Chez Arabidopsis thaliana, Les gènes d'ARN 5S sont regroupés en blocs situés dans l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. La transcription des gènes d'ARN 5S est régulée par des facteurs épigénétiques altérant notamment leur structure chromatinienne. Une étude a été menée durant les premières étapes du développement post-germinatif pour identifier les évènements et des facteurs conduisant à l'élaboration de telles structures. Nous avons pu observer une décompaction de l'ADNr 5S immédiatement suivie d'une recondensation. Ces phénomènes impliquent respectivement ROS 1 et l'ARN polymérase IV. L'étude des formes Pol IVa et Pol IVb nous indique que Pol IVb, en plus de son activité partenaire de Pol IVa, possède une action spécifique dédiée au locus d'ADNr 5S du chromosome 4. Cette nouvelle activité de Pol IVb, qui est indispensable au silencing et à la compaction de ce locus, semble indépendante de la voie classique de méthylation de l'ADN dépendante des ARN.

Depuis 1991, année de mon recrutement au CNRS, mon activité de recherche est centrée sur l'étude d'une famille d'enzymes intervenant dans la biosynthèse protéique : les aminoacyl-tRNA synthétases. Mon travail s'est articulé autour de l'étude de leur organisation fonctionnelle et de la compréhension des bases moléculaires de la reconnaissance spécifique entre ces enzymes et leurs substrats. Des approches multidisciplinaires (biologie moléculaire, biochimie, cristallographie aux rayons X, enzymologie et génétique) ont été mises en œuvre pour une exploration globale de ces problèmes. Nous avons pu progresser dans la connaissance de deux enzymes modèles : l'aspartyl-tRNA synthétase et l'arginyl-tRNA synthétase, deux enzymes appartenant respectivement à la classe II et à la classe I des aminoacyl-tRNA synthétases. Nous avons localisé les sites de fixation des différents substrats, proposé des mécanismes catalytiques et sélectionné in vivo des variants d'aminoacyl-tRNA synthétases et de tRNAs aux propriétés de reconnaissance modifiées.

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un pathogène infectieux qui est associé à une hépatite fulminante chez l'humain. Ce virus possède un génome circulaire d'ARN simple brin comportant deux régions auto-catalytiques (ribozymes). Ce travail a pour but d'étudier le mécanisme moléculaire ainsi que le sentier de repliement tridimensionnel subit par ce ribozyme au cours de l'événement de coupure. Afin d'atteindre ce but, nous avons identifié toutes les interactions incluant les bases des ribonucléotides composant le coeur catalytique de ce ribozyme. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de sélection in vitro (SELEX). Malgré son utilisation commune pour l'étude du ribozyme VHD, l'approche de SELEX n'a jamais donné de résultats concluants au sujet de la tectonique de ce ribozyme pendant l'événement de coupure. Ceci est dû au fait que dans toutes les analyses précédentes, le site catalytique du ribozyme n'a jamais été totalement dégénéré. Par conséquent, nous avons développé une stratégie de SELEX unique qui nous a permis de dégénérer la presque totalité du site catalytique et de sélectionner tous les ribozymes actifs existant dans la librairie combinatoire. Au contraire des stratégies de sélection basées sur l'utilisation du ribozyme en trans, la stratégie que nous avons développée est basée sur l'utilisation du ribozyme en cis. Cette stratégie nous a permis de dégénérer des nucléotides de la tige P1 connus pour être étroitement impliqués dans des interactions tertiaires avec des nucléotides du site catalytique. La preuve initiale du concept a été réalisée en dégénérant les six nucléotides formant la jonction entre la tige P4 et la tige P2 (J4/2). Les ribozymes sélectionnés après quatre cycles d'enrichissement possédaient une activité de coupure comparable à celle du ribozyme de type sauvage. Ce résultat montre que la stratégie développée est, non seulement fonctionnelle, mais aussi très efficace. La stratégie a ensuite été utilisée pour sélectionner des variants actifs du ribozyme à partir d'une librairie combinatoire contenant plus de 7.5x10[indice supérieur 15] mutants différents. Après 13 cycles de sélection, la population de ribozymes actifs commençait à être détectable. L'analyse des mutants sélectionnés a révélé une très faible variabilité entre les séquences. Ceci constituait une entrave pour l'étape suivante qui consiste à analyser la covariation des nucléotides dégénérés afin de définir le réseau des interactions tertiaires qui réunit ces nucléotides et qui est à l'origine de sa structure tridimensionnelle. La faible variabilit des séquences sélectionnées est due à la dominance des variants les plus actifs camouflant ainsi ceux qui étaient moins actifs. Face à cette situation, nous avons fait un réajustement de notre stratégie de sélection afin d'éviter cette dominance et de donner à tous les ribozymes actifs la même chance d'être amplifié. Nous avons recommencé la sélection en utilisant les nouveaux réajustements et le séquençage de plus de 500 clones a été réalisé, nous conduisant à 150 ribozymes de séquences différentes. Nous avons développé par la suite un programme informatique qui nous a permis d'analyser la covariation des nucléotides aux positions dégénérées. Les résultats de cette analyse de covariation sont en parfaite concordance avec la structure secondaire du ribozyme VHD antigénomique. En effet, toutes les paires de bases de type Watson-Crick, Wobble et homopurine ont été confirmées à l'exception de la paire de base C19-G81 au bas de la P2. L'analyse bioinformatique suggérait une faible covariation entre ces deux nucléotides et montre une forte interaction entre le C19 et le G80. Cette interaction a été prouvée par cartographie enzymatique et chimique. Bien que cette nouvelle interaction engendre un changement minime dans la structure secondaire du ribozyme VHD antigénomique, ce changement est très significatif. En effet, suite à cette interaction, la nouvelle structure secondaire du ribozyme antigénomique se rapprochait étonnamment de celle du ribozyme de version génomique, suggérant ainsi un lien phylogénique entre ces deux ribozymes. Le ribozyme VHD est naturellement actif dans les cellules humaines (les hépatocytes), mais son utilisation comme outil de thérapie génique fait toujours face à un problème majeur de spécificité. Afin de résoudre ce problème et de mieux contrôler ce ribozyme au niveau cellulaire, nous avons tenté de remodeler ce ribozyme pour le transformer en un ribozyme allostérique, toujours en utilisant la stratégie de sélection in vitro. Nous avons choisi comme cofacteur la protéine tat du VIH. Dans ce système où le cofacteur est une molécule de la cible, le ribozyme allostérique va avoir non seulement un gain de spécificité mais deviendra auto-inductible par sa cible, exactement à la manière d'un anticorps. En résumé, ce travail a permis de jeter un nouveau regard sur le site catalytique du ribozyme VHD tout en poussant la méthode de SELEX à un nouvel extrême.

L’avancement des connaissances sur la biologie de l’ARN progresse à un rythme effréné. En effet, les découvertes des dernières années ont confirmé l’importance de l’ARN comme régulateur. Par exemple, de courtes molécules d’ARN, appelées sRNA (small RNA), ont été identifiées comme régulateurs post-transcriptionnels majeurs, capables de moduler l’expression des ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Généralement, le mode d’action de ces sRNA consiste à s’attacher de manière anti-sens à leurs ARNm cibles, au site de la liaison du ribosome située dans la région 5′ non traduite de l’ARNm. L’inhibition de la traduction par le sRNA conduit, dans la majorité des cas, à la dégradation rapide de l’ARNm. Dans le cadre de mes travaux de recherche, j’ai participé à modéliser, à partir de données biologiques, certains mécanismes de régulation de cibles ARNm. Plus précisément, deux des sRNA, parmi les mieux caractérisés chez E. coli, soient RyhB et Spot42, ont été analysés. Cette étude a montré qu’un sRNA peut réguler ses cibles selon différents régimes (efficace ou modéré) en fonction du mode de régulation priorisé par le sRNA, et ce, indépendamment de son abondance relative. Ces résultats permettront d’améliorer notre compréhension et notre capacité à prédire l’efficacité d’un sRNA à réguler ses cibles ARNm. Par des recherches subséquentes, il m’a été possible de démontrer que l'expression de l’ARNm encodant pour la protéine aconitase B était régulée de manière antagoniste à la fois par le sRNA RyhB et par la protéine aconitase B et ce, dans une condition de carence en fer. Par la suite, j’ai pu mettre en évidence un deuxième mécanisme de régulation similaire pour l’ARNm grxD, encodant pour la glutharédoxine D. Jusqu'à ce jour, le sRNA RyhB démontrait une efficacité infaillible pour dégrader ses ARNm cibles. Les résultats obtenus durant ce projet démontrent sans équivoque une nouvelle voie de protection permettant à l’ARNm d'éviter la dégradation par un petit ARN régulateur. Ce mécanisme de protection de l'ARNm ouvre la porte à un tout nouveau processus cellulaire de régulation post-transcriptionnelle qui s'étend sûrement à un groupe plus important d’ARN.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le VIH-1 est un rétrovirus contenant deux copies de son génome ARN simple brin positif. Dans la cellule, son ARN est rétrotranscrit en ADN puis cet ADN est intégré dans le génome cellulaire. L'ADN viral est ensuite transcrit en ARN dont la moitié évite l'épissage. Dans le cytoplasme, cet ARN possède une double fonctionnalité : il sert d'ARNm pour la synthèse des protéines Gag et Gag-Pol et d'ARN génomique (ARNg) qui est encapsidé sous forme de dimère. Malgré sa faible abondance dans la cellule, l'ARNg est préférentiellement encapsidé. Cependant, il a été montré par nous et d'autres que d'autres ARN non-génomiques peuvent également être spécifiquement encapsidés, tels que des ARN viraux épissés et certains ARN cellulaires, bousculant ainsi le dogme d'une spécificité unique pour l'ARNg. Nous avons montré que le VIH-1 contrôlerait l'incorporation des ARN viraux, épissés et non épissés, par un mécanisme de compétition, impliquant des facteurs communs. En revanche, les ARN cellulaires 7SL et U6 semblent encapsidés par des mécanismes indépendants. Afin d'identifier les déterminants qui régissent la spécificité d'encapsidation, nous avons testé le rôle de la nucléocapside (NC) qui est fortement impliquée dans l'encapsidation. Nous montrons ici que de façon tou t à fait inattendue, des mutations de NC conduisent à l'encapsidation d'ADN et augmentent également l'encapsidation d'ARN viraux épissés. Nous avons ensuite cartographié les déterminants de la région 5' UTR de l'ARNg et déterminé que la tige-boucle polyA et la région PBS sont impliquées dans l'encapsidation des ARN viraux épissés. Ce travail apporte une meilleure compréhension de la spécificité d'encapsidation, primordiale pour la mise au point de thérapies géniques utilisant des vecteurs lentiviraux. / HIV-1 is a retrovirus containing two copies of its single stranded positive RNA genome. In the cell, its RNA is reverse transcribed into DNA and this DNA is integrated into the cellular genome. The viral DNA is then transcribed into RNA. One moiety of this RNA pool escapes splicing. Once in the cytoplasm, this RNA has a double function: it serves as mRNA for synthesis of Gag and Gag-Pol proteins and as genomic RNA (gRNA) that is packaged as a dimer. Despite its low abundance in the cell, the gRNA is preferentially encapsidated into virions. However, it has been shown by us and others that other non-genomic RNA can be specifically packaged, such as spliced viral RNA and some cellular RNA, thus shaking up the dogma of a unique specificity for the gRNA. We have shown that HIV-1 might control the incorporation of the spliced and unspliced RNA by a mechanism of competition, involving common factors. In contrast, cellular RNA 7SL and U6 seem encapsid ated through independent mechanisms. To identify the determinants that govern the specificity of encapsidation, we tested the role of the nucleocapsid (NC) which is strongly involved in the packaging. Here we show that unexpectedly, mutations of NC lead to the encapsidation of DNA and also increase the encapsidation of spliced viral RNA. We then mapped the determinants in the 5' UTR of the gRNA and determined that the polyA stem-loop and the PBS region are involved in the encapsidation of the spliced viral RNA. This work provides a better understanding of the specificity of encapsidation that is crucial for the development of gene therapy using lentiviral vectors.

Les relations entre les histones qui composent les nucléosomes et le processus de transcription des gènes codants, sont à la fois multiples et extrêmement complexes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à deux de ces relations. Tout d’abord, une première étude a été réalisée en collaboration avec les laboratoires de Franck Holstege et de Catherine Dargemont. Ce travail permet de préciser clairement l’effet des différentes formes de méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 sur l’activité transcriptionnelle. Dans cette étude nous démontrons que la méthylation de H3K4 n’influence la transcription que d’un nombre très limité de gènes. Concernant ces gènes, un profil non conventionnel de distribution des formes de méthylation de H3K4 a été identifié par la présence inhabituelle d’un enrichissement en 3’ de ces gène des formes di- et triméthylées de H3K4.L’effet majoritaire de cette marque est d’induire une répression transcriptionnelle selon au moins deux mécanismes distincts. L’enrichissement atypique de la triméthylation de H3K4 influence négativement l’expression des gènes via la production d’ARN non codant anti-sens. Concernant l’effet répressif associé à la diméthylation de H3K4, la quantité d’ARN anti-sens ainsi que sa production ne sont pas impliquées.Dans une seconde étude réalisée en collaboration avec les laboratoires de Sebastian Chavez etd’Akash Gunjan, nous nous sommes intéressés au complexe FACT qui est impliqué dans l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes lors du passage de l’ARN polymérase II. Jusqu’alors, un défaut de croissance chez les mutants thermosensibles du complexe FACT avait pu être observé. Dans notre étude, nous montrons que l’altération de FACT conduit, lors de la transcription, à l’éviction d’histones normalement incorporées à la chromatine. L’accumulation de ces histones libres à fort potentiel toxique, induit une répression spécifique de CLN3 qui code pour la première cycline dephase G1. Pour la première fois, nous mettons en évidence dans cette étude l’existence d’un mécanisme de surveillance moléculaire du cycle cellulaire induit par l’excès d’histones non incorporées à la chromatine / Relationships between histones, components of nucleosomes, and the transcription process of coding genes are both multiple and extremely complex. During my Thesis, I looked at twoof these relationships. First, we performed a study in collaboration with the Franck Holstedge and Catherine Dargemont labs. This work has allowed us to clearly define the effect of various methylation forms of the lysine 4 of the histone 3 on gene transcription. In this study we have shownthat H3K4 methylation influences the transcription of only a very limited number of genes. For these genes, a non conventional distribution profile of H3K4 methylation forms has been identified by the presence of an unusual enrichment in di- and trimethylated H3K4 in the 3’ of these genes. The principal effect of this mark is to promote transcriptional repression by at least two distinct mechanisms. The atypical enrichment of H3K4 trimethylation negatively influences gene expressionvia the production of non coding antisense RNA. For the repressive effect associated with dimethylH3K4, the quantity of antisense RNA as well as its production are not involved. We propose severalh ypotheses that link our results to the data known on this subject. In a second study performed incollaboration with the Sebastian Chavez and Akash Gunjan labs, we concentrated on the FACT complex that is involved in the assembly and disassembly of nucleosomes as RNA polymerase IImoves past. Previously, a growth defect in thermosensitive mutants of the FACT complex had been observed. In our study, we show that FACT deterioration leads to the eviction of histones that arenormally incorporated into chromatin during transcription. The accumulation of these free histones,which have a high toxic potential, induces the specific repression of CLN3 which encodes for the firstcyclin of G1 phase. For the first time, we show in this study the existence of a cell cycle molecular surveillance mechanism that is induced by an excess of free histones

Bacillus cereus est une bactérie largement disséminée dans la nature, contaminant ainsi les aliments en contact avec le sol. En France, cette bactérie est considérée comme le quatrième agent de toxi infection alimentaire collective. Pour être pathogène, B. cereus doit être capable de se multiplier lors des différentes étapes de transformation et notamment au cours de la réfrigération. Le but de cette étude a été d'étudier les mécanismes moléculaires de la réponse adaptative au froid et en particulier le rôle des hélicases à ARN de B. cereus ATCC 14579. Le gène cshA, codant pour une hélicase à ARN putative, a été identifié par une approche de mutagénèse aléatoire, comme jouant un important dans l’adaptation au froid de B. cereus. La souche ATCC 14579 possède 5 gènes codant pour des hélicases à ARN, cshA à cshE qui sont tous fortement surexprimés à 10°C par rapport à 37°C et quel que soit le stade de croissance considéré. La délétion simple des gènes cshA, cshB et cshC conduit à l’apparition de phénotypes cryosensibles, se traduisant par une incapacité d'adaptation au froid par rapport à la souche sauvage, associée à une modification de la morphologie cellulaire. De plus, CshA, CshB et CshC possèdent chacune un domaine de température où leur action est prépondérante. Elles semblent également être impliquées dans l’adaptation au stress oxydant et au stress basique, alors que CshD et E n’ont pas de rôle dans l’adaptation aux stress testés. Nous avons montré que CshA est indispensable à basse température, pour permettre le maintien de la stabilité des ribosomes avec lesquels elle interagit directement, mais aussi pour réguler la dégradation des ARNr. L’identification des partenaires protéiques interagissant avec CshA suggérent qu'elle puisse être également impliquée dans un complexe de dégradation des ARN / Bacillus cereus is a widespread bacteria, thus contaminating all raw materials in contact with soil. In France, B. cereus is considered as the fourth causative agent of foodborne illness. To be pathogenic, B. cereus should multiply during the various stages of food processing and particularly during preservation at low temperature. The aim of this study was to study molecular mechanisms of the adaptive response at low temperature and more precisely the involvement of the B. cereus ATCC 14579 RNA helicases. The cshA gene encoding a putative RNA helicase was identified by a random mutagenesis approach, as playing a major role in cold adaptation of B. cereus. The ATCC 14579 strain possesses 5 genes encoding putative RNA helicases, cshA to cshE, which were all strongly overexpressed at 10°C versus 37°C, whatever the growth stage. The simple deletion of cshA, cshB, and cshC lead to a cold-sensitive phenotype, resulting in an inability to adapt at 10 °C compared to the wild type strain, associated to a huge modification of cell morphology. In addition, CshA, CshB and CshC have a temperature range where their action is decisive. The role of these three RNA helicases also appears to be important in adaptation to oxidative and basic stresses while CshD and E did not appear to be involved in the adaptation to the tested stresses. The RNA helicase CshA has the most important role in adaptation to cold. We demonstrated that CshA is essential at low temperature to allow the maintenance of ribosome stability. CshA interacts directly with ribosomes, and also regulate rRNA degradation. The identification of protein partners that interact with CshA suggests that it could be involve in a complex of RNA decay

La synthèse d’un ARNm eucaryotique dépend d’une suite d’étapes qui inclut notamment l’ajout d’une queue poly(A) à son extrémité 3’. Au noyau, la queue poly(A) des ARNms est liée par PABPN1 (poly(A)-binding protein nuclear 1). PABPN1 fut notamment caractérisée, d’après des études in vitro, pour stimuler la réaction de polyadénylation en plus de contrôler la taille ultime des queues poly(A). Cela dit, la ou les fonction(s) biologique(s) de PABPN1 est/sont cependant largement méconnue(s). Chez Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pab2 est l’orthologue présumé de PABPN1. Or, mes travaux indiquent que Pab2 est fonctionnellement différente de PABPN1 à l’égard de son rôle sur le processus général de polyadénylation. Ainsi, in vivo, l’absence de Pab2 entraîne l’expression et l’accumulation d’un groupe limité d’ARNs hyperadénylés parmi lesquels se trouvent de nombreux petits ARNs nucléolaires non-codants (snoRNAs) lesquels constituent normalement un groupe abondant d’ARN poly(A)-. Mes résultats supportent ainsi un mécanisme par lequel des snoRNAs immatures poly(A)+, sont convertis en une forme mature poly(A)- par le biais de Pab2 et de l’activité 3’-->5’ exoribonucléase de l’exosome à ARN. Ces observations sont inusitées dans la mesure où elles associent une fonction pour une PABP dans la maturation d'ARNs non-codants, contrairement à la notion que les PABPs travaillent exclusivement au niveau des ARNms, en plus de procurer une nouvelle perspective face au mécanisme de recrutement de l'exosome à ARN à des substrats poly(A)+. La formation de l’extrémité 3’ d’un ARN est un processus étroitement lié à la terminaison de sa transcription. Pour les gènes codants, la terminaison transcriptionnelle est initiée par le clivage endonucléolytique du pré-ARNm. Ce clivage génère une extrémité d’ARN 5’ libre laquelle sera ciblée par une exoribonucléase 5'-->3’ afin de mener à bien l’éviction de l’ARNPII de la matrice d’ADN (terminaison transcriptionnelle de type torpedo). Au contraire, chez Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), la majorité des gènes non-codants, incluant les snoRNAs, dépendent plutôt du complexe NNS (Nrd1/Nab3/Sen1) pour la terminaison de leur transcription. Cela dit, il est incertain si le complexe NNS est conservé chez d’autres espèces. À cet égard, mes travaux indiquent que S. pombe est dépourvu d’un mécanisme de terminaison de la transcription de type NNS. Seb1, l’orthologue présumé de Nrd1 chez S. pombe, s’associe plutôt à la machinerie de clivage et de polyadénylation et influence la sélection de site de polyadénylation à l’échelle du génome. Mes résultats supportent ainsi l’utilisation de la machinerie de maturation 3’ des ARNms comme principal vecteur de terminaison transcriptionnelle chez S. pombe et identifient Seb1 comme un facteur clé de ce processus. L’évènement transcriptionnel étant hautement complexe, des erreurs peuvent arriver de manière stochastique menant à l’accumulation d’ARNs aberrants potentiellement néfastes pour la cellule. Or, mes travaux ont mis en lumière un mécanisme de surveillance co-transcriptionnel des ARNs impliquant l’exosome à ARN et lié à la terminaison de la transcription. Pour ce faire, l’exosome à ARN promeut la terminaison transcriptionnelle via la dégradation d’une extrémité 3’ libre d’ARN devenue émergente suite au recul de l’ARNPII le long de la matrice d’ADN (phénomène de backtracking). Mes résultats supportent ainsi une terminaison de la transcription de type torpedo inversé (3'-->5’) réévaluant par la même occasion le concept voulant que la terminaison de la transcription s’effectue uniquement selon une orientation 5’-->3’. Somme toute, mes travaux de doctorat auront permis d’identifier et de caractériser plus en détail les facteurs et mécanismes impliqués dans la maturation 3’ et la terminaison de la transcription des gènes codants et non-codants chez l’organisme modèle S. pombe.