Répression des genes par le dépôt de la marque H3K27me3. Divers cofacteurs contrôlent sa fonction dans des cellules de différentes origines, comme les gametes. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles murins ou un tag a été introduit dans les gènes Ezh2 et Ezh1, j'ai isolé des extraits nucléaires de testicules adultes entiers et identifié un nouveau polypeptide interagissant avec PRC2. Ce dernier est spécifiquement exprimé dans les gonades et sa fonction est inconnue. J'ai confirmé son interaction avec PRC2 et montré qu'il pourrait recruter PRC2 à la chromatine. Grâce à un modèle de souris knock-out, j'ai démontré que la protéine est nécessaire pour la fertilité féminine, alors que son ablation apporte une augmentation globale de la marque associée à PRC2, dans les cellules germinales masculines avec peu de conséquences sur la fertilité. J'ai également contribué à la caractérisation de l'interaction entre le long ARN non-codant HOTAIR et PRC2. Nombreux ARNnc ont été proposés pour moduler l'action des complexes modifiant la chromatine. Avec l'aide d'un nouveau système de recrutement artificiel d'ARN, l'expression induite par HOTAIR provoque une répression transgénique indépendamment de PRC2. La surexpression forcée de HOTAIR a également peu d'impact sur le transcriptome dans des cellules cancéreuses. En conclusion, la liaison PRC2 à l'ARN n'est pas requise pour le ciblage de la chromatine. / The Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) plays an essential role in development by maintaining gene repression through the deposition of H3K27me3. A variety of cofactors have been shown to control its function in cells of various origins however little is known about PRC2 regulation during gametogenesis. During my PhD, I took advantage of murine models where Ezh2 and Ezh1 were knocked-in, I isolated nuclear extracts from whole adult testis and, identified a new polypeptide interacting with PRC2. This protein is specifically expressed in gonads, is of unknown function and does not contain any conserved domain. I have confirmed its interaction with PRC2, identified the domain of interaction with PRC2 and shown that it could tether PRC2 to chromatin. Thanks to a knockout mouse model, I demonstrated that the protein is required for female fertility, whereas its ablation brings to a global increase of H3K27me3 PRC2-associated mark in male germ cells with little consequences on male fertility. I also contributed to the characterization of the interplay between the long non-coding RNA (lncRNA) HOTAIR and PRC2 complex. Many lncRNAs have been proposed to modulate chromatin-modifying complexes action on chromatin. With the help of novel RNA-tethering system, HOTAIR inducible expression causes transgene repression independently from PRC2. Forced overexpression of HOTAIR also has little impact on transcriptome in breast cancer cells. Generally, PRC2 binding to RNA is not required for chromatin targeting. Taken together these results shed light to the mechanism of a new-identified cofactor regulating PRC2 in the gonads and contribute to dissect PRC2-RNA relationship at molecular level.

Estudia la asociación del SNP rs3749166 con la diabetes tipo 2 en una muestra peruana. Este estudio incluyó a 264 individuos (67 pacientes diagnosticados con diabetes tipo 2 y 197 controles). Se identificaron los genotipos mediante la técnica de análisis de alta resolución de fusión. Para determinar las asociaciones de genotipos con la diabetes tipo 2, utilizamos las proporciones de probabilidades de los modelos de regresión logística ajustados y en crudo. Se encontró 2 alelos (A>G) con frecuencias similares. La frecuencia del alelo menos común fue de 0.44 y 0.43 para el grupo control y paciente, respectivamente. También se encontraron 3 genotipos (A/G > A/A > G/G), en equilibrio de Hardy-Weinberg, en ambos grupos; sin embargo, el rs3749166 no mostró ninguna asociación significativa con la diabetes tipo 2, ya sea en los modelos en crudo o ajustado. En conclusión, el SNP rs3749166 no está asociado con la diabetes tipo 2 en la muestra estudiada. Por lo revisado, tal parece que este trabajo sería el primero que ha estudiado la asociación entre rs3749166 con diabetes tipo 2 en una muestra peruana. Se espera que esta investigación proporcione información valiosa acerca del componente genético de esta enfermedad en la población peruana, mediante la muestra de Lima acá estudiada. / Tesis

L’autisme est un syndrome neuro-développemental hétérogène à l’étiologie génétique complexe. Afin d’identifier les dérèglements initiaux responsables de ce mal-développement cérébral, des travaux antérieurs au sein de notre équipe se sont basés sur des cellules représentatives des stades précoces de l’ontogenèse : les cellules souches olfactives. Le gène MOCOS, codant pour la sulfurase du cofacteur à molybdène, a été trouvée sous-exprimé chez la majorité des patients autistes comparés à des sujets contrôles de même âge et du même sexe.Nous avons ensuite postulé que la dissection minutieuse des mécanismes moléculaires pouvant rendre compte de cette dérégulation aiderait à trouver des mécanismes sous-jacents contribuant aux troubles du spectre autistique (TSA). Ceci a conduit à l'identification de COSMOC, un long ARN non codant généré à partir d'une transcription divergente dans la région promotrice de MOCOS, dont l'expression est diminuée chez 10 des 11 patients autistes de notre cohorte. A l’aide de diverses techniques de biologie moléculaire, nous avons montré que la déplétion de COSMOC induit : (1) une sous-expression de MOCOS, (2) une déstabilisation de l'organisation de la chromatine, ce qui suggère une fonction de régulateur transcriptionnel, et (3) une altération du métabolisme des lipides et de l’homéostasie redox de la cellule, deux voies dérégulés dans les TSA. Par ailleurs, COSMOC régule de l’expression de la PTBP2 (polypirimidine track biding protein 2), un facteur d’épissage contrôlant l’expression de nombreuses protéines synaptiques. En conclusion, la dérégulation de COSMOC pourrait expliquer certains des dysfonctionnements observés dans les TSA. / Autism is a heterogeneous neuro-developmental syndrome with a complex genetic etiology. In order to unveil the initial disturbances responsible for this brain maldevelopment, previous works in our team relied on cells representative of the early stages of ontogenesis: olfactory stem cells. The MOCOS gene, coding for molybdenum cofactor sulfurase, was found under-expressed in most of autistic patients of our cohort when compared with age- and gender-matched control adults without any neuropsychiatric disorders. We postulated that the meticulous dissection of the molecular mechanisms involved this deregulation would help to unveil pathogenic mechanisms underlying autism spectrum disorders (ASD). This led to the identification of COSMOC, a long non-coding RNA, generated from a divergent transcription in the promoter region of MOCOS, whose expression is decreased in 10 out of 11 autistic patients in our cohort. Using various molecular biological techniques (interference RNA, DNA microarray, qPCR...), we showed that COSMOC depletion induces: (1) an under-expression of MOCOS, (2) a destabilization of chromatin organization, suggesting a transcriptional regulatory function, and (3) an alteration of cellular lipid metabolism and redox homeostasis, two deregulated pathways in ASD. In addition, COSMOC regulates the expression of PTBP2 (polypirimidine track biding protein 2), a splicing factor that controls the expression of many synaptic proteins, including PSD95. In conclusion, the deregulation of COSMOC may explain some of the dysfunctions observed in ASDs.

L'ARN interférence est un mécanisme moléculaire conservé chez les Eucaryotes dont les principaux acteurs sont les protéines ARGONAUTE (AGO). Chez les plantes, AGO1 est une protéine essentielle à la croissance et la défense antivirale. Elle utilise des petits ARNs comme sondes pour reconnaître et réguler des ARN messagers. Les virus ont développé des suppresseurs de l'ARN interférence pour surmonter cette défense. L'un d'entre eux, P0 du virus de la mosaïque jaune du navet, est comme une protéine F-box qui détourne le complexe SCF, une ubiquitine ligase E3, et conduit AGO1 vers la protéolyse ubiquitine-dépendante. Cette dégradation utilise la vacuole au lieu du protéasome 26S, généralement associé à la dégradation ubiquitine-dépendante. Ce mécanisme de protéolyse n'est pas compris et est aussi apparent quand AGO1 est déstabilisé de manière endogène, suggérant que P0 utilise une voie déjà existante. Une protéine F-box d'Arabidopsis, FBW2, a été décrite comme impactant l'homéostasie d'AGO1 indépendamment du protéasome. Mon projet de thèse visait à caractériser l'activité F-box de FBW2 et à comprendre la relation entre AGO1 et FBW2 ainsi que ses conséquences sur l'ARN interférence. Les résultats obtenus dans ce manuscrit montrent que le complexe SCFFBW2 interagit avec AGO1 et déclenche sa dégradation via un processus indépendant de l'autophagie ou du protéasome, tout en n'affectant que faiblement l'ARN interférence. FBW2 ciblerait en fait un sous-ensemble de protéines AGO1 qui semble ne pas contenir de petits ARNs. Cette régulation jouerait un rôle de surveillance pour prévenir une activité délétère d'AGO1 en absence de petits ARNs. / RNA silencing is a conserved molecular mechanism in eukaryotes, of which the main effectors are the ARGONAUTE (AGO) proteins. In plants, AGO1 is a protein that is essential for growth and antiviral defence. It uses small RNAs as probe to recognize and regulate messenger RNAs. Viruses have developed suppressors of RNA silencing to overcome this defence. One of these, P0 from the Turnip Yellows Virus, acts as an F-box protein to hijack the SCF complex, an E3 ubiquitin ligase, and guide AGO1 to the ubiquitin-dependent proteolysis. This degradation uses the vacuole instead of the 26S proteasome, generally associated with ubiquitin-dependant proteolysis. This proteolysis mechanism is not understood and is also apparent when AGO1 is endogenously destabilized, suggesting that P0 uses an already existing pathway. An Arabidopsis F-box protein, FBW2, has been shown to impact AGO1 homeostasis independently from the proteasome. My PhD project aimed at characterizing FBW2 F-box activity and understanding the relationship between AGO1 and FBW2, as well as its consequences on the RNA silencing. The results obtained in this manuscript show that the SCFFBW2 interacts with AGO1 and triggers its degradation through an autophagy- and proteasome- independent process, while only weakly affecting the RNA silencing. FBW2 would actually target a subset of AGO1 proteins, which appears not to contain small RNAs. This regulation would play a surveillance role in order to prevent a deleterious activity of AGO1 in absence of small RNAs.

Les miARN sont de petits ARN non codant dont la taille varie entre 21-24 nucléotides. Ils jouent un rôle de régulateurs post-transcriptionnels en utilisant leur complémentarité de séquence avec l’ARN messager (ARNm) cible afin d’induire sa répression. Grâce à la protéine Argonaute 2 (Ago2) dans laquelle les miARN sont incorporés formant ainsi le complexe miRISC, des cofacteurs sont recrutés afin d’induire la dégradation ou le blocage de la traduction de l’ARNm cible. Initialement connus pour réguler leurs cibles dans le cytoplasme, les miARN sont de plus en plus décrits comme étant des régulateurs de l’expression génique au niveau nucléaire. Dans ce travail, nous avons démontré la présence, au sein du noyau, d’un nouveau mécanisme de régulation post-transcriptionel par les miARN dont les facteurs majeurs sont Sfpq et Pspc1 / Micro-RNA, nuclear regulation, gene silencing, SfpqThere is a growing body of evidence about the presence and the activity of the miRISC in the nucleus of mammalian cells. Here we show by quantitative proteomic analysis that Ago2 interacts with the complex formed by Sfpq, Pspc1 and NonO in a RNA-dependent fashion. Sfpq mediates the interaction between miRISC with Pspc1 and NonO in the nucleoplasm. By HITS-CLIP coupled with transcriptomic analysis, we demonstrated that Sfpq specifically controls the downregulation of a subset of crucial let-7a-target mRNAs in stem cells, including Lin28a, Prtg, and Igf2bp1. Sfpq directly binds to specific sequence in the 3'UTR to promote the recruitment of selected nucleoplasmic miRNAs and triggers the decay, as we show for Lin28a mRNA. These results extend the miRNA-mediated post-transcriptional gene silencing into the nucleus and indicate that a dual strategy

Les éléments transposables (ET) ont un impact majeur sur le fonctionnement etla dynamique des génomes, à l’échelle de l’individu et de l’espèce. Le cilié Parameciumest un modèle original pour l’étude des ET. Chaque individu unicellulaire a un génomegerminal qui subit, lors des processus sexuels, des réarrangements massifs, comprenantl’élimination des ET et de leurs vestiges à copie unique, pour former un génome somatiqueoptimisé pour l’expression des gènes. La programmation épigénétique de cesréarrangements implique des petits ARN dans un processus complexe de soustractiongénomique.Au cours de ma thèse, j’ai effectué des analyses bioinformatiques et biostatistiques dedonnées hétérogènes à l’échelle du génome pour : (i) Identifier et analyser des propriétésintrinsèques, de dizaines de milliers de vestiges d’ET à copie unique, appelés "InternalEliminated Sequences" (IES). (ii) Comprendre le rôle de déterminants génétiques et dedifférents facteurs épigénétiques dans le ciblage et l’élimination des IES.L’ensemble de ces analyses met en lumière la co-Évolution des ET et des mécan-Ismes de défense de l’hôte. / Transposable elements (TE) have major impact on the function and dynamicsof genomes, both at the level of the individual and of the species. The ciliate Parameciumprovides an original model for studies of TE. Each individual unicell has a germlinegenome that undergoes massive rearrangements at each sexual generation including thephysical elimination of TE and their single copy remnants, yielding a somatic genomestreamlined for gene expression. The epigenetic programming of the rearrangementsinvolves small RNAs in a complex process of genomic subtraction.During my thesis, I carried out bioinformatic and biostatistical analyses of heteroge-Neous, genome-Scale datasets in order to : (i) Identifiy and study the intrinsic propertiesof tens of thousands of TE remnants know as "Internal Eliminated Sequences" (IES).(ii) Explore the roles of genetic determinants and epigenetic factors in the targeting andelimination of the IESs.Taken together, the studies illustrate the co-Evolution of TE and host defense mecha-Nisms.

Les recherches menées au cours de cette thèse visent à améliorer la qualité de prédiction des structures secondaires d'ARN avec pseudo-nœuds par l'approche thermodynamique. Elles se sont focalisées sur ses deux composantes essentielles : le modèle d'énergie libre qui paramètre les repliements de l'ARN et l'algorithme qui propose les repliements les plus vraisemblables. Bien que la question du modèle d'énergie libre soit considérée comme close à l'heure actuelle, il m'est apparu nécessaire et possible de repenser la manière dont il est calibré. Le principe de TT2NE, un nouvel algorithme de prédiction, est également exposé. Son efficacité repose sur une nouvelle classification des pseudo-nœuds à l'aide du genre, un indice topologique dont j'illustre par ailleurs la pertinence par une analyse qualitative et quantitative des bases de données disponibles. Au final, sans être arrivé au terme de tous les développements possibles des travaux engagés, les résultats obtenus sont prometteurs et améliorent l'état de l'art de ce problème.

Résumé non disponible

Chez les Eucaryotes, la transcription du génome nucléaire est assurée par trois formes d'ARN polymérase ADN dépendantes (Pol I, II et III) qui transcrivent chacune une classe spécifique de gènes. Ainsi, la Pol I transcrit uniquement le gène codant le précurseur des grands ARN ribosomiques. La transcription Pol I est extrêmement active et représente plus de 60% de l'activité transcriptionnelle totale de la cellule en phase exponentielle de croissance. La transcription nucléaire dans sa globalité est réprimée dans de nombreuses conditions, notamment lors d'une carence en nutriments (qui peut être mimée par un traitement à la rapamycine). Nous avons étudié chez la levure S. cerevisiae les effets de traitements longs à la rapamycine sur la transcription Pol I. Grâce à une souche mutante de levure (souche CARA) dans laquelle la Pol I est constitutivement active, nous avons montré que le niveau de transcription Pol I contrôle le niveau de biogenèse des ribosomes. En présence de rapamycine et pour des temps courts de traitement, la répression de la transcription Pol I est atténuée dans la souche CARA par rapport à la souche sauvage (WT). Cependant, au bout de 4h de traitement, le niveau de transcription devient non détectable dans les deux souches et, de façon remarquable, la structure du nucléole est conservée dans la souche CARA alors que le nucléole est totalement déstructuré dans la souche WT. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine et des analyses par Miller spread ont permis de montrer que même après 4h de traitement à la rapamycine, la Pol I reste associée à l'ADNr dans les cellules CARA, alors que dans les cellules WT, une très forte diminution de l'occupation de l'ADNr par la Pol I est observée dès quelques minutes de traitement. Ces données constituent la première demonstration d'un découplage entre l'activité de transcription Pol I et le maintien de l'intégrité de la structure du nucléole. Dans une deuxième partie nous avons initié l'étude mécanistique de la transcription Pol I in vitro afin de déterminer les conséquences sur les différentes étapes du cycle transcriptionnel de l'association covalente du facteur Rrn3 avec l'enzyme. La seule différence entre les cellules WT et CARA étant a priori que le complexe Pol I-Rrn3 n'est pas dissociable dans la souche CARA. Nos résultats suggèrent un modèle selon lequel le complexe Pol I-Rrn3 se dissocie très rapidement lors de l'étape d'initiation. Cette dissociation est une étape nécessaire pour que l'ADNr 35S soit transcrit efficacement.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au facteur de transcription TFIIS, un facteur d'élongation de l'ARN polymérase II impliqué dans la stimulation de l'activité de clivage intrinsèque de cette enzyme. L'étude de la localisation globale du facteur TFIIS sur le génome de Saccharomyces cerevisiae par ChIP-on-chip a révélé que TFIIS, en plus d'être présent sur les gènes de classe II (ie. transcrits par l'ARN polymérase II), est également présent sur l'ensemble des transcrits de classe III (ie. transcrits par l'ARN polymérase III), suggérant ainsi un rôle jusqu'alors inconnu de cette protéine dans la transcription par l'ARN polymérase III. Des expériences de génomique, de génétique et de biochimie nous ont permis de montrer que TFIIS est un facteur de transcription de l'ARN polymérase III impliqué dans le choix du site d'initiation de la transcription. Par la suite, j'ai souhaité poursuivre cette étude chez Mus musculus, afin de déterminer, entre autres, si le rôle de TFIIS dans la transcription par l'ARN polymérase III est conservé chez les eucaryotes pluricellulaires. Des expériences préliminaires révèlent que Tcea1, l'une des isoformes de TFIIS chez M. musculus, serait présent sur quelques gènes de classe II et III. Lors de ma thèse, j'ai également pris part à deux autres projets en cours dans le laboratoire. L'un a porté sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique coactivateur de la transcription par l'ARN polymérase II, dans la mise en place du complexe de préinitiation via le recrutement du facteur TFIIH. Le second projet a permis de montrer que l'ARN polymérase II agit comme un senseur de la disponibilité en nucléosides triphosphates dans la cellule.