon très stable. Les travaux de cette Thèse démontrent, par diverses techniques, qu'in vivo, la pARN-I tombe suite à la rencontre d’une lésion et est dégradée. Finalement, l’étude de l’impact de l’acétylation des histones sur l’efficacité de la réparation par la NER en utilisant le locus de l’ADNr comme modèle fut entamée. En fait, il a été postulé que l’acétylation des histones permettrait un déplacement des nucléosomes de la région endommagée afin d’initier la NER. En augmentant l’acétylation des histones dans l’ADNr, grâce à la délétion du gène SIR2, cette hypoThèse fut analysée.

Certaines maladies neurodégénératives sont associées au mauvais repliement de la protéine prion (PrP[indice supérieur c]) et sont connues sous le nom de maladies à prion ou les encéphalopathies spongiformes transmissibles (ESTs). Récemment, il a été démontré que PrP[indice supérieur c] augmente l'efficacité des micro-ARN (miARN) via son interaction directe avec la protéine Argonaute 2 (Ago2) au niveau de la membrane des corps multivésiculaires (multivesicular bodies (MVBs)). Ago2 est une des protéines centrales du complexe RISC (RNA-induced silencing complex) qui est responsable de l'efficacité des ARNi. Certaines formes pathologiques de PrP[indice supérieur c] induisent l'activation de la réponse au stress eiF2a dépendante, une étape déterminante pour le développement de la pathologie. Cependant, l'activation de la réponse au stress eiF2a dépendante, favorise normalement la survie cellulaire via la formation de deux types de granules d'ARN, les granules de stress (GSs) et les P-Bodies. Aucune étude n'a investigué le rôle de ces deux types de granules d'ARN et de la régulation de l'efficacité des miARN par PrP[indice supérieur c] dans la neurotoxicité associée aux ESTs. Mon premier objectif est d'approfondir nos connaissances sur le nouveau rôle de PrP[indice supérieur c] dans la régulation du système miARN et de l'implication des miARN et du système endosomal dans les ESTs génétiques. Mon second objectif est d'investiguer le rôle des GSs et des P-Bodies, dans la neurotoxicité reliée aux ESTs et établir un lien entre la dérégulation de la réponse au stress et du système ARNi. PrP[indice supérieur c] augmente l'efficacité des miARN via l'interaction de sa région octapeptidique répété (OR, octapeptide repeat region) avec la protéine Ago2. L'effet d'un mutant cytoplasmique artificiel nommé CyPrP (connu comme agent neurotoxique potentiel) et de cinq mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] sur le système endosomal et miARN a été caractérisé. Les mutants de PrP[indice supérieur c] affectent la maturation des MVBs et, conséquemment, induisent une délocalisation de GW182, une diminution l'efficacité des miARN et de la production des exosomes. Nous proposons que cette dérégulation de la voie endosomale et miARN par les mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] contribue à la neurodégénérescence observée dans les ESTs. Les mutants de PrP[indice supérieur c] induisent également l'expression de la protéine PACT qui est responsable de l'activation de la kinase de stress PKR et de la phosphorylation d'eiF2a. Cependant, malgré la phosphorylation d'eiF2a, les mutants familiaux de PrP[indice supérieur c] et PrP[indice supérieur Sc] inhibent la formation des GSs et des P-Bodies augmentant la susceptibilité des cellules aux différents stress. L'inhibition des P-bodies par les mutants confirment également que les mutants de PrP[indice supérieur c] induisent une diminution de l'efficacité des miARN. Je propose que le maintien de l'activation de la voie PACT-PKR-eiF2a et l'inhibition des GSs et des P-Bodies contribuent à la dérégulation du système d'ARNi, à la susceptibilité des neurones et à la neurodégénérescence observée dans les ESTs. Une meilleure compréhension des mécanismes de neurotoxicité plus particulièrement de l'inhibition du système ARNi et de la réponse au stress par les formes mal repliées de PrP[indice supérieur c] peut mener au développement de médicaments afin de contrer l'évolution de la pathologie. [symboles non conformes]

L'estat de l'art de les simulacions de dinàmica molecular és utilitzat per estudiar l'estructura, dinàmica, propietats d'interacció molecular i flexibilitat dels dúplexs d'ADN i ARN en solució acuosa. Les nostres simulacions suggereixen que el concepte de flexibilitat, rigidesa i deformabilitat són molt més complexes del que habitualment es creu, i que per tant no és sempre veritat que l'ADN sigui més flexible que l'ARN.La dinàmica molecular és a més utilitzada per investigar les propietats del híbrid ADN·ARN en solució acuosa i a temperatura ambient. Els resultats obtinguts de la dinàmica esencial i de l'anàlisis d'elasticitat demostren el patró asimètric de flexibilitat del híbrid i la forta predilecció de cada cadena per mantenir els seus moviments intrínsics propis dels homodúplexs. Són debatits les implicacions de les propietats estructurals i dinàmiques úniques del híbrid ADN·ARN en el mecanisme de la RNAsa H.L'estructura i les propietats dinàmiques dels diferents dúplexs antisentit (ADN·ARN, 2'OMe-ADN·ARN, 2'F-AAN·ARN, C5(Y)-propynyl-ADN·ARN, AAN·ARN) i els dúplexs control (ADN·ADN i ARN·ARN) han sigut determinats per llargues simulacions de dinàmica molecular. L'anàlisis de les trajectories donen informació dels determinants moleculars que permeten a la RNAsa H reconèixer i degradar algunes molècules mentre que altres amb una conformació aparentment similar no són afectades.Finalment, explorem la possibilitat de determinar teòricament el canvi d'energia lliure associat a les grans transicions conformacionals de l'ADN, com el canvi B↔A induït per una modificació en el solvent. Trobem que la combinació de dinàmica molecular diana o targeted molecular dynamics i el mètode d'anàlisis dels histogrames ponderats (WHAM, weighted histogram analysis method) poden ser utilitzats per traçar aquesta transició en aigua i etanol/aigua. El camí de la transició en el sentit A→B és un reflexe del trobat en B→A i és dominat per dos processos que passen de manera independent: canvis locals en la conformació del sucre i adabtacions globals de l'estructura. La transició B↔A es pot exlicar com un procés cuasi-harmònic que segueix de ben aprop el primer mode de deformació espontani de l'ADN, mostrant que les deformacions fisiològicament importants estan codificades en el patró de flexibilitat intrínsic de l'ADN. / El estado del arte de las simulaciones de dinámica molecular es utilizado para estudiar la estructura, dinámica, propiedades de interacción molecular y flexibilidad de los dúplexs de ADN y ARN en solución acuosa. Nuestras simulaciones sugieren que el concepto de flexibilidad, rigidez y deformabilidad son mucho más complejos de lo que habitualmente se cree, y que por lo tanto no es siempre verdad que el ADN sea más flexible que el ARN.La dinámica molecular es además utilizada para investigar las propiedades del híbrido ADN·ARN en solución acuosa y a temperatura ambiente. Los resultados obtenidos de la dinámica esencial y del análisis de elasticidad demuestran el patrón asimétrico de flexibilidad del híbrido y la fuerte predilección de cada cadena para mantener sus movimentos intrínsicos propios de los homodúplexs. Son debatidas las implicaciones de las propiedades estructurales y dinámicas únicas del híbrido ADN·ARN en el mecanismo de la RNAsa H.La estructura y las propiedades dinámicas de los diferentes dúplexs antisentido (ADN·ARN, 2'OMe-ADN·ARN, 2'F-AAN·ARN, C5(Y)-propynyl-ADN·ARN, AAN·ARN) i los dúplexs control (ADN·ADN i ARN·ARN) han sido determinados por largas simulaciones de dinámica molecular. El análisis de las trayectorias dan información de los determinantes moleculares que permiten a la RNAsa H reconocer y degradar algunas moléculas mientras que otras con una conformación aparentemente similar no son afectadas.Finalmente, exploramos la posibilidad de determinar teóricamente el cambio de energía libre asociado a grandes transiciones conformacionales del ADN, como el cambio B↔A inducido por una modificación en el solvente. Encontramos que la combinación de dinámica molecular diana o targeted molecular dynamics y el método de análisis de los histogramas ponderados (WHAM, weighted histogram analysis method) pueden ser utilizados para trazar esta transición en aigua y etanol/agua. El camino de la transición en el sentido A→B es un reflejo del encontrado en B→A y es dominante para dos procesos que pasan de manera independiente: cambios locales en la conformación del azúcar y adabtaciones globales de la estructura. La transición B↔A se puede exlicar com un proceso cuasi-harmónico que sigue de cerca el primer modo de deformación espontaneo del ADN, mostrando que las deformaciones fisiológicamente importantes están codificadas en el patrón de flexibilidad intrínsico del ADN. / State of the art molecular dynamics simulations are used to study the structure, dynamics, molecular interaction properties and flexibility of DNA and RNA duplexes in aqueous solution. Our simulations strongly suggest that the concepts of flexibility, rigidity and deformability are much more complex than usually believed, and that it is not always true that DNA is more flexible than RNA.Molecular dynamics is used to investigate also the properties of the DNA·RNA hybrid in aqueous solution at room temperature. The results obtained from essential dynamics and stiffness analysis demonstrate the large and very asymmetric flexibility of the hybrid and the strong predilection that each strand (DNA or RNA) has on the nature of their intrinsic motions in the corresponding homoduplexes. The implications of the unique structural and dynamic properties of the DNA·RNA hybrid on the mechanism of cleavage by RNase H are discussed.The structure and dynamic properties of different antisense related duplexes (DNA·RNA, 2'OMe-DNA·RNA, 2'F-ANA·RNA, C5(Y)-propynyl-DNA·RNA, ANA·RNA and control duplexes DNA·DNA and RNA·RNA) have been determined by means of long molecular dynamics simulations. The analysis provides information on the molecular determinants that allow RNase H to recognize and degrade some of these duplexes, while others with apparently similar conformation are not affected. Finaly, we explore here the possibility of determining theoretically the free energy change associated with large conformational transitions in DNA, like the solvent-induced B↔A conformational change. We find that a combination of targeted molecular dynamics (tMD) and the weighted histogram analysis method (WHAM) can be used to trace this transition in both water and ethanol/water mixture. The pathway of the transition in the A→B direction mirrors the B→A pathway, and is dominated by two processes that occur somewhat independently: local changes in sugar puckering and global rearrangements in the structure. The B↔A transition is found to be a quasi-harmonic process, which follows closely the first spontaneous deformation mode of B-DNA, showing that a physiologically-relevant deformation is in coded in the flexibility pattern of DNA.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 250-258. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.