Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN qui synthétise ses nouveaux génomes dans les cellules hôtes infectées grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), appelée NS5B. Cette polymérase a été pendant longtemps une cible majeure dans la recherche d'antiviraux contre l'hépatite C. Aujourd'hui, de nombreux antiviraux ont été approuvés dans le traitement de l’hépatite C ciblant différentes protéines virales, entre autre, NS5B. Le sofosbuvir qui cible le site actif de NS5B est un antiviral qui a démontré une efficacité extraordinaire dans le traitement anti-HCV.Durant ces dernières années, les recherches sur NS5B ont permis de caractériser cette protéine, à la fois structuralement et biochimiquement. La richesse des connaissances ainsi accumulées fait de NS5B un excellent modèle pour les RdRp des virus à ARN.Toutefois, peu d'études portent sur le mécanisme d’acheminement et de sélection des ribonucléotides au site actif de NS5B, et de façon générale, sur la description atomique du mécanisme de réplication assuré par NS5B, qui implique deux dications magnésium pour la catalyse comme chez toutes les polymérases de cette famille.Durant ce travail, nous avons exploité les données structurales issues de complexes ternaires (NS5B+RNA+nucleotide) obtenus en 2015 par cristallographie à l'échelle atomique. Nous avons utilisé ces structures pour mener des études de modélisation moléculaire, essentiellement par dynamique moléculaire afin d’aborder la question de l'acheminement des nucléotides vers le site actif de NS5B.Nous avons eu recours à la fois à des méthodes de dynamiques moléculaires classiques et des méthodes de dynamiques moléculaires dites biaisées telles que différentes méthodes de dynamiques moléculaires dirigées (SMD et TMD) et la dynamique moléculaire accélérée (aMD).Nos résultats indiquent que l’acheminement du nucléotide au site actif associé à un magnésium Mg(B) est contrôlé tout au long du tunnel par différents éléments de NS5B. Initialement, le nucléotide se lie à une région proche de la boucle qui surplombe le tunnel lui permettant, grâce aux interactions qu’il établit avec sa partie triphosphate, de s’orienter base en avant. Ensuite, le nucléotide atteint un point de contrôle formé essentiellement par le motif F3 (R158) et le motif F1(E143). Le nucléotide reste lié à ce site jusqu’à l’arrivée du second dication magnésium (Mg(A)) qui provoque des réarrangements structuraux, notamment au niveau du motif F3, entrainant l’avancée du nucléotide vers le site actif. Une fois ce point de contrôle passé, le nucléotide interroge alors la base du brin d’ADN matrice sans s’insérer entièrement dans le site actif.Nos simulations ont clairement établi que les dernières étapes d’entrée du nucléotide sont finement régulées par l’arrivée du second dication magnésium qui a donc un rôle de coordinateur en plus de son rôle connu dans la catalyse.Ce mécanisme d’entrée semble être spécifique aux RdRp virales et permet de comprendre pourquoi les analogues de nucléotides peuvent être aussi efficaces contre les virus à ARN. / The hepatitis C virus is an RNA virus that synthesises its new genomes in the infected host cells thanks to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) termed NS5B. This polymerase has been a prime target for antiviral therapy. Numerous direct antiviral drugs are now approved in the HCV treatment and allow very high rates of treatment success. These drugs target among others the HCV NS5B RdRp with the sofosbuvir being one of the most successful drugs.Tremendous efforts have been made in the past decades to characterize NS5B, in particular structurally and biochemically. However, there is little information about the molecular mechanisms of NS5B ribonucleotides entry and selection and in general on the atomistic details of the RNA replication mechanism, although the involvement of two magnesium dications in catalysis is well established in this family of polymerases. Since 2015, structures of ternary complexes of NS5B have been resolved by crystallography offering very valuable details about the binding of nucleotides at the NS5B active site.In this work, we took advantage of these structural data to address the ribonucleotides entry and to further explore the nucleotide addition cycle in NS5B using molecular modelling and molecular dynamics simulations. We used both conventional molecular dynamics techniques and biased simulations that enhance sampling such as Steered Molecular Dynamics (SMD), Targeted Molecular Dynamics (TMD) or accelerated Molecular dynamics (aMD).Based on our modelling results, we found that the access to the active site through the nucleotides tunnel is checked by successive NS5B elements. First, the entering ribonucleotide together with an associated magnesium Mg(B) binds next to a loop that overhangs the nucleotide tunnel and interactions with its triphosphate moiety orient it base-first towards the active site. Second, the ribonucleotide encounters a checkpoint constituted by the residues of motif F3(R158) and motif F1(E143) where it is blocked until the arrival of a second magnesium ion, the Mg(A). This allowed the motif F3 to undergo small structural rearrangements leading to the advancement of the nucleotide towards the active site to interrogate the RNA template base prior to the complete nucleotide insertion into the active site.Our simulations pointed out that these dynamics are finely regulated by the second magnesium dication, thus coordinating the entry of the correct magnesium-bound nucleotide with shuttling of the second magnesium necessary for the two-metal ion catalysis. This entry mechanism is specific to viral RdRps and may explain why modified ribonucleotides can be so successful as drugs against RNA viruses.

Les ARN polymérases sont des acteurs indispensables de la transcription. Chez les eucaryotes il existe trois ARN polymérases (I, II et III). La ARN polymérase III (Pol III) possède 17 sous-unités, dont une qui existe sous deux formes: RPC32α et RPC32β. Seulement une des deux formes peut être intégrée dans la Pol III, créant ainsi deux polymérases différentes Pol IIIα et Pol IIIβ. Alors que RPC32β est présent dans les cellules somatiques, RPC32α est exprimé surtout dans des cellules souches et des cellules tumorales. Aujourd’hui rien n’est connu sur leurs rôles respectifs. Le cancer du sein est un problème majeur de santé publique car c’est le cancer féminin le plus fréquent. Plusieurs types de cancer du sein sont identifiés selon la présence ou absence de certains récepteurs hormonaux. Des cancers qui testent négative pour le récepteur d’oestrogène et de progestérone et qui ne surexpriment pas le récepteur pour les facteurs de croissance épidermiques humains 2 (HER2) sont appelés triple-négative. Ils ont un pronostique peu favorable, due à l’agressivité de ce type de cancer et un manque de thérapie cibles. Pour étudier le rôle de RPC32α il fallait identifier un model tumorale. En collaboration avec Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) une étude transcriptomique a été fait sur 2627 échantillons cliniques de tissus de sein. L’étude montre que RPC32α est surexprimé dans les cancers triple-négative, alors que son homologue RPC32β est surexprimé dans les tissues normaux. Une analyse sur six lignées de cancer du sein et une ligné non-tumorale ont pu confirmer les résultats de l’analyse transcriptomique. Le modèle de cancer du sein a donc été validé. Une caractérisation des différentes lignées de cancer du sein a démontré que d’autres sousunités de la Pol III n’étaient pas surexprimées dans les cancers triple-négative. La surexpression de RPC32α n’était donc pas une conséquence d’une hyperactivité de la Pol III. Une analyse des transcrits synthétisé par la Pol III a montré que en générale les transcrits de la Pol III étaient plus fortement exprimé dans les cancers triple-négative que dans d’autres cancers. Afin d’étudier l’implication de RPC32α dans les phénomènes de tumorisation, plusieurs lignées cellulaires dépourvues de RPC32alpha ont été créé utilisant la technique CRISPRCAS9. L’absence de RPC32α n’a pas induit une augmentation de transcription ni de l’ARN de 4 RPC32α, ni de celle de RPC32β. Il n’existe donc pas de boucle de rétroaction pour RPC32α et les deux homologues ne sont pas co-régulés. Plusieurs, mais pas tous les transcrits synthétisé par la Pol III ont une expression fortement baissé dans les lignées mutants. Le fait que pas tous les transcrits ne soit affectés par la perte de RPC32α, indique qu’il existe une spécificité de transcription pour Pol IIIα et Pol IIIβ. Les cellules des linges mutants ne présentaient pas de phénotype différent des cellules mères et la croissance était la même dans toutes les lignées. Par contre les tests de croissance en agar-mou ont révélé que les lignées mutants formaient 85% de moins de colonies, indiquant que RPC32α est nécessaire pour la croissance tumorigénique in vitro. Pour tester l’effet de la perte de RPC32α sur la croissance tumorigénique in vivo, des cellules mutants et des cellules mères ont été injecté dans des souris. Les souris greffées avec des cellules mutantes montrent un départ de tumorisation retardé. Au bout de six semaines elles avaient de tumeurs deux fois plus petit que les souris avec des cellules mères. Après ablation de la tumeur primaire, les souris ont été surveillées pour l’apparition de métastases. Quatre semaines plus tard les souris greffées avec des cellules mutantes avaient 100 fois moins de métastases que les souris contrôles. Ces résultats montrent que RPC32α est nécessaire pour la tumorisation in vitro et in vivo. La protéine semble surtout jouer un rôle dans la formation des métastases, qui sont un des problèmes majeurs dans le traitement des cancers. / The RNA polymerases are key players of transcription. Eukaryotes have three RNA polymerases (I, II and III). The RNA polymerase III (Pol III) has 17 subunits, one of which exists in two alternative forms: RPC32α and RPC32β. Only one of the two forms can be integrated into the enzymes, thus generating either Pol IIIα or Pol IIIβ. While RPC32β is found in all somatic cells, RPC32α is expressed in stem cells and tumor cells. To date nothing is known of their respective roles. Breast cancer is one of the major public health problems, as it is the most common cancer in women. Several types of breast cancers are distinguished, according to the presence or absence of hormonal receptors. Cancers that test negative for estrogen receptors, progesterone receptors and that do not overexpress the human epidermal growth factor receptor 2, are called triple-negative breast cancers. They tend to have a poor prognosis, due to the aggressive nature of the cancer and the lack of targeted therapies. To study the role of RPC32α, a tumor model needed to be identified. In collaboration with Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) a transcriptomic study was performed on 2627 clinical breast tissue samples. The study showed that RPC32α was overexpressed in triplenegative breast cancer, whereas RPC32β was overexpressed in normal tissue. A study on six breast cancer cell lines and one non-tumorigenic line confirmed the results of the transcriptomic study. The breast cancer model was thus validated. A characterization of different breast cancer cell lines showed that other Pol III subunits were not overexpressed in triple-negative breast cancer. The overexpression of RPC32α was therefore not a mere consequence of a Pol III hyperactivity. An analysis of the transcripts synthesized by Pol III showed that overall the Pol III transcript levels were elevated in triplenegative breast cancer compared to other breast cancer subtypes. In order to study the role of RPC32α in tumorigenesis, several RPC32α knock-out cell lines were created using CRISPR-Cas9. The loss of RPC32α did not induce an increase in transcription of the RNAs of RPC32α or RPC32β. This shows that no feed-back loop exists for RPC32α and that the two homologues are not co-regulated. Various Pol III transcripts showed decreased expression levels in the knock-out cell lines. Yet not all transcripts were reduced in the absence of RPC32α. This indicates that some sort of transcription specificity must exist for Pol IIIα and Pol IIIβ. The knock-out cell lines did not show any alterations in their phenotype or growth rates. However, in soft agar assays the knock-out cell lines produced 85% less colonies than the mother cell line. This proves that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro. To find out if RPC32α was also necessary for tumorigenic growth in vivo, knock-out and wild type cells were injected into mice. The mice grafted with knock-out cells showed a slowed onset of tumor growth. After six weeks, the mice injected with knock-out cells had tumors half the size of the mice injected with wild type cells. The primary tumor was ablated and mice were tracked for metastasis. Four weeks later, mice injected with RPC32α knock-out cells had 100 times less metastasis than the control group. These results show that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro and in vivo. The protein seems also to be implicated in the formation of metastasis, which are one of the greatest problems in cancer treatment today.

Tesis por compendio / [ES] Los viroides son los patógenos con replicación autónoma más simples y sólo se han encontrado de forma natural infectando plantas superiores. Desde que se descubrieron en los años setenta, se ha adquirido un conocimiento considerable sobre su naturaleza y mecanismos de replicación en las plantas huésped. Sin embargo, aún quedan por descubrir muchos aspectos de la biología de los viroides. Por lo tanto, un conocimiento más profundo de la naturaleza y el modo de acción de los viroides han sido los objetivos principales que engloban esta tesis. Para ello, es esencial contar con procedimientos sencillos y eficientes para la obtención de clones de ADNc infecciosos. Se desarrolló un nuevo método eficiente para construir clones de viroides infecciosos y se probó con un viroide de cada familia: El viroide latente de la berenjena (ELVd, Avsunviroidae) y el viroide del lúpulo (HSVd, Pospiviroidae). Esta aproximación se basó en enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera del sitio de reconocimiento y supone un procedimiento universal para obtener clones infecciosos de un viroide independientemente de su secuencia, con una alta eficiencia. A pesar de que los viroides han sido considerados como ARN no codificantes desde su descubrimiento, nuestro análisis computacional predijo pequeños marcos de lectura abiertos en cada uno de los genomas de HSVd y ELVd. No se encontraron similitudes significativas con las proteínas de la base de datos de plantas superiores, pero algunos de estos péptidos predichos estaban altamente conservados entre todas las variantes de HSVd y ELVd. Curiosamente, la fusión de estas secuencias conservadas con una proteína fluorescente reveló una localización subcelular específica en el correspondiente orgánulo donde tiene lugar la replicación/acumulación para cada viroide: nucleolo y cloroplasto para HSVd y ELVd, respectivamente. Las mutaciones que truncan el dominio nucleolar de HSVd fueron perjudiciales para el viroide, mientras que el truncamiento de cualquiera de los dos ORF de ELVd que contiene una señal de localización al cloroplasto también disminuyó (pero en menor medida) la eficiencia biológica del viroide, tal vez debido a la redundancia funcional. Se encontraron formas circulares de los ARN de HSVd y ELVd en fracciones polisómicas, lo que revela su interacción física con la maquinaria de traducción de la célula vegetal. En conjunto, estas observaciones experimentales indican que no se puede descartar la capacidad de codificación de los viroides, aunque la prueba definitiva (la detección de los péptidos codificados por los circRNAs) es un reto tecnológico que deberá abordarse en futuras líneas de investigación. Finalmente, para estudiar qué cambios se producen en el huésped durante la infección con un viroide sintomático, se realizó un análisis integrador de las alteraciones genómicas de plantas de pepino infectadas con HSVd. Se integraron los transcriptomas, el sRNAnomas y el metilomas para determinar la respuesta temporal a la infección por el viroide. Nuestros resultados apoyan que el HSVd promueve el rediseño de las vías reguladoras del pepino afectando predominantemente a capas reguladoras específicas en diferentes fases de la infección. La respuesta inicial se caracterizó por una reconfiguración del transcriptoma del hospedador mediante el uso diferencial de exones, seguido de una predominante regulación a la baja de la actividad transcripcional modulada por los cambios epigenéticos del hospedador asociados a la infección y caracterizada por un aumento de la hipermetilación. Las alteraciones en el metabolismo de los ARN pequeños y microARNs del huésped fueron marginales y se produjeron principalmente en la fase tardía. En general, estos datos constituyen el primer mapa exhaustivo de las respuestas de la planta a la infección de un viroide. / [CA] Els viroids són els patògenes més simples amb replicació autònoma i només s'han identificat de forma natural infectant a plantes superiors. Des que es descobriren als anys setanta, s'ha adquirit un coneixement considerable sobre la seua natura i els mecanismes de replicació en plantes hoste. No obstant, encara queden per descobrir molts aspectes de la biologia dels viroids. Per tant, un coneixement més profund de la natura i el mode d'acció dels viroids han sigut els objectius principals que engloben aquesta tesi. Per a això, és essencial la disponibilitat de procediments senzills i eficients per a l'obtenció de clones infecciosos. Es va desenvolupar un nou mètode eficient per a construir clones infecciosos y es fa provar amb un viroid de cada família: el viroide latent de la albergínia (ELVd, Avsunviroidae) y el viroid del llúpol (HSVd, Pospiviroidae). Aquesta aproximació es basà en enzims de restricció de tipus IIS que tallen fora del lloc de reconeixement i suposa un procediment universal per obtenir clones infecciosos de un viroid independentment de la seua seqüencia amb una elevada eficiència. Tot i que els viroids s'han considerat com ARNs no codificants des del seu descobriment, el nostre anàlisi computacional va predir xicotets ORF als genomes de HSVd y ELVd. No es trobaren similituds significatives amb proteïnes depositades a les bases de dades, però alguns d'aquest pèptids estaven altament conservats a les variants de HSVd y ELVd. Curiosament, la fusió d'aquestes seqüencies conservades amb una proteïna fluorescent revelà una localització subcel·lular especifica al orgànul on te lloc la replicació/acumulació de cada viroid: nuclèol i cloroplast per a HSVd i ELVd, respectivament. Les mutacions que trunquen el domini nucleolar de HSVd foren perjudicials per al viroid, mentre que el truncament de qualsevol de les dos ORF de ELVd que contenen una senyal de localització al cloroplast també va disminuir (però en menor mesura) l'eficiència biològica del viroid, el que pot ser degut a una redundància funcional. Es detectaren formes d'ARN circular de HSVd i ELVd a les fraccions polisòmiques, el que revela la seua interacció física amb la maquinaria de traducció cel·lular. En conjunt, aquestes observacions experimentals indiquen que no es pot descartar la capacitat codificants dels viroids, encara que la evidencia definitiva (la detecció del pèptids codificats per ARN circulars) es un repte tecnològic que s'haurà d'adreçar en línies d'investigació futures. Finalment, per tal d'estudiar que canvis es produeixen a l'hoste durant la infecció amb un viroid simptomàtic, es va realitzar un anàlisi integrador de les alteracions genòmiques de les plantes de cogombre infectades amb HSVd. S'integraren els transcriptomes, sARNomes i metilomes per determinar la resposta temporal a la infecció per viroid. Els resultats obtinguts suporten que HSVd promou un redisseny de les vies reguladores de cogombre afectant predominantment a nivells reguladors específics a les diferents etapes de la infecció. La resposta inicial es caracteritzà per una reconfiguració del transcriptoma de l'hoste mitjançant l'ús diferencial d'exons, seguit d'una repressió transcripticional modulada per canvis epigenètics de l'hoste caracteritzats per una major hipermetilació. Les alteracions al metabolisme de ARN xicotets i microARNs de l'hoste van ser marginals i es produïren principalment al final de la infecció. En general, aquestes dades constitueixen el primer mapa exhaustiu de les respostes de la planta a la infecció per un viroid. / [EN] Viroids are the simplest pathogens with autonomous replication and have only been found naturally infecting higher plants. Since viroids were discovered in the seventies, we have gained considerable knowledge about their nature and replication mechanisms in host plants. However, many aspects of viroid biology are yet to be discovered. Therefore, a deeper understanding of the nature and mode of action of viroids have been the encompassing main goals of this thesis. For this purpose, simple and efficient procedures for obtaining infectious cDNA clones are essential. A new efficient method for constructing infectious viroid clones was developed and tested with one viroid of each family: eggplant latent viroid (ELVd, Avsunviroidae) and hop stunt viroid (HSVd, Pospiviroidae). This procedure was based on type IIS restrictions enzymes that cut outside of the recognition site and supposes a universal procedure for obtaining infectious clones of a viroid independently of its sequence, with a high efficiency. Despite viroids have been considered as plant-pathogenic non-coding RNAs since their discovery, our computational analysis predicted small open reading frames in each of the HSVd and ELVd genomes. No significant similarities with proteins in the database of higher plants were found, but some of these predicted peptides were highly conserved among all HSVd and ELVd variants. Interestingly, the fusion of these conserved sequences to a fluorescent protein revealed a specific subcellular localization in the corresponding organelle where replication/accumulation takes place for each viroid: nucleolus and chloroplast for HSVd and ELVd, respectively. Mutations that truncate the nucleolar domain of HSVd were detrimental for the viroid while truncating any of the two ELVd ORF that contains a chloroplast transit signal also diminished (but to a lesser extent) viroid biological efficiency, maybe because of functional redundancy. Circular forms of both, HSVd and ELVd RNAs were found in polysome fractions, revealing their physical interaction with the translational machinery of the plant cell. Altogether, these experimental observations indicate that the coding capacity of viroids cannot be ruled out, although the definitive evidence (detection of the circRNA-encoded peptides) is a technological challenge to be addressed in future research lines. Finally, to study the host changes that are produced during a symptomatic viroid infection, an integrative analysis of the timing and intensity of the genome-wide alterations in cucumber plants infected with HSVd was performed. Differential host transcriptome, sRNAnome and methylome were integrated to determine the temporal response to viroid-infection. Our results support that HSVd promotes the redesign of the cucumber regulatory-pathways predominantly affecting specific regulatory layers at different infection-phases. The initial response was characterized by a reconfiguration of the host-transcriptome by differential exon usage, followed by a predominant down-regulation of the transcriptional activity modulated by the host epigenetic changes associated to infection and characterized by increased hypermethylation. The alterations in host sRNA and microRNA metabolism were marginal and mainly occurred at the late stage. Overall, these data constitute the first comprehensive map of the plant responses to a viroid infection. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación del doctorando como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2017/114) y unas estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEFPI/2020). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [BIO2017-88321-R y AGL2016-79825-R] . / Márquez Molins, J. (2022). Novel Insights of Viroid Biology and Host Responses to Their Infection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183479 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitro. / DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production.

Tesis por compendio / [ES] La evolución experimental nos permite comprobar postulados teóricos y realizar observaciones que ayuden a incrementar nuestro conocimiento sobre la evolución. Este trabajo tiene como objetivo estudiar la evolución de los virus utilizando enfoques experimentales. Los virus muestran una alta capacidad de evolución, lo que los convierte en modelos perfectos para abordar cuestiones evolutivas con bastante rapidez. Los procesos subyacentes a la evolución y adaptación de los patógenos se rigen por muchos factores: desde la naturaleza intrínseca del virus hasta componentes ambientales que afectan al hospedador, al patógeno y la interacción entre ambos. En esta tesis utilizamos un patosistema formado por una planta y un potyvirus (virus de (+)ssRNA) para explorar cómo diferentes factores bióticos y abióticos modulan la evolución del virus. Primero, exploramos los efectos biológicos de las mutaciones en una proteína del potyvirus, la cual es un componente esencial del complejo de replicación viral. Revelamos las limitaciones evolutivas que operan sobre esta proteína, y que son consecuencia de un equilibrio evolutiva entre la acumulación dentro del huésped y la gravedad de los síntomas. En segundo lugar, examinamos los efectos de la estructura genética de la población del huésped sobre la evolución del virus: evolucionamos virus en poblaciones genéticamente homogéneas de plantas con diferentes susceptibilidades a la infección y en una población heterogénea. Con este trabajo ilustramos cómo la diversidad genética de huéspedes en un ecosistema afecta la adaptación del virus, ya que los virus se especializaron más rápidamente en poblaciones homogéneas pero fueron más patógenos en poblaciones heterogéneas. Finalmente, estudiamos el impacto del ambiente sobre la interacción virus-planta. Para esta parte, primero revisamos los posibles efectos beneficiosos de la infección por virus en ciertos entornos hostiles para la planta. Posteriormente estudiamos el efecto de la sequía, una condición ambiental con una incidencia cada vez mayor y que se sabe afecta la fisiología del huésped. Por lo tanto, evolucionamos un virus en huéspedes bajo condiciones de sequía o de riego abundante. Los virus adaptados en condiciones de sequía conferían una mayor tolerancia a la sequía a la planta huésped a través de alteraciones específicas en la expresión génica del huésped y la señalización hormonal. En general, esta tesis contribuye al aumento del conocimiento en biología evolutiva de los virus de ARN de plantas. / [CA] L'evolució experimental ens permet comprovar postulats teòrics i realitzar observacions que ajuden a incrementar el nostre coneixement sobre l'evolució. Aquest treball té com a objectiu estudiar l'evolució dels virus utilitzant enfocaments experimentals. Els virus mostren una alta capacitat d'evolució, la qual cosa els converteix en models perfectes per a abordar qüestions evolutives amb bastant rapidesa. Els processos subjacents a l'evolució i adaptació dels patògens es regeixen per molts factors: des de la naturalesa intrínseca del virus fins a components ambientals que afecten l'hoste, al patogen i la interacció entre tots dos. En aquesta tesi utilitzem un patosistema format per una planta i un potyvirus (virus de (+)ssRNA) per a explorar com diferents factors biòtics i abiòtics modulen l'evolució del virus. Primer, explorem els efectes biològics de les mutacions en una proteïna del potyvirus, la qual és un component essencial del complex de replicació viral. Revelem les limitacions evolutives que operen sobre aquesta proteïna, i que són conseqüència d'un equilibri evolutiva entre l'acumulació dins de l'hoste i la gravetat dels símptomes. En segon lloc, examinem els efectes de l'estructura genètica de la població de l'hoste sobre l'evolució del virus: evolucionem virus en poblacions genèticament homogènies de plantes amb diferents susceptibilitats a la infecció i en una població heterogènia. Amb aquest treball il·lustrem com la diversitat genètica d'hostes en un ecosistema afecta l'adaptació del virus, ja que els virus es van especialitzar més ràpidament en poblacions homogènies però van ser més patògens en poblacions heterogènies. Finalment, estudiem l'impacte de l'ambient sobre la interacció virus-planta. Per a aquesta part, primer revisem els possibles efectes beneficiosos de la infecció per virus en uns certs entorns hostils per a la planta. Posteriorment estudiem l'efecte de la sequera, una condició ambiental amb una incidència cada vegada major i que se sap afecta la fisiologia de l'hoste. Per tant, evolucionem un virus en hostes sota condicions de sequera o de reg abundant. Els virus adaptats en condicions de sequera conferien una major tolerància a la sequera a la planta hoste a través d'alteracions específiques en l'expressió gènica de l'hoste i la senyalització hormonal. En general, aquesta tesi contribueix a l'augment del coneixement en biologia evolutiva dels virus d'ARN de plantes. / [EN] Experimental evolution allows us to test theoretical postulates and make observations that help increase our knowledge about Evolution. This work aims to use experimental approaches to study the evolution of viruses. Viruses have a high degree of evolvability, which makes them perfect subjects to address evolutionary questions quite rapidly. The underlying processes of pathogen evolution are governed by many factors. These factors can be affecting the virus adaptation at different levels: from the intrinsic virus nature to environmental factors affecting the host, the pathogen and the interaction between both. In this thesis, we used a pathosystem formed by a plant and a potyvirus (+ssRNA virus). Using this pathosystem we have explored how different factors modulate the virus evolution. First, we explored the biological effects of mutations in a potyvirus protein that is an essential component of the virus replication complex. We unveiled the evolutionary constraints on this viral protein, with an evolutionary tradeoff between within-host accumulation and severity of symptoms. Second, we examined the effects of the host population genetic structure on virus evolution: we evolved viruses in homogeneous populations of plants with different viral susceptibilities and in a heterogeneous population. With this work we illustrated how the genetic diversity of hosts in an ecosystem affects virus adaptation, as viruses specialized faster in homogeneous populations but were more pathogenic in heterogeneous ones. Finally, we studied the impact of the environment. For this part we first reviewed the possible beneficial effects of virus infection under certain environments. Afterwards we studied the effect of drought, an environmental condition with a predicted increased incidence and known to affect the host physiology. Therefore, we evolved a virus in host under either well-watered or drought conditions. The viruses adapted under drought conditions conferred an increased drought tolerance to the host plant through specific alterations in host gene expression and hormonal signaling. Overall, this thesis contributed to the increase in knowledge in evolutionary biology of plant RNA viruses. / González Miguélez, R. (2021). Virus Adaptation at Different Levels: Study on the Evolutionary Effects of Mutations, Host Population Genetic Structure and Environmental Factors in Potyviruses [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178154 / TESIS / Compendio

Les stéroïdes sont des composés exerçant une action hormonale variée et très importante au sein de l'organisme. Les mécanismes de synthèse, d'action et de régulation des stéroïdes ont été le sujet de nombreuses études depuis plus de cent ans et pourtant il reste encore beaucoup à découvrir au gré des avancements de la recherche. L'inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse des stéroïdes est une technique fréquemment utilisée afin de clarifier le rôle de l'enzyme au sein de la stéroïdogénèse. Les inhibiteurs sont souvent utilisés dans ce but. Les récentes découvertes sur TARN interférence ont permis d'ajouter les siRNAs comme arsenal pour inhiber la synthèse de l'enzyme. Dans cette thèse, trois volets sont abordés, soit la mise au point d'une méthode d'inhibition des enzymes de la stéroïdogénèse basée sur le principe d'ARN interférence, l'analyse des voies de biosynthèse des estrogènes et des androgènes et la régulation des enzymes responsable de la synthèse des stéroïdes sexuels par microARN. Le premier volet comprend une analyse de trois techniques différentes d'inhibition par ARN interférence et un article contenant un résumé de la construction d'un vecteur shRNA qui a permis d'inhiber l'activité de l'enzyme 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase/[delta]5-[delta]4-isomérase humaine de type 1. Le deuxième volet décrit la caractérisation de la voie de biosynthèse de 1'estradiol en utilisant les cellules du choriocarcinome placentaire, JEG-3 comme modèle. Il décrit également la caractérisation de la voie de biosynthèse des androgènes en utilisant les cellules de sébocyte immortalisé, SZ-95 et les cellules du cancer de la prostate DU-145 comme modèle. Le troisième volet de la thèse présente une étude de l'inhibition de l'expression de l'enzyme PSDR1 par le microARN hsa-miR-449a. Grâce à ces études, nous avons pu démontrer que contrairement à ce qui est décrit dans la littérature, la formation de la testosterone dans les voies de biosynthèse des stéroïdes sexuels actifs dans les tissus périphériques n'est pas essentielle. Nous avons également démontré que l'expression de PSDR1, une enzyme potentiellement impliquée m dans la biosynthèse du DHT, serait modulée par un mécanisme de régulation encore peu connu, les microARNs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les ARN produits chez la bactérie Escherichia coli sont généralement amenés vers deux voies distinctes. Le plus souvent, l' ARN naissant se dissocie de la matrice, durant sa synthèse, afin d'être fonctionnel. Celui-ci peut alors servir de matrice pour les ribosomes qui le traduisent en polypeptides, ou alors il peut servir de matériau de structure dans la composition des ribosomes. Le second type de transcrit trouve son utilité lorsque l' ARN demeure attaché à la matrice ADN afin d'amorcer la réplication. Ce type d' ARN est très court et il est immédiatement utilisé comme amorce par la polymérase ADN de la cellule. Récemment, il a été démontré que les hybrides ARN­ADN peuvent aussi être impliqués dans la recombinaison. Plusieurs travaux menés sur la formation de ces structures hybrides indiquent que celle-ci dépend généralement du surenroulement de l' ADN et de certains paramètres de transcription. La formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription démontre bien que la compréhension des mécanismes de transcription serait évidemment incomplète sans y inclure la topologie de l' ADN. L'étude de la transcription révèle un mécanisme dynamique très complexe, finement régulé à plusieurs niveaux, tant à l'initiation, l'élongation, que la terminaison. La topologie de l' ADN, ainsi que les topoisomérases ADN ont été caractérisées comme des modulateurs importants dans toutes les étapes de l'expression génique, allant de la reconnaissance spécifique des promoteurs jusqu'au déplacement de l' ARN naissant ou de son attachement à la matrice ADN. De plus, la transcription est l'évènement génétique le plus fréquent dans une cellule. Selon le travail présenté ici, un des rôles essentiels de la topoisomérase I semble être l'inhibition de la formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription chez Escherichia coli. Ceux-ci semblent survenir principalement au niveau des opérons ribosomaux. Le couplage entre la traduction et la transcription, chez les ARNm, aide à prévenir la formation d'hybrides ARN-ADN. La croissance à basse température favorise l'appariement de l' ARN à l' ADN. La suite des travaux décrits propose que le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli n'est pas la relaxation du surenroulement global de l' ADN, mais plutôt l'élimination du surenroulement local généré durant la transcription. Ce surenroulement semble responsable de l'initiation de la formation de structures hybrides ARN-ADN, alors que la gyrase provoquerait leur élongation. Ces observations permettent de suggérer de nouveaux rôles pour la topoisomérase I et la gyrase chez les bactéries.

Les organismes unicellulaires sont très vulnérables aux changements rapides de leur environnement puisqu’ils sont en contact direct avec celui-ci. Les organismes unicellulaires utilisent plusieurs stratagèmes pour réguler l’expression génique et par conséquent, les diverses voies métaboliques nécessaires aux différentes conditions environnementales auxquelles ils sont confrontés. On sait maintenant que certains ARN, dont les riborégulateurs, ont également un grand rôle à jouer dans les processus de régulation de l’expression du génome. En général, les riborégulateurs sont des éléments génétiques situés dans les régions 5’ non traduites (5’ UTR) de l’ARN messager bactérien. Ces éléments possèdent une structure tertiaire bien définie qui est conservée à travers l'évolution. Les riborégulateurs subissent un changement de conformation en s’associant à un ligand spécifique et modulent l’expression des gènes qu’ils contrôlent en aval. Le rôle des riborégulateurs en relation avec le métabolisme des eubactéries peut être d’une grande importance. C’est le cas de Clostridium difficile qui voit son génome régulé par au moins une quarantaine de riborégulateurs. Étant un pathogène nosocomial, causant des infections contractées dans le milieu hospitalier, bien connu pour engendrer des complications au niveau de l’intestin, il est intéressant d’étudier la relation gène-riborégulateur-métabolisme chez C. difficile. De plus, les riborégulateurs ont montré un potentiel intéressant comme cible antibiotique pour combattre certaines infections. C. difficile possède quatre riborégulateurs guanine transcriptionnels qui contrôlent quatre gènes intervenant dans la voie de biosynthèse de la guanosine monophosphate (GMP). Deux de ces gènes interviennent directement dans la voie de synthèse du GMP soit une guanosine-monophosphate synthase (guaA) et une xanthine phosphoribosyltransférase (XPRTase) (xpt) ainsi que deux transporteurs de précurseur nommés CD630_21070 codant pour une perméase uracile/xanthine et CD630_ 27040 une perméase putative. Bien que quelques études ont démontré l’importance que pourrait avoir le gène guaA chez d’autres espèces bactériennes (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus suis et, Salmonella thyphimurium), aucune étude de C. difficile n'a élucidé la relation entre les quatre riborégulateurs guanine et les gènes qu’ils contrôlent, de même que leur rôle au sein du métabolisme du GMP dans un contexte in vivo. Le présent mémoire porte sur l’étude de ces quatre riborégulateurs guanine chez C. difficile, les gènes régulés par ces riborégulateurs et leurs effets sur la biologie de C. difficile. Une fois que les recherches bio-informatiques ont été entreprises, le projet s’est divisé en deux grandes parties soit l’efficacité de régulation des riborégulateurs guanine et l’importance des quatre gènes qui sont sous le contrôle de ces riborégulateurs chez C. difficile 630. Afin de vérifier si les riborégulateurs guanine avaient une affinité acceptable pour leur ligand (guanine), des essais de cartographies chimiques ont été faits et des Kd ont été déterminés. Ces Kd se retrouvent tous dans le bas nanomolaire (nM) de 2,61 ± 1,29 nM pour le riborégulateur guaA et des Kd de 1,78 ± 0,95 nM, de 3,06 ± 0,29 nM et de 4,44 ± 2,75 nM pour les riborégulateurs xpt, CD_21070 et CD_27040 respectivement. Pour la deuxième partie du projet, quatre mutants d’inactivation de gène par insertion ont été conçus grâce à l’utilisation du système ClosTron. Ces quatre mutants, correspondant aux gènes guaA, xpt, CD630_21070 et CD630_27040, ont ensuite été analysés lors d’essais de croissance afin de vérifier les phénotypes associés aux inactivations de gènes. À la suite des résultats d’essais de croissance des divers mutants d’inactivation, une emphase a été mise sur le gène guaA et son riborégulateur puisque ce dernier montrait un phénotype d’inhibition de croissance. L’efficacité avec laquelle le riborégulateur guaA pouvait réprimer l’expression génique a été déterminée lors des essais de gène rapporteur gusA et de PCR quantitative en temps réel. Une baisse de l’expression ligand-dépendante a été observée dans des conditions variant en concentration de guanine. Le mutant de délétion par inactivation du gène guaA a aussi démontré une baisse dans sa capacité d’infecter un modèle murin. En effet, lors d’une étude d’infection en compétition avec le type sauvage, les décomptes cellulaires du mutant guaA étaient diminués de 4 logs. Ces résultats indiquent un rôle fondamental du gène guaA sur le pouvoir infectieux de C. difficile 630 et mettent en évidence l’importance du riborégulateur qui contrôle l’expression de ce gène. Toutes les expériences faites dans le cadre du projet ont été entreprises chez C. difficile 630 afin de garder un contexte plus naturel au cours des analyses. Les résultats présentés ici mettent en évidence le potentiel des riborégulateurs comme cibles antibiotiques. Des travaux futurs devront être effectués afin de vérifier l’effet que pourraient avoir certains analogues de ligands qui ciblent les riborégulateurs guanine sur la viabilité de C. difficile.

Les endoribonucléases III sont conservées chez tous les eucaryotes. Ils jouent un rôle important dans le cycle de vie des acides ribonucléiques (ARN) que ce soit au niveau de leur maturation, leur régulation ou leur dégradation. Cependant, seul un petit nombre d'ARN ciblés par les ribonucléases (RNases) III sont connus et les motifs reconnus par l'enzyme sont encore mal caractérisés. Actuellement, la découverte de nouvelles cibles repose principalement sur la validation in vitro de gènes individuels. Il est important d'avoir une vue d'ensemble des cibles des RNases III pour comprendre le rôle de la dégradation spécifique des ARN dans le métabolisme cellulaire. Ainsi, cette thèse a comme objectif de développer des approches haut débit pour permettre une identification plus rapide des cibles tout en minimisant l'utilisation des ressources expérimentales. Elle présente l'utilisation combinée d'approches bio-informatiques, d'étude génétique de l'expression et de traitement in vitro dans le but d'avoir un portrait global des cibles de l'endoribonucléase III. Elle a aussi comme but d'identifier les motifs d'ARN non codants qui guident la reconnaissance par l'endoribonucléase III. Les principaux accomplissements de cette recherche sont : le développement de nouveaux algorithmes de prédiction des cibles de la RNase III, la détection de deux nouvelles classes de transcrits dont l'expression est dépendante de la RNase III, l'identification de quelques centaines de nouvelles cibles de la RNase III, la production d'un catalogue plus complet des motifs coupés par la RNase III et l'identification de nouvelles catégories de motifs coupées par la RNase III. Le tout procure un portrait global de l'impact de la RNase III sur le transcriptome et le cycle de vie des ARN. De plus, ce travail montre comment une approche intégrée incluant la recherche in silico, in vivo et in vitro permet de mieux comprendre le rôle d'un enzyme dans la cellule et comment chaque approche peut pallier les déficiences des autres approches et fournir globalement des résultats plus complets.

L'épissage alternatif des pré-ARN messagers est un mécanisme qui permet de générer une très grande diversité protéique chez les eucaryotes supérieurs. La sélection des sites d'épissage permet ainsi de produire certains isoformes protéiques plutôt que d'autres dans des conditions précises. Cette modulation implique généralement la participation d'une multitude de facteurs aux propriétés parfois synergiques et/ou antagonistes. Dans le cas du pré-ARN messager hnRNP A1, au moins trois éléments distincts renforcent l'exclusion de l'exon 7B. Par contre, l'élément intronique conservé de 38 nt (CE9) situé en aval de l'exon 7B permet la répression du site d'épissage 3', ce qui entraînerait l'inclusion de l'exon 7B. La portion 5' de l'élément CE9 est liée par la protéine SRp30c et cette interaction est importante pour permettre l'activité de CE9 in vitro. Afin de déterminer les composantes essentielles à l'activité de répression de SRp30c, des sites de liaison de haute affinité pour cette protéine ont été identifiés à l'aide de la procédure"SELEX". Les résultats obtenus indiquent que plusieurs sites de haute affinité reproduisent l'activité de l'élément CE9 complet dans un essai d'épissage où deux sites d'épissage 3' sont en compétition pour un seul site d'épissage 5'. De plus, les résultats suggèrent une contribution de la portion 3' de CE9, en plus de la partie 5', pour la liaison de la protéine SRp30c. En utilisant la séquence complète de CE9 pour effectuer une chromatographie d'affinité, la protéine hnRNP UPTB a été isolée et identifiée par spectrométrie de masse. Cependant, nous avons été surpris de constater que la protéine recombinante PTB agit comme activateur du site d'épissage 3' en diminuant l'activité de répression de CE9. Ces résultats suggèrent donc un nouveau rôle pour la protéine PTB, c'est-à-dire comme anti-répresseure de l'activité d'inhibition de SRp30c. PTB pourrait donc être un nouveau facteur capable de contrôler l'épissage alternatif du pré-ARN messager de hnfP A1.